全 文 ：【摘 要】 目的 观察赶山鞭中四个黄酮化合物对PC12细胞DNA氧化应激损伤的防护作用，探讨赶山鞭防治心衰的
机理和有效成分。方法 体外细胞培养，H2O2处理PC12细胞复制氧化损伤模型。MTT测定细胞存活率，单细胞电泳分析
DNA损伤。结果 与对照组相比，四个黄酮大剂量组的细胞存活率升高（P<0.05，P<0.01），其作用强度依次为槲皮素>槲皮
素-3’-O-L-鼠李糖苷>槲皮素-4’-O-β-D-葡萄糖苷>槲皮素-3’-O-β-D-葡萄糖苷。慧星出现率降低（P<0.01）。结论 四
种化合物均对H2O2导致的细胞氧化损伤有防护作用。
【关键词】 赶山鞭；槲皮素；槲皮素-3’-O-L-鼠李糖苷；槲皮素-4’-O-β-D-葡萄糖苷；槲皮素-3’-O-β-D-葡萄糖
苷；抗氧化
【中图分类号】 R285.5 【文献标识码】 A 【文章编号】 1007-1334（2006）12-0068-03
赶山鞭黄酮化合物抗PC12细胞DNA氧化应激损伤的作用
董建勇 1 贾忠建 2 高丽萍 2
1.温州医学院药学院 （浙江 温州 325035） 2.兰州大学 （甘肃 兰州 730000）
赶山鞭（HypericumatenuatumChoisy）是藤黄科金
丝桃属植物，为民间常用的中草药。其性味苦平，具有
止血、镇痛、通乳等作用［1］。内蒙古呼伦贝尔盟地区用赶
山鞭治疗克山病，证实在改善慢性克山病主观症状的同
时，还对异位心律、肝脏肿大、浮肿、颈静脉充盈等心衰
体征有较好的疗效，对心功能不全、心肌代谢紊乱和心
律失常有一定改善作用［2］。现代研究表明，氧自由基生
成过多和抗氧化功能减弱出现氧化应激是心力衰竭发
生发展的重要因素之一。为研究赶山鞭治疗心衰的机
理和有效成分，我们对赶山鞭化学成分进行了初步研究
（已另文发表）。从中分到了多个黄酮类化合物，对其中
四个化合物进行抗氧化生物活性研究，现报道如下。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 试剂 DMEM培养基（Gibco公司）；新生小牛血
清（杭州四季青生物公司）；3-（4，5-二甲基噻唑基）-2，
5-二苯基四氮唑溴化物（MTT），十二烷基硫酸钠
（SDS），谷酰胺，琼脂糖，低溶点琼脂糖（Sigma公司）；二
甲基亚砜（DMSO）（上海试剂一厂）；其余试剂均为国产
分析纯。
1.1.2 仪器 DG-3022型酶联免疫检测仪（华东电子
管厂）；电泳仪（上海医用电子仪器厂）；BX-60落射式
荧光显微镜（Olmpus）；CO2培养箱（Shil公司）。
1.1.3 细胞株 大鼠肾上腺嗜铬瘤细胞（PC12），兰州
大学生命科学院细胞生物学研究室提供。
1.1.4 药物 槲皮素，槲皮素-3’-O-β-D-葡萄糖苷，
EfectsofFlavonoidsfrom Hypericum Atemuatum onOxidativeStressInjury
ofPC12CelDNA
DONGJian-Yong1 JIAZhong-jian2 GAOLi-ping2
1.SchoolofPharmacology,WenzhouMedicalColege;
2.LanzhouUniversity
Abstract：
Objective Toobservetheefectofflavonoidsfrom hypericum atemuatum onrelievingoxidativestressinjuryofPC12
celDNA.Method PC12celwasexposedtoH2O2invitrotoestablishoxidativeinjurymodel.MTTstainingwasappliedto
analyzethesurvivalrateofcelandDNAinjurywasdetectedbysinglecelgelelectrophorisi. Results Thecelsurvival
ratesofalthefourflavonoidslarge-dosegroupswerehigherthanH2O2group(P<0.01，P<0.05，quercetin>quercetin-3’-O-
L-rhamnoside>quercetin-4’-O-β-D-glucoside>quercetin-3’-O-β-D-glucoside)，whiletheincidenceofcometswaslower
thanH2O2group (P<0.01). Conclusion Alofthesefourkindsofflavonoidhadprotectiveefectsonoxidativeinjurycel
inducedbyH2O2.
