全 文 ：降解有机氯农药的微生物菌株分离
筛选及应用效果 3
方　玲　(福建农业大学土地与环境学系 ,福州 350002)
【摘要】　以有机氯农药 (666、DDT)作为唯一碳源的 Tonomura 培养基分离筛选后 ,得到降解 666 (BHC) 的主要
菌株有 153 号 (芽孢菌属 B acillus) 、411 号 (无色杆菌属 Achromobacter)和 512 号 (假单孢菌属 Pseudomonas) ,其
对 666 总量的降解率分别为 59. 6 %、56. 9 %和 56 % ,对β2666 的降解率分别为 55. 9 %、57. 6 %和 56. 9 %. 降解
DDT 的主要菌株有 :288 号 (产碱杆菌属 A lcaligenes) 、410 号和 411 号 (均为无色杆菌属) ,其对 DDT 总量的降
解率分别达 59. 0 %、47. 5 % 和 45. 1 % ,对 PP′2DDT 的降解率为 59. 9 %、57. 6 %和 49. 6 %. 将这些分离出的菌株
制成复合菌剂 ,应用于盆栽试验和田间试验 ,所得到的降解效应类似于纯培养试验 ,表明田间应用复合菌剂 ,对
降解农药残留是可行的.
关键词 　有机氯农药 　微生物降解
Isolation and selection of strains used to degrade organic chlorine pesticides and application effects. FAN G Ling
( Depart ment of L and and Envi ronmental Sciences , Fujian A gricultural U niversity , Fuz hou 350002) . 2Chin. J .
A ppl . Ecol . ,2000 ,11 (2) :249～252.
With the organic chlorine pesticides (666 , DDT) as sole carbon resources , three strains , No. 153 ( B acillus) , No. 411
( Achromobacter) and No. 512 ( Pseudomonas) , which can degrade 666 (BHC) , were isolated and selected in Tono2
mura culture medium. The degradation rates of these strains were 59. 6 % , 56. 9 % and 56. 0 % for total amount of
666 , and 55. 9 % , 57. 6 % and 56. 9 % forβ2666 , respectively. The other strains , No. 288 ( A lcaligenes) , No. 410
and No. 411 ( Achromobacter) to degrade DDT were also obtained. The degradation rates of the strains were 59. 0 % ,
47. 5 % and 45. 1 % for total amount of DDT , and 59. 9 % , 57. 6 % and 49. 6 % for PP’- DDT , respectively. The
degradation effects of the mixtures of the isolated strains in pot and field experiments were similar to those of the pure
culture , indicating it is a feasible measure to apply the mixture of strains to degrade residual pesticides in fields.
Key words 　Organic chlorine pesticides , Microbial degradation.
　　3 福建省“八·五”重点科技项目 (852002) .
　　1999 - 15 - 08 收稿 ,2000 - 01 - 12 接受.
1 　引 　　言
　　有机氯农药以 666、DD T 为代表 ,是化学性质很稳
定的农药 ,666 称六氯环己烷 ,主要有α、β、γ、δ等 4 种
椅式异构体. DD T 称 2 ,22双 (对氯苯基)21 ,1 ,12三氯己
烷 (或二氯2二苯2三氯己烷)主要有对 ,对2异构体 ( PP′2
DD T) ,其次是邻 ,对2异构体 (OP′2DD T) . 666、DD T 对
光、热、酸等条件很稳定 ,所以在自然条件下不易分解
消失 ,是高残留的农药.
