全 文 ：安徽科技学院学报，2013，27(3) :33 ～ 36
Journal of Anhui Science and Technology University
收稿日期:2013 － 03 － 20
基金项目:安徽省高等学校省级自然科学研究项目(KJ2013Z273)。
作者简介:朱小茜(1978 －) ，女，安徽省庐江县人，硕士，实验师，主要从事植物生物技术研究。
毛豹皮樟组织培养过程中褐化控制研究
朱小茜
(合肥师范学院 生命科学系，安徽 合肥 230061)
摘 要:为降低毛豹皮樟组织培养过程中外植体的褐变程度，提高增殖系数，试验对其不同的外植体(顶
芽、叶片、带腋芽的茎段)、不同的基本培养基和不同的抗褐化剂等进行了研究。结果表明，毛豹皮樟不同
的外植体褐化率不同，其中带腋芽的茎段褐化率最低，30d 时为 72%;1 /3MS 基本培养基中的带腋芽茎段
褐化率最低;维生素 C 与活性炭对外植体褐变均有较好的抑制作用，其中在 1 /3MS 基本培养基中添加 0．
8g /L 的活性炭时外植体褐化率最低，仅为 12%，增殖系数为 4． 5。
关键词:毛豹皮樟;组织培养;褐化;抗褐化剂
中图分类号:S687． 9 文献标识码:A 文章编号:1673 － 8772(2013)03 － 0033 － 04
Study on Browning Prevention
in Tissue Culture of Litsea coreana Var． Lanuginosa
ZHU Xiao － xi
(Department of Life Science，Hefei Teachers College，Hefei 230061，China)
Abstract:In order to increasing proliferation coefficient of tissue culture of Litsea coreana var． Lanuginosa，
browning degree during the tissue culture process of L． coreana var． lanuginosa is considered the key factor of
explants (terminal buds，blades and stems with axillary buds) ，anti － browning agents (active carbon，PVP and
vitamin C)and basic culture media (MS，1 /2MS and 1 /3MS)with were tested in this study． The results indica-
ted that the browning rate changed with different explants，in which stems with axillary buds and explants cul-
tured in 1 /3 MS medium had the lowest browning rates，72% ． It was also found that Vitamin C and active car-
bon could effectively restrain explants from browning，especially the culture medium containing 0． 8 g /L active
carbon led to the minimum browning rate (12%)and maximum proliferation coefficient (4． 5)．
Key words:Litsea coreana Var． lanuginosa;Tissue culture;Browning;Anti － browning agent
毛豹皮樟(Litsea coreana． var． lanuginosa(Migo)Yang et P． H． Huang)属樟科木姜子属，是一种天然的
野生植物，分布在我国的四川、云南、贵州、安徽等地［1 － 2］。毛豹皮樟中主要含有黄酮类化合物、多酚类化
合物、挥发油成分，并含有丰富的矿物元素和氨基酸，不含咖啡碱成分，对造血系统、内分泌系统和神经系
统非常有利［3 － 6］，对非酒精性脂肪性肝炎具有较好的防治作用;降低血糖血脂效果显著［7］。
毛豹皮樟雌雄异株，种子产量少，自然成苗率很低［8］。播种发芽的苗木生长缓慢;又因为其组织中含
有大量的多酚类化合物，致使扦插育苗时较难生根。毛豹皮樟利用价值较高，近年来被过度开发，使其数
量锐减，濒于灭绝。因此，对毛豹皮樟进行组织培养等人工繁育技术的研究具有重要意义，但目前国内外
尚未见报道。本课题组在毛豹皮樟组织培养初步研究中，发现毛豹皮樟中含有较多的酚类化合物，组织培
养时容易发生褐变，抑制了外植体的生长与分化，降低了组织培养的效率，甚至会导致外植体的死亡。本
文对毛豹皮樟组培繁育过程中的褐化问题进行了研究，以期降低其褐化率，提高增殖系数，为建立毛豹皮
