全 文 ：紫参片的 HPLC指纹图谱研究及 5 个成分含量测定*
肖会敏，何悦，王四旺＊＊，谢艳华，赵晶
(第四军医大学药学院药物研究所，西安 710032)
摘要 目的:研究建立紫参片的 HPLC法指纹图谱分析方法，并测定该制剂中藁苯内酯、正丁烯基苯酞、丹参酮Ⅰ、隐丹参酮、
丹参酮ⅡA 的含量，为其质量控制提供依据。方法:利用 HPLC法，采用 Ultimate XB C18色谱柱(250 mm × 4. 6 mm，5 μm) ，使
用乙腈 － 0. 3%磷酸水溶液为流动相进行梯度洗脱，以 260 nm为检测波长。在紫参片样品的 HPLC图中，以丹参酮ⅡA 为对照
参比物，对各色谱峰与丹参酮ⅡA 色谱峰的相对保留时间和相对峰面积的 RSD 进行分析，运用中国药典委员会“中药色谱指
纹图谱相似度评价系统 2004A版”对 10 批紫参片的图谱进行相似度评价。采用外标法，利用藁苯内酯、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ、
丹参酮ⅡA 的混合对照品测定其在 10 批该制剂中的含量。结果:在选定的条件下确定 32 个峰构成紫参片的指纹特征，各批
次样品均具有上述特征，且特征峰的相对含量分布基本一致;各批次样品中丹参酮ⅡA 色谱峰所对应的保留时间一致;每批样
品的各色谱峰与丹参酮ⅡA 色谱峰的相对保留时间和相对峰面积的 RSD均符合指纹图谱的检测要求，10 个批次样品的指纹
图谱相似度均大于 0. 940，5 个物质在 10 批该制剂中的含量基本一致。结论:HPLC指纹图谱方法与 5 个物质的含量测定方法
准确、稳定、简便，均可用于紫参片的质量控制。
关键词:紫参片;高效液相色谱;指纹图谱;藁苯内酯;隐丹参酮;丹参酮Ⅰ;丹参酮ⅡA
中图分类号:R917 文献标识码:A 文章编号:0254 － 1793(2012)10 － 1756 － 06
Study on HPLC fingerprint of Zishen tablets and
determination of five components*
XIAO Hui － min，HE Yue，WANG Si － wang＊＊，XIE Yan － hua，ZHAO Jing
(Institute of Materia，School of Pharmacy，Fourth Military Medical University，Xian 710032，China)
Abstract Objective:To establish an HPLC method for fingerprint analysis of Zishen tablets，and determination of
the contents such as ligustilide，n － butylene(n － butene)phthalide，cryptotanshinone，tanshinone Ⅰ，and tanshi-
noneⅡA，so as to provide a scientific basis for the quality control．Methods:The high performance liquid chromatog-
raphy(HPLC)method was adopted，and Kromasil KR100 － 5C18(250 mm ×4. 6 mm，5 μm)column was used，ace-
tonitrile － 0. 3% phosphoric acid solution was selected as mobile phase adopting gradient elution，and determination
wavelength was 260 nm． In the recorded chromatogram of the test preparation，tanshinoneⅡA was used as reference
substance，and RSD(%)of the relative retention time and the relative peak areas of all peaks compared with its
peak were measured． The similarity of 10 batches of Zishen tablets was appraised by the similarity evaluation sys-
tem． Using the external standard method and mixture reference substance ［ligustilide，n － butylene(n － butene)
phthalide，cryptotanshinone，tanshinone Ⅰ，tanshinoneⅡA］，their contents were determined in the 10 batches of