　　虽然我国在 1984 年全面禁止生产和使用 ,但至今
在某些土壤和作物体中尚有残留检出. 另者 ,近年来有
些农田、茶园、果园等施用国产三氯杀螨醇 (含有 4 %
～10 %的 DD T 杂质[1 ]) ,这也增加了土壤和作物中至
今还有有机氯农药残留的问题. 关于农药残留的降解 ,
曾有过降解微生物的筛选和纯培养降解能力的试验报
导[3 ,5 ,6 ] ,但未见有田间应用降解效果报导. 本研究注
意到降解菌制剂对有机氯农药残留的田间应用的效果
以及对β2666 异构体和 PP′2DD T 的降解效果. 2 　试验设计与方法2. 1 　供试土样　　从曾生产过 666、DDT 的农药厂内外环境中的土壤以及过去大量施用过 666、DDT 农药的果、茶园土壤 ,作为分离筛选降解菌株的主要土壤来源 ,共采集此类土样 103 个 ,分离出 600多株菌株 ,进行筛选.2. 2 　研究方法2. 2 . 1 降解菌株的富集培养与分离筛选 　根据微生物对环境因子的耐受范围具有可塑性 ,对营养物可利用性也比较广泛的特性 ,在选择性培养基中能以加入的某些特殊碳源为营养物质 ,使样品中少数能分解利用此类物质的微生物大量繁殖 ,并将其分离出[8 ,9 ] . 本方法采用 Tonomura 无碳培养基加一定浓度的 666、DDT 作为唯一碳源营养 ,将采集到的 103 个土样接入该培养基中 ,在 30 ℃恒温摇床上进行振荡富集培养 72h ,如此连续移接培养 5 次即得到以降解 666、DDT 占优势的菌株富集培养液. 将富集培养液用平板划线法 ,连续划线直至得到纯
应 用 生 态 学 报 　2000 年 4 月 　第 11 卷 　第 2 期 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
CHIN ESE JOURNAL OF APPL IED ECOLO GY ,Apr. 2000 ,11 (1)∶249～252
菌株.
　　用各纯菌株在不同浓度梯度的 666、DDT 作培养基的平板
上进行初筛选 ,挑选适应 666、DDT 浓度高的 ,生长繁殖快而旺
盛的单菌落 ,进行降解能力的测定.
2. 2 . 2 菌株降解能力的测定 　将初筛出的各菌株 ,接种到已知
666、DDT 浓度的 Tonomura 培养基中 ,30 ℃恒温摇床振荡培养
3d 后 ,再静置培养 17d ,得纯培养液 ,然后用正己烷作为纯培养
液中残留的 666、DDT 的提取剂 ,再以气相色谱测定其 666、
DDT 的残留含量 ,求出各菌株在纯培养条件下的降解率 ,留取
降解能力强的菌株进行细菌学鉴定.
2. 2 . 3 各菌株生长曲线测定及复合菌剂制备 　将一定量的各
种菌液 ,接种到一定量的培养液中 ,在 30 ℃和摇床振荡的条件
下进行培养 ,每隔一定时间 ,测其 OD 值 ,再作各菌株的生长曲
线[10 ] ,将生长旺盛期的各菌液配制成复合菌剂 ,用于盆栽和田
间试验.
2. 2 . 4 盆栽试验方法 　每盆装 5kg 土壤各加 666、DDT 原粉
0. 12g(将 0. 12g 原粉溶于 10ml 丙酮中 ,喷洒于土中后拌均) 即
土壤中 666、DDT 理论浓度各为 24mg·kg - 1 . 盆栽试验共设置
对照和土壤施用复合菌剂 2 处理 ,3 个重复 ,种植茶苗 1 年后 ,
第二年春开始施用复合菌剂 2 次后 (3 月 30 日、4 月 30 日) 于 5
月 30 日采春季土样和茶叶样品进行 666、DDT 残留量测定. 继
而再施用 2 次复合菌剂后 (7 月 6 日、7 月 29 日) ,于 8 月 30 日
采秋季土样和茶样进行残留量测定. 每次复合菌剂用量均为每
盆 100ml.
2. 2 . 5 田间试验方法 　在茶园土壤试验中 ,设对照和土壤施用
2 处理 3 重复 ,共施用复合菌剂 4 次 ,每小区面积 1. 5m ×10m2 .
每小区每次施菌液 7. 5kg. 在 3 月 5 日和 4 月 10 日 ,各施 1 次 ,
于 5 月 10 日采春季土样和茶样测定降解能力 ,继后 6 月 25 日
和 7 月 25 日各施 1 次 ,于 8 月 25 日采秋季土样和茶叶测定.