KeyWords：
Hypericumatemuatumchoisy；quercetin；quercetin-3’-O-L-rhamnoside；quercetin-4’-O-β-D-glucoside;quercetin-3’-
O-β-D-glucoside；antioxidativeactivity
[作者简介]董建勇(1963-),男,山东成武人,博士,副教授,主要
从事中药及天然药物研究。
·68· 上海中医药杂志 2006年第40卷第12期 SH.J.TCM Dec.,2006;Vo1.40No.12
DOI:10.16305/j.1007-1334.2006.12.032
由表1可知，H2O2组与对照组相比差异有极显著
性（P<0.01），PC12细胞经250μmol/LH2O2处理24h
后细胞存活率明显下降；槲皮素，槲皮素-3’-O-L-鼠李
糖苷低、中、高3个剂量组，槲皮素-4’-O-β-D-葡萄糖
苷中、高2个剂量组，槲皮素-3’-O-β-D-葡萄糖苷高
剂量组与H2O2组比较细胞存活率升高，差异均有极显
著性（P<0.01），提示赶山鞭中四种黄酮化合物能够减
轻H2O2对PC12细胞的氧化损伤。
2.2 槲皮素及苷体外对 H2O2引起的 PC12细胞 DNA
损伤的保护作用（表2）
槲皮素-4’-O-β-D-葡萄糖苷，槲皮素-3’-O-L-鼠李糖苷。
均为从药用植物赶山鞭中分离的主要成分，纯度为98%。
1.2 方法
1.2.1 体外对 H2O2引起的 PC12细胞死亡的影响
用250μmol/LH2O2将PC12细胞处理24h的方法复制
氧化损伤模型。PC12细胞用含15%小牛血清和2mmol/L
谷酰胺的DMEM培养基在 37℃、95%空气、5%CO2条
件下培养24h。将4×104个/ml处于对数生长期的PC12
细胞悬液加入96孔板中，每孔100μl，培养24h后，除
空白对照外，其余孔中加入不同浓度的四种药液，每个
浓度各设 5平行。继续培养 48h后各孔均加入 250
μmol/LH2O2处理24h。小心吸去药液，每孔内分别加
入10μlMTT(5mg/ml)和90μl新鲜培养液继续培养4
h，吸去培养液，加入100μl10%SDS，振荡5min,在
ELESA酶标仪上测出A490。用吸光值表示其相对细胞
存活率。
1.2.2 体外对 H2O2引起的 PC12细胞 DNA损伤的影
响 采用单细胞电泳法［3～4］。PC12细胞用含15%小牛血
清和2mmol/L谷酰胺的DMEM培养基在37℃、95%空
气、5%CO2条件下培养24h。将4×104个/ml处于对数生
长期的PC12细胞悬液加入96孔板中，每孔100μl，培
养24h后，除空白对照外，其他每孔加入一种药液，使
终浓度为100μg/ml，每药各设5平行。培养48h后各
孔均加入 250μmol/LH2O2处理 24h。小心地吸去药
液，每孔内分别加入100μl新鲜培养液振荡均匀。
吸取90μl1%正常溶点琼脂糖均匀涂于磨毛的载
玻片上，水平置于冰上成胶5～10min，吸取50μl细胞
液与等体积1%低溶点琼脂糖（37℃）混匀，迅速涂布于
底胶上，水平置冰上成胶5min。将凝固好的微凝胶玻
片放于盛有裂解液的平皿中，裂解1h，取出，放入盛有电
泳缓冲液的电泳槽中，避光静置30min，25V、300mA电
泳1h，中和液中和3次，每次5min，5mg/L碘化吡啶避
光染色15min，以上操作均在4℃进行。用荧光显微镜
观察,放大倍数200，计算出细胞慧星出现率和DNA损
伤抑制率。
1.3 统计方法 用SPSS10.0统计软件包进行数据分
析，计量资料数据以x±s表示，多组间两两比较采用单
因素方差分析判断其统计学意义。
2 实验结果
2.1 槲皮素及苷体外对H2O2引起的PC12细胞死亡的
保护作用（表1）
表1 槲皮素及苷对由H2O2引起的PC12细胞死亡的保护作用（x±s）
组 别 剂 量 A490 细胞存活率（%）
空白组 -- 0.829±0.007 -
H2O2组 250μmol/L 0.427±0.007## 51.5