preparation． Results:In this chromatogram condition，32 peaks were identified as the characteristic fingerprints of
Zishen tablets． Ten batches of Zishen tablet samples showed the same character． The retention time for tanshinone
ⅡA were consistent with each other． RSD(%)of the relative retention time and the relative peak areas of all peaks
compared with tanshinoneⅡA fit the requirements of fingerprint． The fingerprints showed good similarity up to 94%
in 10 batches of Zishen tablets． Five compounds contents were almost the same in 10 batches of preparation． Con-
clusion:The method is accurate，stable and simple，which can be used for quality control of Zishen tablets．
Key words:Zishen tablets;HPLC;fingerprint;ligustilide;cryptotanshinone;tanshinone Ⅰ;tanshinoneⅡA
—6571— 药物分析杂志 Chin J Pharm Anal 2012，32(10)
＊
＊＊
国家科技重大专项课题(2008ZXJ09001 － 013)
通讯作者 Tel:(029)84773752;E － mail:wangsiw@ fmmu． edu． cn
DOI:10.16155/j.0254-1793.2012.10.009
紫参片主要由紫河车、丹参、当归、鸡血藤、甘草
等中药组成。该组方主要用于放疗与化疗的防治。
方中主要活性成分有紫河车中的激素、酶类、细胞因
子、氨基酸等［1］，丹参中的丹参酮类、丹酚酸类［2，3］，
当归中的多糖类、藁苯内酯类及其异构物、香豆素
类、黄酮类、挥发油和有机酸［3 ～ 5］，鸡血藤中主要含
有黄酮、酚、三萜及甾醇等类化合物［4］，甘草中主要
成分有甘草酸、甘草苷等［5，6］。本处方采用水提与
醇［6］，经喷雾干燥［7］、压片、包衣制成。为表征该方
中的主要有效成分，笔者采用高效液相色谱法对其
进行分析，参照中药注射剂指纹图谱的有关技术要
求［6］进行试验;同时对该制剂中 5 个脂溶性成分即
藁苯内酯、正丁烯基苯酞、丹参酮Ⅰ、隐丹参酮、丹参
酮ⅡA 进行定量分析。
1 仪器与试药
Waters高效液相色谱仪，包括四元泵，Alliance
2695分离单元，2996 二极管阵列检测器，在线脱气
机，自动进样器，柱温箱，Empower 色谱工作站;德国
塞多利斯电子分析天平，1 /10 万克，型号 ME235S;
SK250 － LHC超声波发生器(上海科导超声仪器有限
公司)。乙腈、甲醇为色谱级，美国Honeywell公司;水
为采用 Millipore纯水仪(北京同泰联科技发展公司)
自制超纯水;其余试剂为分析纯。藁苯内酯、正丁烯
基苯酞、丹参酮Ⅰ、隐丹参酮、丹参酮ⅡA 的对照品均购
自中国食品药品检定研究院;紫参片(批号 20100220，
20100315，20100325，20100410，20100425，20100510，
20100525，20100610，20100620，20100720) ，中国人民
解放军第四军医大学药物研究所研制。
2 指纹图谱测定方法与结果
2. 1 色谱条件 色谱柱为 Ultimate(XB － 5C18，
250 mm ×4. 6 mm) ;流动相:乙腈(A)－ 0. 3%磷酸
水溶液溶液(B) ，梯度洗脱(0 ～ 45 min，10% A→
64%A;45 ～ 60 min，64% A→99% A:60 ～ 70 min，
99%A;70 ～ 75 min，99% A→10% A;记录时间为 75
min;体积流量:1. 0 mL·min －1;柱温:25 ℃;检测波
长:260 nm;进样量:20 μL。
2. 2 参比物溶液与供试品溶液的制备
2. 2. 1 参比物溶液 精密称取丹参酮ⅡA 对照品
适量，加流动相制成质量浓度为 0. 5 mg·mL －1的溶
液，摇匀，即得。
2. 2. 2 供试品溶液 取 10 片本品，去除薄膜衣，研
成细粉，称取 2. 0 g，精密称定，置于 10 mL 量瓶中，
加 70%甲醇适量，超声 30 min，放凉，加 70%甲醇至
刻度，摇匀，滤过(0. 45 μm 滤膜) ，滤液作为供试品
溶液。
2. 3 方法学考察
2. 3. 1 精密度试验 取供试品溶液(样品批号
20100220) ，连续进样 6 次，分别对共有峰的相对保
留时间和相对峰面积进行考察。结果表明，各共有