2. 2 . 6 降解率计算
　　降解率 % = 对照样品残留量 - 处理样品残留量对照样品残留量 ×100
3 　结果与分析
3 . 1 　菌种筛选与鉴定
　　从各种土壤中分离筛选出对有机氯农药降解能力
较强和生长较快的菌株 ,主要有 153 号、288 号、410
号、411 号和 512 号菌株. 通过对菌落特征、菌体形态
和生理生化试验鉴定[4 ] ,这些菌株中 153 号属于芽孢
杆菌属 ( B acill us) ,288 号是属于产碱杆菌属 ( A lcali2
genes) 、410 和 411 号属于无色杆菌属 ( A chromobacter)
和 512 号属于假单孢菌属 ( Pseudomonas) (表 1) .
表 1 　各菌株基本特征的鉴定
Table 1 Identif ication of basic characteristics of various strains
菌株号
Strains
No.
培养特征
Culture characteristic
A B C
菌体形态
Strains form
D E F G H
生化试验
Biochemical test
I J K L M O P Q R S
鉴定结果
Identification
results
153 白1) 半透明3) - + 杆状5) + - - + + + + - - + - - 胨化6) 芽孢菌属9)
288 白 半透明 - - 杆状 - + - - - - - - - - - - 产碱7) 产碱杆菌属10)
410 白 污白4) - - 杆状 - - - + - - - + + - - - 微酸8) 无色杆菌属11)
411 白 污白 - - 杆状 - - - - - - - + - - - - 微酸 无色杆菌属
512 灰白2) 半透明 - - 杆状 - - - + - - - - + - - - 微酸 假单孢菌属12)
A. 菌落颜色 Colony color ,B. 菌落特征 Colony character ,C. 色素产生 Pigment production ,D. 革兰氏染色 Gram staining , E. 形状 Form ,F. 芽孢 Spore , G.
鞭毛 Flagelle ,H. 荚膜 Capsule , I. 葡萄糖利用 Acid produced from glucose ,J . 硝酸盐利用 Nitrates reduction , K. 明胶液化 Gelatin liquefaction ,L . VP 试验
VP test ,M. MR 试验 MR test ,O. H2S 试验 H2S test ,P. 果聚糖产生 Fructosan production ,Q. 精氨酸水解 Arginine hydrolysis ,R. 吲哚试验 Indole test ,S.
石蕊牛奶 Litmus milk test ;1) White ,2) Grey and white ,3) Translucent ,4) Dirt white ,5) Rod ,6) Peptonize ,7) Produced alkali ,8) Microacid ,9) Baccill us ,10)
A lcaligenes ,11) Achromobacter ,12) Pseudomonas .
3 . 2 　在纯培养条件下各菌株对 666、DD T 的降解效果
　　采用摇瓶接种培养 20d 后 ,测定各菌株对 666、
DD T 及各异构体的降解能力 (表 2、3) . 测定结果表明 ,
在所有分离的菌株中 ,对 666 总量的降解率大于 55 %
的菌株有 153 号、411 号和 512 号 ,其中 153 号菌株对
666 总量的降解率最高达 59. 6 % , 其次是 411 号
(56. 9 %)和 512 号 (56. 0) % ,对β2666 的降解率大于 55 %有 153 号、410 号、411 号和 512 号 ,其降解率在56 %～58 %范围内 (表 3) ,以 410 号为最高 ;对 DD T总量和 PP′2DD T 的降解率大于 45 %的菌株有 288 号、410 号和 411 号 ,其中 288 号菌株降解能力最强 ,其对DD T 总量降解率达 59 % , 对 PP′2DD T 降解率达59. 9 % ,其次是 410 号和 411 号菌株. 表 2 中 ,288 号、4 10号、411号的培养液中α2666含量高于对照 ,这可
表 2 　在纯培养条件下各菌株降解 666、DDT的能力测定结果
Table 2 Ability of the strains to degrade 666 and DDT under the conditions of pure culture( mg·kg - 1)
菌株号
Strains
No.
