全 文 ：2014 年 5 月
第 34 卷 第 5 期
基础医学与临床
Basic ＆ Clinical Medicine
May 2014
Vol． 34 No． 5
收稿日期:2013 － 11 － 21 修回日期:2014 － 01 － 16
* 通信作者(corresponding author):xyytc1@ 163． com
文章编号:1001 -6325(2014)05 -0690 -05 研究论文
紫花前胡苷抑制哮喘小鼠气道炎性反应和 NF-κB信号传导通路
熊友谊* ，时维静，俞 浩，张孝林
(安徽科技学院 食品药品学院，安徽 凤阳 233100)
摘要:目的 观察紫花前胡苷抗过敏性哮喘鼠气道炎性反应作用。方法 BALB /c小鼠被随机分为对照、模型、紫花
前胡苷和地塞米松 4 组。除对照组外，所有小鼠腹腔注射和雾化吸入卵清蛋白以致敏和诱导气道炎性反应。于每
次雾化前 1h，给紫花前胡苷组灌胃 10 mg /kg紫花前胡苷;给地塞米松组腹腔注射 1 mg /kg地塞米松。动物肺功能
仪分析气道高反应性;细胞计数器和 Diff-Quick染色计数支气管灌洗液中白细胞总数及分类;酶联免疫吸附法检测
血清或 BALF中炎性介质的水平;苏木精-伊红染色法观察气道病理改变;电泳迁移率和免疫印迹法检测肺组织
NF-κВ信号通路中蛋白的活力和表达。结果 与对照组比较，模型组呈现明显的气道炎性反应，气道反应性显著增
高 (P ＜ 0. 05) ;血清或 BALF中 IgE、IL-4、IL-5 和 IL-13 的水平显著增加 (P ＜ 0. 01) ;细胞系 P65、p-P65 的水平显著
增加(P ＜ 0. 05) ;细胞质 P65 和 IκBα显著减少，NF-κB DNA-结合力显著增加 (P ＜ 0. 05)。与模型组比较，紫花前
胡苷能够显著抑制气道炎性反应和气道高反应 (P ＜ 0. 05) ;降低血清或 BALF 中 IgE、IL-4、IL-5 和 IL-13 的水平
(P ＜ 0. 01) ;抑制细胞系 P65、p-P65 水平(P ＜ 0. 05) ;增加细胞质 P65、IκBα 蛋白和减弱 NF-κB DNA-结合力(P ＜
0. 05)。结论 紫花前胡苷具有抗过敏性哮喘鼠气道炎性反应。
关键词:紫花前胡苷;紫花前胡;哮喘;核因子 κB
中图分类号:Ｒ 541. 4 文献标志码:A
Inhibitory effects of nodakenin on the airway
inflammation and NF-κB signaling pathway in a murine asthmatic model
XIONG You-yi* ，SHI Wei-jing，YU Hao，ZHANG Xiao-lin
(College of Food and Drug，Anhui Science and Technology University，Fengyang 233100，China)
Abstract:Objective To observe the effects of nodakenin on airway inflammation in a mouse model of allergic
asthma． Methods BALB /c mice were assigned randomly to one of the following four experimental groups:control，
model，nodakenin and dexamethasone． All test mice were sensitized and challenged by OVA to induce airway in-
flammation． One hour before OVA challenge，nodakenin group was intragastrically administered with nodakenin at
a dose of 10 mg /kg，and dexamethasone group was intraperitoneally injected with dexamethasone a dose of 1 mg /kg．
Airway responsiveness was measured by a lung function analysis systems． The number of total leukocytes in BALF
was counted using a hemocytometer，and differential cells were counted using Diff-Quick-stained smears． Histopa-
thology of lung tissue was analyzed by Hematoxylin-eosin staining． Levels of inflammatory mediators in serum or