峰相对保留时间的 RSD 小于 0. 5%;相对峰面积的
RSD小于 3. 0%，表明仪器精密度良好。
2. 3. 2 稳定性试验 取供试品溶液 (批号
20100220) ，分别于 0，2，4，8，12，24 h 进样分析，考
察共有峰的相对保留时间和相对峰面积。结果表
明，各共有峰相对保留时间的 RSD小于 1. 0%，相对
峰面积的 RSD小于 3. 0%，表明供试品溶液在 24 h
内稳定性良好。
2. 3. 3 重复性试验 取样品(批号 20100220)6 份，
分别按供试品溶液的制备与检测方法进行检测，分别
对共有峰的相对保留时间和相对峰面积进行考察。
结果表明，各共有峰相对保留时间的 RSD 小于
0. 5%，相对峰面积的 RSD小于 3. 0%，表明重复性良
好。
2. 3. 4 指纹图谱建立与相似度分析 取 10 批样
品，分别按供试品溶液的制备与检测方法进行检测，
记录指纹图谱(图 1) ，峰 32 为丹参酮ⅡA，建立指纹
图谱。10 批样品共有色谱峰相对保留时间的 RSD
均小于 0. 3%，相对峰面积的 RSD 均小于 5. 0%，符
合指纹图谱研究技术的要求，见图 1、图 2。运用中
国药典委员会“中药色谱指纹图谱相似度评价系统
2004 A 版”对 10 批紫参片的指纹图谱进行相似度
分析，首先将色谱工作站数据导入中药指纹图谱相
似度计算软件，选定 32 个共有峰进行谱峰匹配，通
过中位数矢量计算得出样品指纹图谱的共有模式，
并以此共有模式为标准，进行整体相似度评价，结果
相似度为 0. 940 ～ 0. 995，表明这 10 批紫参片的化
学成分一致性较好。
3 含量测定方法与结果
3. 1 色谱条件 同“2. 1”项。
3. 2 对照品储备液的制备 分别精密称取对照品
蒿本内酯 2. 64 mg、正丁烯基苯酞 2. 10 mg、丹参酮
ⅡA 6. 02 mg、隐丹参酮 4. 28 mg、丹参酮Ⅰ 4. 22 mg，
置于 10 mL 量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇
匀，即得。
3. 3 供试品溶液的制备 同“2. 2. 2”项。
3. 4 线性关系的考察 分别精密量取对照品储备
液 0. 05，0. 10，0. 20，0. 40，1. 0 mL 于 10 mL 量瓶中
并加甲醇稀释至刻度，用0. 45μm微孔滤膜滤过，
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图 1 紫参片 HPLC指纹图谱
Fig 1 HPLC fingerprints for Zishen tablets
1 ～ 32．特征指纹峰(characteristic fingerprint peak) 27．藁苯内酯(ligustilide) 28．正丁烯基苯酞［n － butylene(n － butene)phthalide］ 30．丹参
酮Ⅰ(tanshinoneⅠ) 31．隐丹参酮(cryptotanshinone) 32．丹参酮ⅡA(参照物) ［tanshinoneⅡA(reference object) ］
图 2 10 批紫参片的 HPLC指纹图谱
Fig 2 HPLC fingerprints of 10 batches of Zishen tablets
进样。分别以各对照品的浓度(X)为横坐标，峰面
积积分值(Y)为纵坐标绘制标准曲线，计算，得回归
方程，结果见表 1，表明各化合物在相应浓度范围内
线性关系良好。
表 1 各化合物的线性方程及其浓度范围
Tab 1 Linear equations and concentration ranges of 5 compounds
化合物
(compound)
线性范围
(concentration range)/μg·mL －1
线性方程
(linear equations)
r
藁本内酯(ligustilide) 1. 32 ～ 26. 40 y1 = 1. 342 × 105x1 － 1613 0. 9997
正丁烯基苯酞［n － butylene(n － butene)phthalide］ 1. 05 ～ 21. 00 Y =1. 330 × 105X +1. 7691 × 104 0. 9995
丹参酮Ⅰ(tanshinoneⅠ) 2. 11 ～ 42. 20 Y =4. 902 × 104X +1. 684 × 103 0. 9996
隐丹参酮(cryptotanshinone) 2. 14 ～ 42. 80 Y =4. 880 × 104X +1. 037 × 104 0. 9998
丹参酮ⅡA(tanshinoneⅡA) 3. 01 ～ 60. 20 Y =5. 266 × 104X －6. 216 × 104 0. 9998
3. 5 精密度试验 精密吸取上述线性对照品溶液
(0. 20 mL 对照品储备液加甲醇定容至 10 mL)20
μL，连续进样 5次，测得蒿本内酯、正丁烯基苯酞、丹
参酮Ⅰ、隐丹参酮、丹参酮ⅡA 的 RSD 分别为 1. 1%，
—8571— 药物分析杂志 Chin J Pharm Anal 2012，32(10)