666
α β γ δ
总量
Total
降解率
Degraded
rate ( %)
OP’DDT
DDT
PP’2DDT PP’2DDE PP’2DDD 总量Total 降解率Degraded
rate ( %)
CK 1. 039 1. 681 2. 888 1. 840 7. 448 - 1. 616 7. 826 0. 106 1. 165 10. 713 -
153 1. 007 0. 742 0. 704 0. 554 3. 007 59. 6 0. 679 6. 207 0. 305 1. 319 8. 510 20. 6
288 2. 141 1. 450 1. 232 0. 688 5. 511 26. 0 0. 609 3. 135 0. 263 0. 382 4. 389 59. 0
410 1. 496 0. 710 0. 861 0. 482 3. 549 52. 3 1. 135 3. 321 0. 143 1. 029 5. 628 47. 5
411 1. 321 0. 712 0. 742 0. 435 3. 210 56. 9 0. 638 3. 941 0. 242 1. 059 5. 880 45. 1
512 0. 696 0. 714 1. 140 0. 718 3. 278 56. 0 1. 814 6. 785 0. 029 1. 232 9. 860 8. 0
052 应 　用 　生 　态 　学 　报 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　11 卷
表 3 　各菌株对β2666 及 PP′2DDT的降解率
Table 3 Degraded rate of the strains toβ2666 , PP′2DDT( %)
菌株号
Strains No.
666 总量
Total 666
β2666 DDT 总量
Total DDT
PP′2DDT
153 59. 6 55. 9 - -
288 - - 59. 0 59. 9
410 52. 3 57. 8 47. 5 57. 6
411 56. 9 57. 6 45. 1 49. 6
512 56. 0 56. 9 - -
能是各异构体间的转化引起的 ,一般γ- 和δ2666 比较
易转化为α2666 ,当在某个时期 ,还来不及再转化消失
时 ,α2666 会暂时累积 ,出现高于对照量. 同样 ,在 DD T
降解过程中各异构体的相互转化时 ,某种异构体也可
能暂时累积 ,如 512 号培养液中 OP′2DD T 的含量就比
对照高.
　　通过对各菌株降解能力的 t 值检验 (表 4) ,在降解
666 的菌株中 ,除 288 号株不显著外 ,153、411、512 号
菌株均达极显著水平 ,t 值分别为 12. 07 3 3 、11. 21 3 3
和 14. 73 3 3 ,410 号菌株达显著水平 ,t 值为 8. 76 3 ;在
降解 DD T 的菌株中 ,除 512 号菌株不显著外 ,288 号、
410 号、411 号菌株均达极显著水平 , t 值分别为
28. 11 3 3 、18. 10 3 3 和 12. 46 3 3 ,153 号达显著水平 , t
值为 6. 10 3 . 这表明它们均具有显著和极显著的降解
效果. 其中 ,对 666 总量和β2666 降解能力最强的是
153 号菌株 ,而对 DD T 总量及 PP′2DD T 的降解能力
最强的是 288 号菌株. 而 410 号和 411 号菌株 ,同时具
备对 666 和 DD T 的较强降解能力 ,弥补了 153 号、512
号和 288 号的单一降解 666 或 DD T 的缺陷 ,所以由这
些菌株配制成的复合菌剂 ,是较理想的降解农药残留
的复合菌剂.
表 4 　各菌株降解 666、DDT能力的 t 值检验
Table 4 T test of the strains to degrade 666 and DDT
株号
Strains
No.
666
总量 ŠX ±S
Total ŠX ±S t 值t value DDT总量 ŠX ±STotal ŠX ±S t 值t value t 0. 05 t 0. 01
CK 7. 448 ±0. 097 - 10. 713 ±0. 809 - 4. 30 9. 92
153 3. 007 ±0. 368 12. 07 3 3 8. 510 ±0. 361 6. 10 3
288 5. 511 ±1. 174 1. 65 4. 389 ±0. 225 28. 11 3 3
410 3. 549 ±0. 445 8. 76 3 5. 628 ±0. 281 18. 10 3 3
411 3. 210 ±0. 378 11. 21 3 3 5. 880 ±0. 388 12. 46 3 3
512 3. 278 ±0. 283 14. 73 3 3 9. 860 ±0. 668 1. 28 　
3 . 3 　菌株的生长繁殖特性
　　各菌株生长繁殖特性可用菌株的生长曲线表示
(图 1) . 它是以细胞数的对数 (或 OD 值) 为纵坐标 ,以
培养时间为横坐标作出的一条菌株生长曲线. 从图 1
可看出 ,153 号和 288 号菌株 ,411 号和 512 号菌株在
培养 6 和 12h 以前 ,基本上处于生长滞留期. 经过 36
～48h 的培养 ,这些菌株均能达到生长最旺盛期 ,其
OD 值分别达 1. 0、1. 2、1. 7 和 2. 0. 了解各菌株生长繁
殖的规律 ,对生产降解菌剂有重要的指导意义 ,如该菌
图 1 　各菌株的生长曲线
Fig. 1 Growing curves of the strains.
