全 文 ：收稿日期：2011- 09- 02
作者简介：耿雪飞（1986-），女，在读硕士研究生。
通讯作者：郑永杰（1964-），男，教授，研究生导师，主要研究方向：
环境工程，分析化学。
文章编号：1002-1124（2011）10-0070-04
Sum 193 No.10
化 学 工 程 师
Chemical Engineer 2011年第 10期
工
程
师
园
地
各种森林植物抗氧化活性成分的筛选和鉴定
等基础性研究是保障我国森林资源有效开发利用
的前提条件之一，考虑到我国森林植物种类的多样
性和每种植物抗氧化活性成分的复杂性，有必要构
建一个快速分析鉴定抗氧化活性成分的快速检测
体系。通常从天然植物中筛选和分析抗氧化活性成
分需要经过反复的提取、分离、纯化、体外验证及鉴
定等过程，实验过程繁琐，效率低下，而在线HPLC- ABTS
筛选和检测抗氧化活性成分的方法是将具有高效
分离功能的高效液相色谱法和检测清除自由基的
ABTS+试剂检测器链接后在高效液相色谱仪分离
组分的同时检测和筛选具有抗氧化活性的成分，可
提高抗氧化活性成分的筛选效率。
细叶杜香（Ledum palustre L. var. Angustum E.
Busch）是分布于我国大小兴安岭、长白山地区的主
要天然植物之一，常用于治疗月经不调，不孕，胃溃
疡，咳嗽痰多，气喘，消炎杀菌等症状。由于目前国
内对该植物的活性成分研究主要集中在挥发油成
分方面，而在抗氧化性成分的分析研究比较缺乏，
因此，本实验基于 HPLC- ABTS+快速筛选体系对采
自大兴安岭地区的细叶杜香茎部的抗氧化活性成
分进行了筛选，旨在为充分利用具有丰富资源量的
细叶杜香这一药用资源的开发研究提供新的实验
数据。
1 实验部分
1.1 材料与试剂
细叶杜香（大兴安岭）；所有有机溶剂均为色谱
纯。Fisher Scientific（美国）；Trifluoroacetic acid（TFA）,
6- hydroxy- 2，5，7，8- tet ramethylchroman- 2- carboxylic
acid（Trolox），2，2- azinobis（3- ethylbenzothiazo-
line- 6- sulfonic acid）（ABTS），5- O- caffeoylquinic acid
基于 HPLC- ABTS体系筛选
细叶杜香抗氧化活性成分
耿雪飞 1，郑永杰 2，赵 明 1，UM Byunghun2
(1.齐齐哈尔大学 化学与化学工程学院，黑龙江 齐齐哈尔 161006；
2.韩国 KIST江陵分院 天然产物研究中心，韩国 江原道江陵 210- 340)
摘 要：细叶杜香（Ledum palustre L. var. Angustum E. Busch）是我国北方常用药用材料，有止咳祛痰、平
喘、扩张血管等功效。本文利用 HPLC- ABTS+在线筛选体系对细叶杜香茎部的抗氧化活性成分进行了筛选和
分析检测，实验结果表明：细叶杜香茎部甲醇提取物中含有大量抗氧化活性成分，其中经二氯甲烷萃取后纯
化的一个组分通过核磁共振波普分析鉴定为秦皮素，该研究为细叶杜香中更多抗氧化活性物质的筛选提供
了基础性实验依据。
关键词：细叶杜香；高效液相色谱；抗氧化活性；快速筛选
中图分类号：R284.2 文献标识码：A
Screening of antioxidant components by HPLC-ABTS system in Ledum palustre L
GENG Xue-fei2，ZHENG Yong-jie1，ZHAO Ming2，UM Byung-hun3
（1. College of Chemistry and Chemical Engineering, Qiqihar University, Qiqihar 161006, China；
（2. Natural Product Research Center, KIST Gangneung Institute, Gangwon 210-340, Korea）
Abstract：The plant Ledum palustre L. var. Angustum E. Busch，a well known edible medicinal herb in
North China, has been used to relieve a cough，relieved asthma and blood vessel dilatation. In this research, four
major antioxidant compounds were screening and detected from this plant stem using an on-line HPLC-ABTS +
screening system. Plant stem have active antioxidant compounds, one of them was isolated by HPLC and identified
by NMR. The study gives basic experimental data screening more antioxidant compounds.