1. 0%，1. 2%，1. 0%，1. 3%，表明仪器精密度良好。
3. 6 重复性试验 精密称取样品溶液(批号
20100220)5份，分别按“2. 2. 2”项下方法制备供试品
溶液，按“2. 2. 1”项下条件测定。结果蒿本内酯、正丁
烯基苯酞、丹参酮Ⅰ、隐丹参酮、丹参酮ⅡA 平均含量与
RSD分别为 63. 23 μg·g －1，1. 9%;38. 96 μg·g －1，
1. 6%;99. 49μg·g －1，1. 3%;105. 31 μg·g －1，1. 9%;
102. 51 μg·g －1，1. 9%。表明该方法重复性良好。
3. 7 稳定性试验 精密吸取上述线性对照品溶液
(0. 20 mL 对照品储备液加甲醇定容至 10 mL) ，在
第 0，2，4，8，12，24 h 进样。结果蒿本内酯、正丁烯
基苯酞、丹参酮Ⅰ、隐丹参酮、丹参酮ⅡA 的峰面积
的 RSD 分别为 1. 0%，1. 3%，1. 1%，1. 3%，1. 4%，
表明该溶液在 24 h内稳定。
3. 8 加样回收率试验 取紫参片(批号 20100220，
其中蒿本内酯、正丁烯基苯酞、丹参酮Ⅰ、隐丹参酮、丹
参酮ⅡA 分别为 63. 23，38. 96，99. 49，105. 31，102. 51
μg·g －1)10 片，除去薄膜衣，研细，称取粉末 1. 0 g，
精密称定，分别加“3. 2”项下对照品储备液 0. 20 mL
或0. 30 mL或0. 40 mL，照“2. 2. 2”项下方法制备供试
溶液，重复制样 6 份，按照“2. 1”项下色谱条件测定。
结果详见表 2，表明该方法回收率良好。
表 2 加样回收率试验结果
Tab 2 Sample recovery test results
名称
(title)
称样量
(sample
weight)
/μg
取样相当量
(content in
the sample)
/μg
添加的对照品的量
(added reference
substance weight)
/μg
测出目标物的总量
(determined total
content of target
chemical compound)/μg
回收率
(recovery
rate)
/%
平均回收率
(average
recovery
rate)/%
RSD
/%
蒿本内酯(ligustilide) 1. 45337 91. 90 52. 80 144. 29 99. 2 99. 1 0. 37
1. 09221 69. 06 52. 80 121. 28 98. 9
1. 34624 85. 12 79. 20 163. 41 98. 9
1. 10498 69. 87 79. 20 148. 74 99. 6
1. 33045 84. 12 105. 60 189. 13 99. 4
1. 13456 71. 74 105. 60 175. 76 98. 5
正丁烯基苯酞 1. 45337 56. 62 42. 00 98. 19 99. 0 99. 3 0. 47
［n － butylene(n 1. 09221 42. 55 42. 00 84. 38 99. 6
－ butene)phthalide］ 1. 34624 52. 45 63. 00 114. 64 98. 7
1. 10498 43. 05 63. 00 105. 43 99. 0
1. 33045 51. 83 84. 00 135. 93 100. 1
1. 13456 44. 20 84. 00 127. 80 99. 5
丹参酮Ⅰ(tanshinoneⅠ) 1. 45337 144. 60 84. 40 227. 69 98. 5 99. 2 0. 63
1. 09221 108. 66 84. 40 192. 79 99. 7
1. 34624 133. 94 126. 60 260. 58 100. 0
1. 10498 109. 93 126. 60 235. 58 99. 3
1. 33045 132. 37 168. 80 300. 10 99. 4
1. 13456 112. 88 168. 80 278. 79 98. 3
隐丹参酮(cryptotanshinone) 1. 45337 153. 05 85. 60 237. 33 98. 5 99. 2 0. 83
1. 09221 115. 02 85. 60 200. 06 99. 4
1. 34624 141. 77 128. 40 271. 26 100. 9
1. 10498 116. 37 128. 40 243. 42 99. 0
1. 33045 140. 11 170. 80 309. 46 99. 2
1. 13456 119. 48 170. 80 287. 46 98. 4
丹参酮ⅡA(tanshinoneⅡA) 1. 45337 148. 98 120. 40 268. 17 99. 0 99. 1 0. 62
1. 09221 111. 96 120. 40 232. 90 100. 5
1. 34624 138. 00 180. 60 316. 16 98. 7