槲皮素组 1μg/ml 0.443±0.010** 53.4
10μg/ml 0.462±0.009** 55.7
100μg/ml 0.462±0.009** 55.7
槲皮素-3’-O-L-鼠李糖苷组 1μg/ml 0.467±0.014** 56.3
10μg/ml 0.478±0.023** 57.7
100μg/ml 0.484±0.040* 58.4
槲皮素-4’-O-β-D-葡萄糖苷组 1μg/ml 0.432±0.028 52.1
10μg/ml 0.464±0.024* 56.0
100μg/ml 0.469±0.008** 56.6
槲皮素-3’-O-β-D-葡萄糖苷组 1μg/ml 0.440±0.026 53.1
10μg/ml 0.446±0.018 53.8
100μg/ml 0.490±0.013** 59.1
注：与空白组比较，##P<0.01；与H2O2组比较，*P<0.05，**P<0.01。（下同）
上海中医药杂志 2006年第40卷第12期 SH.J.TCM Dec.,2006;Vo1.40No.12 ·69·
由表2可知，慧星出现率H2O2组与对照组相比差
异有极显著性（P<0.01），提示PC12细胞经250μmol/L
H2O2处理24h后细胞DNA出现严重损伤，槲皮素及苷
组与H2O2组相比差异有极显著性（P<0.01）。
3 讨论
心力衰竭的发病机理较复杂，但各种病因通过削弱
心肌舒缩功能是心力衰竭发病的基本机制。而收缩相
关蛋白质破坏、心肌细胞凋亡引起心肌细胞数量减少也
是重要因素之一。心力衰竭时出现氧化应激，氧自由基
（OFR）的主要来源是儿茶酚胺的大量分泌和自氧化；促
炎细胞因子如肿瘤坏死因子、IL-1、IL-6等合成分泌增
加，引起白细胞呼吸爆发，或直接刺激内皮细胞、心肌细
胞产生OFR；黄嘌呤氧化酶激活，OFR产生增多；线粒
体呼吸链功能异常，氧分子的单电子还原增加。这些因
素均可引起心肌细胞凋亡［5］。
PC12细胞株为大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤克隆，是目
前广泛用来研究细胞功能、分化发育和凋亡的一种组织
细胞培育模型［6］。我们的实验结果表明，四种化合物均
对H2O2导致的细胞氧化损伤有保护作用，并能有效阻
止H2O2对细胞DNA的损伤，这可能是赶山鞭治疗克山
病，改善心衰的作用机理之一。其作用强度依次为槲皮
素>槲皮素-3’-O-L鼠李糖苷>槲皮素-4’-O-β-D-葡
萄糖苷 >槲皮素-3’-O-β-D-葡萄糖苷。
黄酮类化合物作为天然产物抗氧化剂已有较多研
究［7～8］。黄酮类化合物能有效地清除O2、OH、1O2等自由
基，抑制脂质过氧化，减少自由基生成量［9］。化合物构效
关系研究表明黄酮类化合物的抗氧化性与化合物结构
中的酚羟基有关［6］。槲皮素有5个酚羟基，而3个槲皮
素苷各有4个酚羟基，这一结果进一步表明黄酮类化合
物的抗氧化性与结构中酚羟基的数目有关。表1结果
还提示槲皮素在3’、4’位上连接的糖的种类与其抗氧
化性强弱也有关，槲皮素-3’-O-L-鼠李糖苷的抗氧化
作用要强于槲皮素-3’-O-β-D-葡萄糖苷。
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组 别 慧星出现率（%） 慧星抑制率（%）
空白组 6.52±2.15 -
H2O2组 75.37±10.62## -
槲皮素 37.83±7.71** 49.81
槲皮素-3’-O-L-鼠李糖苷 41.23±6.67** 45.30
槲皮素-3’-O-β-D-葡萄糖苷 50.79±8.38** 32.61
槲皮素-4’-O-β-D-葡萄糖苷 43.16±9.48** 42.74
表2 PC12细胞慧星出现率及抑制率（x±s）
编辑：季春来
收稿日期：2006-05-15
·70· 上海中医药杂志 2006年第40卷第12期 SH.J.TCM Dec.,2006;Vo1.40No.12