Key words：Ledum palustre L；HPLC；antioxidant；screening
DOI:10.16247/j.cnki.23-1171/tq.2011.10.006
2000
1500
1000
500
0
- 500
mAU
0 10 20 30
ATotal
were purchased Sigma- Aldrich Chemicals（美国）。
1.2 仪器与设备
Agilent 1200 高效液相色谱系 统（Agilent
Technologies, Santa Clara, CA, USA）；Waters- Prep LC
4000系统（美国Waters公司）；Varian NMR system
（500 MHz 美国）。
1.3 方法
1.3.1 样品的处理 将杜香的茎用剪刀剪 2cm左
右，用自来水清洗至无颜色，然后再用蒸馏水清洗，
在室温下阴干后用甲醇浸泡 2~3d，过滤回收甲醇浓
缩制成浸膏，浸膏用水溶解后，先后用环己烷，二氯
甲烷，乙酸乙酯，正丁醇进行萃取后浓缩待用。
1.3.2 HPLC- ABTS+条件
HPLC- ABTS+系统见图 1。
图 1 HPLC-ABTS在线筛选体系模式图
Fig.1 Schematic diagram of the on-line HPLC-ABTS
screening system
系统包括安捷伦 1200 高效液相色谱系统
（Primary system）和装有连接泵的 ABTS自由基试剂
供应以及测定系统（Advanced system）。 ABTS自由
基试剂配制采用 2 mM的 ABTS保存溶液和 3.5 mM
的 K2SO4混合，用 8倍体积的色谱级纯水稀释，室温
避光过夜后加入系统容器中。色谱分析柱为 Alltech
C18色谱柱（250×4.5mm i.d.,5μm particle size），杜
香提取物用甲醇溶解，进样量为 10μL，移动相为乙
腈和 0.1%的（TFA）水溶液，流量为 1mL·min-1,移动
相程序设定为 28min内乙腈由 15%增加至 40%，然
后在 33min内乙腈增加至 90%，ABTS+工作液提供
量为 0.5mL·min-1。检测分离组分的色谱波长定为
330nm，为正峰值，检测 ABTS自由基波长为 734
nm，为负峰值。数据分析采用 ChemStation分析软件
（安捷伦）（Shang Yafang等 2011）。
1.3.3 HPLC分离条件 经 HPLC- ABTS确认的抗
氧化活性成分利用 Waters- Prep LC 4000 system进
行了分离纯化，分离柱使用 Hydrophere C18（250×
20mm，S- 5μm），移动相及流速见表 1。
表 1 分离 HPLC的设定条件
Tab.1 Setting conditions for HPLC seperation
1.3.4 质谱条件 核磁共振谱分析在 Varian NMR
system500MHz上进行,将样品溶于 CD3OD溶液中, 1H
和 13CNMR谱的δvalues以 TMS（tetramethylsilane）为
内标。
2 结果与分析
2.1 HPLC-ABTS的抗氧化活性检测
利用 ABTS自由基体外清除实验可确定待测样
品是否具有抗氧化活性，因此，目前国内研究者大
多是采用先分离纯化组分后利用 ABTS、DPPH自由
基等体外清除自由基实验对各个组分进行抗氧化
活性的验证，由于天然产物中成分的多样性使得抗
氧化活性成分的确定就需要对所有组分进行验证
后方可筛选出抗氧化活性物质，使得筛选效率低
下，而 HPLC- ABTS方法体系很好的解决了这一难
题，该方法是利用具有高效分离功能的高效液相色
谱法化合物的同时与 ABTS+试剂混合反应，使得高
效液相色谱仪分离组分的同时便可确定其是否具
有抗氧化活性，确保后期试验中可有目的的选择组
分进行分离纯化和结构鉴定，可提高抗氧化活性成
分的筛选效率。
本实验利用 HPLC- ABTS的抗氧化活性物质筛
选体系，对细叶杜香茎部甲醇提取物的抗氧化活性
进行了分析，其结果见图 2。
图 2 杜香甲醇总提取物的 HPLC-ABTS分析图谱
Fig.2 Chromatogram of the Ledum palustre L methanol extract
in the on-line HPLC-ABTS assay
二进制泵
流动相
自动加样
柱
炉内反应
PDA
“T”valve 等力泵
VIS
At732
试剂
ABTS
废物
测定系统高效液相色谱系统
时间 /min
开始
40
50
60
流速 /mL·min-1
10
10
10
10
A%/乙腈
15
40
95
100
B%/水
85
60
5
0
耿雪飞等：基于 HPLC- ABTS体系筛选细叶杜香抗氧化活性成分2011年第 10期 71
由图 2可见，提取物的多个分离组分正峰值相
对应的 ABTS自由基检测中可观察到负峰值，该实
验结果首次验证了细叶杜香茎部含有丰富的可清
除自由基的抗氧化活性物质，在此基础上分别对各
组分进行结构鉴定可为细叶杜香这一天然资源的