樟组培快繁体系提供科学依据。
1 材料与方法
1． 1 试验材料及消毒
供试外植体材料 2012 年 3 月采自安徽宁国板桥自然生态保护区，取长势良好的毛豹皮樟健壮新稍和
新生叶片，立即用流水冲洗掉表面尘土。在超净工作台上，用 75%的酒精消毒约 20s，无菌水漂洗 4 次，再
用 0． 1%的升汞消毒 10min，无菌水漂洗 5 次，备用。
1． 2 试验设计及方法
1． 2． 1 不同外植体的褐化现象 取顶芽、带腋芽的幼嫩茎段、完全伸展的新生叶片为外植体，切成大小适
合的小块接种在 1 /3MS + 6 － BA1． 5mg /L + IBA 0． 5mg /L +蔗糖 25g /L +琼脂 6． 5g /L的培养基中进行培
养，pH为 5． 6 ～ 5． 8。顶芽取长约 1cm，叶片切为边长约 1cm的方形，而茎段切取约 1 ～ 1． 5cm长。共 3 个
处理，每个处理 30 瓶，每瓶接种 1 个外植体，重复 3 次。
1． 2． 2 不同基本培养基对褐化的抑制 切取长约 1 ～ 1． 5cm的带腋芽茎段，接种于培养基中。基本培养
基分别为 MS、1 /2MS、1 /3MS，每种培养基中都添 6 － BA1． 5mg /L + IBA 0． 5mg /L +蔗糖 25g /L +琼脂 6．
5g /L，pH为 5． 6 ～ 5． 8。每个处理 30 瓶，每瓶接种 1 个外植体，重复 3 次。
1． 2． 3 不同抗褐化剂对外植体褐化现象的抑制 在1 /3MS +6 － BA1． 5mg /L + IBA0． 5mg /L +蔗糖25g /L +
琼脂 6． 5g /L培养基上分别添加不同种类和不同浓度的抗褐化剂:活性炭(0． 4、0． 8、1． 2g /L)、聚乙烯吡咯烷
酮(PVP) (0． 5、1． 0、1． 5g /L)、维生素 C(0． 2、0． 4、0． 8g /L) ，以不添加任何抗褐化剂的培养基为对照，pH为 5．
6 ～5． 8。取长为 1 ～1． 5cm的带腋芽茎段为外植体，每个处理 30 瓶，每瓶接种 1个外植体，重复 3次。
1． 2． 4 培养条件 培养温度为(24 ± 1)℃，光照时间为 12h /d，光照强度 2000lx。
1． 2． 5 结果统计 每隔 5d观察记录外植体的褐化及分化情况，30d后进行数据统计。
褐化率 =(褐化外植体数 /接种外植体数)× 100%
增殖系数 =增殖芽总数 /接种芽总数
褐化程度采用目视法，“+ + +”表示重度褐化，“+ +”表示中度褐化，“+”表示轻度褐化。
2 结果与分析
2． 1 不同外植体的褐化反应
毛豹皮樟不同外植体组织培养的褐化程度不同，结果如图 1所示。从图 1中可以看出，取叶片作为外植体，
30d时外植体全部褐变，褐化率达到 100%，褐化程度最严重，培养基表面产生大面积的褐色物质。带腋芽茎段
的褐化率为 72%，比以叶片为外植体时降低了 28%，褐化程度最轻;顶芽的褐化程度居中，30d时褐化率为 79%。
这可能是因为毛豹皮樟叶片内含有大量的多酚类化合物，接种前又切成小块材料，损伤面较大，使得其中较多的
酚类化合物发生氧化反应，形成大量有毒的醌类物质，扩散到培养基中，导致整个外植体褐变。这在卡德兰和巨
桉的离体培养中也得到了验证［9］。顶芽的褐化率高于带腋芽的茎段，可能是受位置效应影响。顶芽的物质代谢
活跃，多酚类化合物含量较多，同时内源激素含量不同，导致褐化率较高。
图 1 不同外植体对褐化的影响 图 2 不同基本培养基对褐化的影响
Fig． 1 Effect of different explants on browning Fig． 2 Effect of different media on browning
43 安徽科技学院学报 2013 年
2． 2 不同基本培养基对褐化的影响
不同基本培养基上带腋芽茎段的褐化情况如图 2 所示。由图 2 可以看出，利用不同的基本培养基对
毛豹皮樟进行组织培养时，其褐化的程度也不同。其中 1 /3MS 培养基中外植体褐化率最低，其防褐化效
果最好。接种 5d后各培养基中开始出现褐变，随时间的推移，褐化率增加，褐化程度增强。在接种 30d
时，1 /3MS培养基中的褐化率为 72%，褐化程度相对较轻，且有少量丛生芽产生，但 1 /2MS 培养基中褐化
率为 81%，无丛生芽产生，MS培养基中则高达 98%，外植体几乎全部褐化枯萎。基本培养基对植物细胞
褐化影响较大，培养基中无机盐浓度过高可引起酚类外溢物质的大量产生，导致外植体褐化;降低无机盐
浓度，则可以减少酚类化合物外溢，减轻褐化，促进芽的分化。
2． 3 不同抗褐化剂对褐化的影响
往培养基中添加不同浓度的抗褐化剂，毛豹皮樟带腋芽茎段的褐化及生长情况如表 1 所示。由表 1
可以看出，活性炭对毛豹皮樟外植体起到抗褐化的作用，其中在附加 0． 8g /L 活性炭的培养基中褐化率最
低。未加任何抗褐化剂时，30d后外植体的褐化率高达 72%，增值系数仅为 0． 3。附加 0． 4g /L 活性炭时，
30d 后其褐化率降至 20%，且褐化程度较轻，增殖系数为 4． 1。在附加 0． 8g /L 活性炭时，30d 后褐化率降