BALFs were measured by ELISA． The activity and expression of proteins in NF-κB signaling pathway was
respectively evaluated by EMSA and western blot analysis． Ｒesults Compared with control group，the model group
DOI:10.16352/j.issn.1001-6325.2014.05.012
熊友谊 紫花前胡苷抑制哮喘小鼠气道炎性反应和 NF-κB信号传导通路
exhibited obvious airway inflammation，airway reactivity was significantly increased，the level of total cells and dif-
ferential cells was significantly increased，levels of IL-4，IL-5，IL-13，IgE were significantly increased，levels of
nuclear P65 and p-P65 protein was significantly enhanced，level of cytoplasmic P65 and IκBα protein was signifi-
cantly decreased，and the NF-κB DNA binding activity was significantly increased． Compared with model group，
nodakenin significantly suppressed airway inflammation，airway hyperreactivity，reduced levels of IL-4，IL-5 and
IL-13 in BALF，and IgE in serum，decreased levels of nuclear P65 and p-P65 protein，increased cytoplasmic P65
and IκBα protein，and increased the NF-κB DNA binding activity． Conclusions Nodakenin efficiently inhibits an-
tigen-induced airway inflammation in asthmatic mouse．
Key words:nodakenin;peucedanum decursivum maxim;asthma;NF-κB
哮喘是一种以嗜酸性粒细胞为主的多种炎性
细胞浸润的慢性气道炎性反应。主要病理生理改
变为气道高反应、黏液分泌增多和间歇性气道阻
塞［1］。哮喘是临床常见病多发病，尚无有效的根治
方法［2］。紫花前胡苷是一种具有代表性的线性四
氢呋喃型香豆素苷类化合物，以传统抗哮喘中药紫
花前胡中含量高。研究表明紫花前胡苷具有抗炎、
抗过敏、抗氧化等多种生物活性［3 ～ 5］。考虑到哮喘
多属过敏性气道炎性反应，以及紫花前胡抗哮喘的
传统功效。本研究以雌性 BALB /c小鼠模仿人类的
哮喘模型，研究紫花前胡苷的抗哮喘作用，为其新
药开发提供理论依据。
1 材料与方法
1. 1 动物与试剂
SPF级雌性 BALB/c小鼠，6 ～8周龄，体质量 22 ～
25 g［北京维通利华实验动物技术有限公司，动物合格
证号:SCXK(京)20060009］。Ⅰ级卵白蛋白(OVA)试剂
盒、氯化乙酰胆碱、紫花前胡苷和地塞米松(Sigma 公
司);IL-4、IL-5和 IL-13 ELISA试剂盒(Bender Medsys-
tems公司);抗 P65、抗 p-P65 (Ser536)、羊抗兔 IgG(碧
云天生物技术公司);抗 IκBα(Cell Signaling 公司);
EMSA试剂盒(Pierce公司)。
1. 2 实验分组与模型
用随机表将小鼠分成对照、模型、紫花前胡苷
和地塞米松 4 组，每组 8 只。于实验第 0、7 和 14 d，
模型、紫花前胡苷和地塞米松组腹腔注射 10 μg
OVA混悬液(含 50 μg氢氧化铝凝胶) ，自第 21 d雾
化吸入 1% OVA，1 次 /d，20 min /次，连续 5 d;对照
组腹腔注射 50 μg 氢氧化铝凝胶和雾化吸入 0. 9%
氯化钠注射液。于雾化前 20 min，紫花前胡苷组灌
胃给予 10 mg /kg紫花前胡苷(溶剂为 0. 5% 羧甲基
纤维素钠) ，地塞米松组腹腔注射 1 mg /kg地塞米松
(Dex) ，对照组和模型灌胃给予等容的 0. 5% 羧甲
基纤维素钠。
1. 3 肺功能检测
小鼠末次雾化 24 h 后，用 60 mg /kg 戊巴比妥
钠麻醉，行气管插管术，后被置于动物呼吸机检测
肺功能。每隔 5 min，小鼠尾静脉顺次注射 10、30、
90 和 270 μg 氯化乙酰胆碱诱导气道高反应，纪录