Ⅰ. 153 号 , Ⅱ. 288 号 , Ⅲ. 512 号 , Ⅳ. 411 号.
剂一般约培养 36～48h 即是最佳应用期 ,此时将它们
按一定比例配制成复合菌剂 ,能提高降解效果.
3 . 4 　复合菌剂在茶叶生产中的应用效果
3 . 4 . 1 盆栽试验中复合菌剂对 666、DD T 的降解效果
　从表 5 可看出 ,复合菌剂对盆栽土壤和茶叶中 666、
DD T 均有一定的降解能力. 对土壤 666 残留总量的降
解率达 51. 6 %～54. 0 % ,与对照比较均达到显著和极
显著降解水平 (t 值在 6. 35 3 ～12. 12 3 3 ) ,对β2666 的
降解率达 42. 4 %～66 % ;对 DD T 总量的降解率达
30. 1 %～41. 3 % ,达显著和极显著水平 ( t 值 = 6. 80 3
- 10. 42 3 3 ) , 对 PP′2DD T 的降解率达 40. 1 %～
42. 8 %. 在相应处理的茶叶中 ,复合菌剂对 666 总残留
量的降解率达 78. 9 %～ 83. 3 % ,β2666 降解率达
62. 7 %～89. 5 % ;DD T 总残留量的降解率达 59. 5 %～
63. 7 % ,PP′2DD T 的降解率达 35 %～72 %. 盆栽土壤
施用复合菌剂的降解效果 ,还表现出在相应茶叶中的
降解率要大于土壤 20 %～30 % ,这是由于在土壤中得
到降解 ,因而茶树对 666、DD T 的吸收富集也减少 ,尤
其是在秋季茶叶中施用复合菌剂 4 次后 666、DD T 富
集量更低 ,降低效果更显著. 同时也可见 ,此复合菌剂
对 666 的降解率要大于对 DD T 的降解率.
3 . 4 . 2 复合菌剂在茶园土壤和茶叶中的降解效果 　复
合菌剂在茶园中的应用结果 (表 6) 与盆栽结果相似 ,
其对 666 残留总量的降解率 ,土壤中达 43. 5 %～
62. 5 % ,茶叶中达 50. 9 %～71. 2 % ,对 DD T 残留总量
的降解率 ,土壤达35 . 3 %～56 . 7 % ,茶叶中达36 . 3 %
～55. 1 % ,对β2666 的降解率达 30 %～71. 0 % ,对 PP′2
DD T 的降解率达 37. 6 %～66. 7 % ,通过 t 检验 ,无论
666或DD T ,在土壤和茶叶中均达到显著或极显著的
1522 期 　　　　　　　　　　　　　　方 　玲 :降解有机氯农药的微生物菌株分离筛选及应用效果 　　　　　　　　　
表 5 　复合菌剂在盆栽土壤和茶叶中的降解效果
Table 5 Results of the mixture strains to degrade the pesticide in the pot soil and tea( mg·kg - 1)
处理
Treatment
666
α β γ δ
总量
Total
降解率
Degraded
rate ( %)
DDT
OP’2DDT PP’2DDT PP’2DDE PP’2DDD 总量Total 降解率Degraded
rate ( %)
土壤 CK 春1) 6. 045 5. 940 1. 335 1. 335 14. 655 - 0. 930 4. 680 2. 625 1. 570 9. 805 -
Soil 秋2) 1. 145 0. 794 0. 195 0. 324 2. 458 - 0. 329 3. 420 2. 670 0. 562 6. 981 -
土施3) 春 2. 370 3. 420 0. 630 0. 675 7. 095 51. 6 0. 630 2. 805 2. 070 1. 350 6. 855 30. 1
秋 0. 463 0. 270 0. 145 0. 252 1. 130 54. 0 0. 121 1. 958 1. 866 0. 151 4. 096 41. 3
茶叶 CK 春 0. 080 0. 133 0. 062 0. 394 0. 669 - 0. 142 0. 194 0. 075 0. 046 0. 457 -
Tea 秋 0. 105 0. 075 0. 053 0. 284 0. 517 - 0. 014 0. 017 - 0. 011 0. 042 -
土施 春 0. 054 0. 014 0. 025 0. 019 0. 112 83. 3 0. 062 0. 052 0. 025 0. 027 0. 166 63. 7
秋 0. 025 0. 028 0. 032 0. 024 0. 109 78. 9 0. 002 0. 011 - 0. 004 0. 017 59. 5
1) Spring ,2) Autumn ,3) Soil application. 下同 The same below.