深入开发利用提供有效的科学依据。
2.2 抗氧化活性组分的分离
为了分别对具有抗氧化活性成分进行结构鉴
定实验，对杜香茎部的甲醇提取物先后利用环己
烷，二氯甲烷，乙酸乙酯，正丁醇进行萃取，选取抗
氧化活性多的二氯甲烷层组分，以乙腈和水为流动
相利用 Waters- Prep LC 4000 system进行了组分的
分离纯化 （图 3），取单一组分后再次利用
HPLC- ABTS进行了抗氧化活性的验证，其结果如
图 4，可观察到分离组分具有较强抗氧化活性。为了
对这一组分进行鉴定，反复利用 Waters- Prep LC
4000 system进行了分离纯化，制备了可用于核磁鉴
定的样品。
图 3 二氯甲烷层抗氧化活性组分的分离纯化
Fig.3 Isolation and purification of antioxidant components in
methylene dichloride
图 4 二氯甲烷层抗氧化活性成分的 HPLC-ABTS在线检测
Fig.4 The chromatogram of the methylene dichloride extract in
the on-line HPLC-ABTS assay
2.3 化合物的结构鉴定
经分离纯化的组分利用 NMR system 500 MHz
（Varian, Palo Alto, CA, USA）进行了结构分析，其中
1H- NMR （500 MHz，CD3OD）:7.89 （1H，d，J = 9.4
Hz, H- 4），6.80（1H，s，H- 5），6.22（1H，d，J = 9.4 Hz,
H- 3），3.81（3H，s，OCH3）；13C- NMR（125MHz,CD3OD）
: 160.6（C，C- 2），145.3（C，C- 6），145.0（CH，C- 4），
139.6（C，C- 7），139.3（C，8a），132.9（C，C- 8），111.
8（CH，C- 3），110.2（C，C- 4a），100.2（CH，C- 5），56.
1（CH3，OCH3）。以上数据与文献报道的秦皮素数据
基本一致[12 ]，故鉴定分离化合物为秦皮素。
3 讨论
细叶杜香广泛分布于我国大小兴安岭及长白
山地区，由于杜香具有独特的香气，因此，对其挥发
性成分相关研究较多[ 11 ]，而对抗氧化活性成分研究
较少。在杜香中各类化学成分分析研究报告中在细
叶杜香中分离鉴定了秦皮素、5- 羟基 - 4, 7- 二甲
氧基黄酮、正二十八烷醇、东莨菪内酯、熊果酸、七
叶内酯、对羟基苯甲酸、对苯二酚、槲皮素、金丝桃
苷等成分，于景华等[ 13 ]对细叶杜香中的秦皮素的质
量分数进行了测定，而本实验研究结果也表明细叶
杜香茎部含有秦皮素，结合María F. M（2005）等对
秦皮素抗氧化活性研究结果和本文的 HPLC- ABTS
实验可推断细叶杜香茎部多种抗氧化活性物质中
包含有秦皮素。
虽然本文利用 HPLC- ABTS在线检测体系只筛
选和鉴定出细叶杜香茎部的甲醇提取物中二氯甲
烷萃取层的一种成分，但是从图 2、4的检测结果可
知细叶杜香茎部中秦皮素以外还含有大量的抗氧
化活性物质，这一新发现对后期鉴定出更多细叶杜
香抗氧化活性成分提供了实验依据，也为具有丰富
资源量的细叶杜香的开发利用提供了可能性。
（致谢：感谢齐齐哈尔大学食品与生物工程学
院裴世春教授提供杜香等实验材料及联系在韩国
KIST进行实验的机会。）
参 考 文 献
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0.75
0.50
0.25
0.00
Valts
10 20 30 40 50
Collected①（3.12mg）
Ipa- Mrun Walers486
时间 /min
2000
1500
1000
500
0
- 500
mAU
0 10 20 30
AMC
72 2011年第 10期耿雪飞等：基于 HPLC- ABTS体系筛选细叶杜香抗氧化活性成分
与金属离子作用时，同一三氮唑环上的 N1 和 N3
理论上都可以参与配位，但由于 N1的空间位阻较
大，阻碍了其参与配位。因此，在合成配位聚合物
时，化合物中只有 N3参与配位。根据对称性原则，
化合物形成的是一个柔性双齿配体，已有文献证明
了这一点[11 ]。
3 结论
超声辐射下，苯并三氮唑与二溴烷烃在 NaOH
作用下，生成了 2 个双（苯并三氮唑）烷烃，用 IR，
1HNMR确定了其分子结构。通过计算不同温度下
1,4- 双（苯并三氮唑）丁烷的产率，找到反应的最佳
反应温度为 60℃；并通过量子化学计算，发现 2个
双（苯并三氮唑）烷烃虽都含有 6个氮原子，但只能
作为柔性双齿配体参与配位。
参 考 文 献
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（上接第 67页）
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耿雪飞等：基于 HPLC- ABTS体系筛选细叶杜香抗氧化活性成分2011年第 10期 73