为 12%，褐化程度最轻，产生大量丛生芽且生长较好，增殖系数增加至 4． 5，如图 3 所示。活性炭浓度增加
至 1． 2g /L时，前期褐化程度相对较轻，但培养至 30d时褐化率增加至 14%，丛生芽生长缓慢，增殖系数又
降为 3． 8。在培养基内加入活性炭后，褐变率降低，增殖系数增大，但随着活性炭浓度的增加，增殖系数又
减小，丛生芽生长缓慢。这是因为活性炭是一种吸附性较强的无机吸附剂，高浓度的活性炭在吸附培养基
中有害物质的同时，也吸附了培养基中较多的营养成分［10］，使芽分化减少，分化出的丛生芽生长减慢。活
性炭能有效抑制毛豹皮樟组织培养中褐化现象，但必须选择合适的浓度。
表 1 不同抗褐化剂对褐化及增殖系数的影响
Table 1 Effect of different anti － browning agents on browning and proliferation coefficient
编号 处理(g /L) 接种数 褐化数 褐化率(%) 褐化程度 增殖系数
1 0(CK) 90 65 72 + + + 0． 3
2 维生素 C 0． 2 90 29 42 + + 2． 4
3 维生素 C 0． 4 90 36 40 + + 2． 6
4 维生素 C 0． 8 90 39 37 + + 3． 5
5 活性炭 0． 4 90 18 20 + 4． 1
6 活性炭 0． 8 90 11 12 + 4． 5
7 活性炭 1． 2 90 13 14 + 3． 8
8 PVP 0． 5 90 51 56 + + + 0． 7
9 PVP 1． 0 90 56 62 + + + 0． 6
10 PVP 1． 5 90 60 66 + + + 0． 4
由表 1 还可以看出，添加 VC的培养基中，随 VC浓度的增加，外植体的褐化率也明显降低，褐化程度
得到了有效的控制。添加 0． 8g /L VC时褐化率只有 37%，比对照组降低了 35%，增殖系数为 3． 5，丛生芽
生长状况良好，如图 4 所示。当 VC浓度提高时，褐化程度相对稍有减轻，但芽的分化及生长情况反而变
差。加入 VC后外植体褐化率明显降低，这是因为 VC改变了外植体周围的氧化还原电势，抑制了多酚类
化合物的氧化，同时作为辅酶还参与了酶系的其他反应，从而减轻褐化程度［10］。
在培养基中加入 0． 5 ～ 1． 5g /L PVP，接种 30d后，外植体褐变率达到 56% ～ 66%，褐化率稍有降低但
褐化程度仍较严重，增殖系数增幅不大，如图 3 所示。所以此次试验中 PVP 的抗褐化和促进分化效果均
不不明显。这可能是因为在植物体内存在着不同的多酚类化合物，而毛豹皮樟中的一些多酚类化合物不
能被 PVP吸收。
53第 27 卷第 3 期 朱小茜 毛豹皮樟组织培养过程中褐化控制的研究
图 3 不同抗褐化剂处理带腋芽茎段的褐化和生长情况
Fig． 3 The browning and growth of stem with axillary buds cultured in different anti － browning agents
注:A—0． 8g /L 活性炭;B—0． 8g /L 维生 C;C—1． 0g /L PVP
3 结论
3． 1 不同外植体的褐化反应
取毛豹皮樟叶片作为外植体进行组织培养时，褐化率达到 100%，全部死亡;取带腋芽的茎段时，其褐
化率为 72%，褐化程度最轻;顶芽的褐化程度居中。这可能与切取的外植体的生长部位和面积大小有关。
3． 2 培养基成分对毛豹皮樟外植体褐化的影响
试验研究发现，培养基成分对毛豹皮樟外植体的褐化有着一定影响。1 /3MS 培养基中的外植体褐化
率最低为 72%，比 MS培养基中外植体褐化率降低了 26%，褐化程度最轻。培养基中含有高浓度的无机
盐会产生大量的酚类外溢物质，导致褐化加重。所以适度降低培养基中无机盐浓度，有利于减轻毛豹皮樟
外植体褐化。
3． 3 抗褐化剂对褐化的影响
在毛豹皮樟组织培养过程中，添加防褐剂都能一定程度的抑制褐变现象。其中活性炭的抑制作用最
明显，在浓度为 0． 8g /L时效果最好，褐化率降至 12%，且增值系数最大达 4． 5，新生芽生长旺盛。添加 VC
的培养基中，随 VC浓度的提高，褐化率逐渐降低，褐化程度得到了有效的控制，在 VC 浓度为 0． 8g /L 时，
褐化率降至 37%，增值系数为 3． 5。在培养基中加入 0． 5 ～ 1． 5 g /L PVP，抗褐化效果皆不明显。
4 讨论
引起褐变的因素是多方面的，包括植物的品种、外植体的类型、生理状态、生长条件、生长部位和大小
等 。Bonga等研究认为外植体越小，褐变的几率就越高，但外植体过大又不利于消毒。所以选取毛豹皮樟
组织培养的外植体时，应在当年生的嫩梢上切取约 1． 5cm 长的带腋芽茎段，在切取时还应尽可能的减小
伤口，以降低褐化率。
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(责任编辑:李孟良)
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