表 6 　复合菌剂在茶园土壤和茶叶中的降解效果
Table 6 Results of the mixture strains to degrade pesticide in the farm soil and tea( mg·kg - 1)
处理
Treatment
666
α β γ δ
总量
Total
降解率
Degraded
rate ( %)
DDT
OP’2DDT PP’2DDT PP’2DDE PP’2DDD 总量Total 降解率Degraded
rate ( %)
土壤 CK 春1) 0. 007 0. 008 0. 007 0. 001 0. 023 - 0. 006 0. 008 0. 010 0. 010 0. 034 -
Soil 秋2) 0. 004 0. 007 0. 005 - 0. 016 - 0. 004 0. 006 0. 010 0. 010 0. 030 -
土施3) 春 0. 004 0. 006 0. 003 - 0. 013 43. 5 0. 003 0. 005 0. 006 0. 008 0. 022 35. 3
秋 0. 003 0. 002 0. 001 - 0. 006 62. 5 0. 001 0. 002 0. 002 0. 008 0. 013 56. 7
茶叶 CK 春 0. 035 0. 062 0. 008 0. 001 0. 106 - 0. 020 0. 039 0. 012 0. 042 0. 113 -
Tea 秋 0. 018 0. 049 0. 006 - 0. 073 - 0. 019 0. 030 0. 009 0. 031 0. 089 -
土施 春 0. 012 0. 034 0. 006 - 0. 052 50. 9 0. 015 0. 024 0. 010 0. 023 0. 072 36. 3
秋 0. 004 0. 015 0. 002 - 0. 021 71. 2 0. 010 0. 011 0. 007 0. 012 0. 040 55. 1
降解水平 (t 值均在 4. 58 3 ～11. 57 3 3 间) . 这些结果表
明 ,从自然环境的土壤中筛选出的高效降解菌种所制
成的复合菌剂施用到田间 ,对有机氯农药残留的降解 ,
尤其是对其中一些稳定性较强、残留量较大[2 ,6 ,7 ] 、在
生物体内富集量较多 ,相应危害性也较大的异构体 (如
β2666 和 PP′2DD T 等)的降解具有独特的效果. 对于复
合菌剂能降解有机氯农药的原因 ,可能是由于这些降
解菌株是在有机氯农药作为唯一碳源 ,在好气和兼气
条件下分离筛选出来的. 它们可适应于亚热带地区间
歇性降雨并有干湿交替的受有机氯农药污染的土壤 ,
当它们施入土壤中 ,能较快的繁殖 ,形成优势种群 ,对
有机氯农药分子结构进行生化水解和氧化作用 ,产生
环结构的开裂反应. 据资料[7 ,8 ] ,666 (六氯环己烷) 能
在好气、兼气条件下有芽孢杆菌的参与时 ,分子结构可
以脱去氯化氢形成毒性较小的五氯环乙烯 ,并可再进
一步转化为三氯苯. DD T 也可以在这些复合剂菌的参
与下 ,分子脱氯化氢作用形成毒性较小的 DDE 等.
致谢 　参加本研究采样工作的有胡开辉、吴小平、袁地顺、罗
光、林依汝 ,菌株特性初步鉴定由陈汉清副教授协助完成 ,菌株
降残测定由福建农业大学校中心实验室完成 ,在此一并致谢 !
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作者简介 　方玲 ,女 ,1943 年生 ,副教授 ,主要从事土壤化学和
农业环保教学和科研工作.
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