每次注射后1 min的最大气道阻力。具体操作方法
按 AniＲes2005 肺功能仪(北京贝兰博科技有限公
司)说明书进行。
1. 4 白细胞计数和细胞因子检测
小鼠肺功能检测完毕先后被摘球取血和支气管
灌洗。灌洗液(BALF)离心上清和血清分别用于
IL-4、IL-5、IL-13 和 IgE 酶联免疫吸附法测定。BALF
离心沉淀用细胞计数器和 Diff-Quick染色法计数。
1. 5 肺组织病理改变
小鼠左下肺组织经 4%中性多聚甲醛溶液固定
送至南京医科大学作病理分析。
1. 6 Western blot检测 p-P65、P65 和 IκВα蛋白
参照 Heijink的实验方法［6］，结果以目的蛋白和
内参电泳条带的吸光度比值来表示。
1. 7 NF-κB DNA结合力
按试剂盒的操作说明逐步进行，结果以目的蛋
白与突变探针 NF-κB 电泳条带的吸光度百分比来
表示。
2 结果
2. 1 气道高反应实验
与对照组比较，模型组的气道阻力显著增加
196
基础医学与临床 Basic ＆ Clinical Medicine 2014. 34(5)
(P ＜ 0. 05)。与模型组比较，紫花前胡苷组气道阻
力显著降低(P ＜ 0. 05) (表 1)。
2. 2 肺组织病理改变
对照气道上皮平整，黏膜下无炎性细胞浸润，
肺泡腔内无渗出。模型组气道气道有大量炎性渗
出，气道和血管周围有大量炎性细胞浸润。紫花前
胡苷组炎性渗出和炎性细胞浸润减少 (图 1)。
2. 3 BALF中白细胞总数及分类计数
模型组 BALF 中白细胞总数、嗜酸性粒细胞和
淋巴细胞计数较对照组显著增加(P ＜ 0. 01) ;紫花
前胡苷组较模型组显著回降(P ＜ 0. 05 或 P ＜ 0. 01)
(表 2)。
2. 4 血清或 BALF中炎性介质的水平
模型组 IgE、IL-4、IL-5 和 IL-13 较对照组显著增
加 (P ＜ 0. 01) ;紫花前胡苷组较模型组明显降低
(P ＜ 0. 05 或 P ＜ 0. 01) (表 3)。
2. 5 肺组织 p-P65、P65、Iκβα的表达水平
模型组细胞系 P65、p-P65 较对照组显著增加
(P ＜ 0. 05) ，紫花前胡苷组较模型组显著回降(P ＜
0. 05) ;模型组细胞质 P65、Iκβα 较对照组显著减少
(P ＜ 0. 05) ，紫花前胡苷组 P65、Iκβα 较模型组显
著回升(P ＜ 0. 05) (图 2)。
表 1 紫花前胡苷对氯乙酰胆碱诱导的哮喘鼠气道高反应的作用
Table 1 Effect of nodakenin on the airway hyperreactivity induced by acetylcholine chloride in asthmatic mice
(x ± s，cmH2O·mL
－1·s －1，n =8)
group baseline
acetylcholine chloride (μg /kg)
10 30 90 270
control 2. 12 ± 0. 38 4. 11 ± 0. 72 4. 14 ± 0. 83 5. 03 ± 0. 79 7. 20 ± 1. 08
model 2. 06 ± 0. 28 4. 77 ± 0. 91# 8. 01 ± 1. 90## 12. 82 ± 1. 98## 22. 38 ± 2. 56##
nodakenin 2. 03 ± 0. 26 4. 35 ± 0. 84 6. 34 ± 0. 89* 9. 08 ± 1. 72* 14. 90 ± 1. 89＊＊
Dex 2. 05 ± 0. 39 4. 14 ± 1. 20* 5. 00 ± 1. 16* 6. 91 ± 1. 50＊＊ 10. 79 ± 1. 67＊＊
#P ＜ 0. 05，##P ＜ 0. 01 compared with control group;*P ＜ 0. 05，＊＊P ＜ 0. 05 compared with model group．
图 1 紫花前胡苷对 OVA 诱导的哮喘鼠肺组织炎性反应的作用
Fig 1 Effects of nodakenin on OVA-induced airway inflammation in asthmatic mice(×400)
296
熊友谊 紫花前胡苷抑制哮喘小鼠气道炎性反应和 NF-κB信号传导通路
表 2 紫花前胡苷对 OVA诱导的哮喘鼠 BALF中白细胞总数及分类计数的作用
Table 2 Effects of nodakenin on numbers of total leukocytes and differential in BALF of asthmatic mice induced
by OVA(x ± s，n =8)
group total leukocytes eosinophils lymphocytes
control 10 ± 3. 0 0 0. 3 ± 0. 2
model 72. 7 ± 18. 2# 41. 3 ± 10. 9# 17. 6 ± 3. 0#
nodakenin 29. 3 ± 7. 3* 12. 8 ± 3. 2* 5. 4 ± 1. 3*
Dex 14. 3 ± 3. 0* 7. 9 ± 1. 2* 2. 6 ± 0. 2*
#P ＜ 0. 01 compared with control group;*P ＜ 0. 01 compared with model group．
表 3 紫花前胡苷对 OVA诱导的哮喘鼠血清或 BALF中炎性介质的作用
Table 3 Effects of nodakenin on inflammatory mediator levels in serum or BALF of asthmatic mice induced
by OVA(x ± s，n =8)
group IgE(ng /mL) IL-4(pg /mL) IL-5(pg /mL) IL-13(pg /mL)
control 134 ± 32 16 ± 4 17 ± 3 13 ± 3
model 694 ± 116# 71 ± 17# 49 ± 14# 43 ± 17#
nodakenin 475 ± 64＊＊ 40 ± 7＊＊ 30 ± 4* 24 ± 4＊＊
Dex 426 ± 47＊＊ 31 ± 5＊＊ 24 ± 4＊＊ 17 ± 4＊＊
#P ＜ 0. 01 compared with control group;*P ＜ 0. 05，＊＊P ＜ 0. 01 compared with model group．
#P ＜ 0. 05 compared with control group;* P ＜ 0. 05 compared with model group
图 2 紫花前胡苷对 OVA诱导的哮喘鼠肺组织 NF-κВ信号传导蛋白的作用
Fig 2 Effects of nodakenin on proteins of NF-κВ signaling pathway in asthmatic mice induced by OVA(x ± s，n =8)
#P ＜ 0. 05 compared with control group;*P ＜ 0. 05;＊＊P ＜ 0. 01 compared with model group
图 3 紫花前胡苷对 OVA诱导的哮喘鼠肺组织 NF-κВ-DNA结合力的作用
Fig 3 Effects of nodakenin on the NF-κВ-DNA binding activity in asthmatic mice induced by OVA(x ± s，n =8)
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基础医学与临床 Basic ＆ Clinical Medicine 2014. 34(5)
2. 6 肺组织 NF-κВ-DNA结合力
模型组 NF-κВ-DNA 结合力较对照组显著增加
(P ＜ 0. 05) ，紫花前胡苷组 NF-κВ-DNA 结合力较模
型组明显降低(P ＜ 0. 05 或 P ＜ 0. 01) (图 3)。
3 讨论
目前中国哮喘病患者约 2 500 万，随着气候和
自然环境的改变，发病率呈现上升趋势［7］。糖皮质
激素是抑制哮喘气道炎性反应最有效的药物，但长
期使用会导致机体对药物产生耐受性，药效降低，
并产生一些严重的不良反应［8］。开发低毒、疗效好
的抗哮喘天然药物具有重大意义。本次研究表明
紫花前胡苷能显著抑制了哮喘鼠气道炎性反应，减
少气道分泌物和气道高反应，具有明显的抗哮喘
作用。
Th2 优势反应是哮喘发病机制中的关键因素，
Th2 细胞通过分泌 IL-4、IL-5、IL-13 等炎性因子在诱
导 EOS早期分化、活化及向炎性反应区域的募集，
高反应性和黏液高分泌的产生过程中发挥重要作
用［9 － 10］。紫花前胡苷具有显著下调 BALF 中 IL-4、
IL-5、IL-13 等炎性因子的作用。说明紫花前胡苷抑
制哮喘气道炎性反应和高反应与抑制 Th2 优势有
关，对免疫起调节作用。
另外，NF-κB作为哮喘发生发展过程中促炎信
号通路中的转录因子，参与了多种炎性介质的表
达，包括对 Th2 细胞因子［11］。P50 /P65 二聚体是
NF-κB信号通路中重要的信号物质，在细胞的静息
状态下，P50 /P65 被 IκB 蛋白家族结合滞留于细胞
质中而失活。当细胞在受到过敏原等各种刺激下，
IκBα发生磷酸化进而被降解，P50 /P65 被激活进入
核内促进致炎性反应物质基因的表达。另外，NF-
κB活性受其核内磷酸化化水影响［12］。本研究结果
显示，紫花前胡苷能显著抑制 P65 的核转位和抑制
核 P65 的磷酸化，以及抑制 NF-κB P65 的 DNA结合
力，提示是其抗哮喘鼠气道炎性反应和高反应的重
要机制。总之，通过本文研究表明紫花前胡苷具有
抗哮喘作用，具有很好的研究和开发价值。
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