1. 10498 113. 27 180. 60 292. 11 99. 0
1. 33045 136. 38 240. 80 374. 42 98. 9
1. 13456 116. 30 240. 80 353. 93 98. 7
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3. 9 样品含量测定 精密称取 10 批样品，分别按
“2. 2. 2”项下方法制备供试品溶液，按“3. 1”项下条
件测定。结果见表 3。
表 3 10 批样品中 5 个化合物的含量测定结果(μg·片 －1)
Tab 3 Assay results of the five components in 10 batches of samples(μg per tablet)
批号
(batche)
称样量
(sample
weight)
/g
蒿本内酯
(ligustilide)
正丁烯基苯酞
［n － butylene(n －
butene)phthalide］
丹参酮 I
(tanshinoneⅠ)
隐丹参酮
(cryptotanshinone)
丹参酮ⅡA
(tanshinoneⅡA)
20100220 1. 65521 44. 26 27. 27 69. 64 73. 72 71. 76
20100315 3. 55068 43. 36 26. 38 66. 25 69. 48 72. 16
20100325 2. 19364 44. 24 26. 45 68. 25 72. 74 70. 11
20100410 1. 94148 43. 44 26. 52 67. 00 71. 07 71. 92
20100425 1. 69323 44. 33 26. 91 68. 35 73. 05 70. 91
20100510 2. 10521 43. 62 26. 39 68. 22 73. 07 73. 81
20100525 2. 02991 44. 91 26. 79 69. 81 69. 78 73. 23
20100610 2. 04874 43. 68 26. 08 68. 41 71. 37 72. 35
20100620 3. 35222 44. 07 26. 74 69. 94 71. 44 69. 00
20100720 3. 27781 43. 81 26. 54 68. 89 71. 31 71. 17
平均含量(average content) 43. 97 26. 61 68. 48 71. 70 71. 51
/μg·片(tablet)－ 1
RSD /% 1. 1 1. 3 1. 7 2. 0 1. 9
4 分析与讨论
4. 1 波长的选择 采用全波长对紫参片样品进行
测定，并采集其三维色谱图，通过综合考虑该三维色
谱图在所有波长下出峰的多少，和各成分的分离情
况以及各色谱峰的丰度，最后选定检测波长为 260
nm。
4. 2 流动相的确定 比较了 3 种流动相系统及其
不同流动相比例，包括甲醇 －水、乙腈 －水、乙腈 －
1. 0%醋酸水溶液以及乙腈 － 0. 3%磷酸水溶液，比
较的磷酸浓度有 0. 1%，0. 3%，0. 6%，1. 0% 水溶
液。结果表明，各种流动相中以乙腈 － 0. 3%磷酸水
溶液系统为最佳，其图谱上各个色谱峰的分离度较
好，保留时间适中，因此选此流动相系统作为紫参片
HPLC指纹图谱检测的流动相。
4. 3 色谱柱与仪器的考察 选择了不同填料、规格
及厂家的色谱柱进行比较，包括 Phenomenex Luna
C18(250 mm × 4. 6 mm，5 μm )、AKZONOBLE Kro-
masil C18(250 mm × 4. 6 mm，5 μm)、Ultimate XB
C18，(250 mm × 4. 6 mm，5 μm)以及 Thermo ODS
(250 mm ×4. 6 mm，5 μm)。结果表明，各种色谱柱
中以 Ultimate XB C18为最佳，所得色谱图峰数目较
多，峰面积较大，分离度良好，因此选此色谱柱作为
紫参片 HPLC指纹图谱检测的色谱柱。按优化色谱
条件，采用岛津 LC － 2010AHT HPLC 仪进样检测，
结果与 Waters － Alliance 2695 － 2996 色谱仪的结果
基本一致，表明不同采用仪器的重复性良好。
4. 4 制样方法 比较了甲醇与水超声提取、甲醇超
声与浸渍提取、不同浓度的甲醇(50%，60%，70%，
80%，90%)、超声时间(10，20，30，40，50，60 min)。
结果表明:①水不能提取脂溶性成分，而甲醇对脂溶
性与水溶性成分均能提取但水溶性成分峰面积较
小;②超声提取出峰多、峰面积大、时间短，而浸渍提
取则相反;③甲醇超声 30 min 以后各个峰的面积不
增加;④不同浓度的甲醇提取随甲醇浓度的增加脂
溶性部分峰面积增加，水溶性峰面积减小。综合上
述各因素选择 70%甲醇超声 30 min提取，得峰面积
较大、峰个数较多、分离度较好。
4. 5 其他 比较了不同柱温与流速，柱温超过 25
℃分析时间缩短，但大多数色谱峰分离度小或不能
分开;流速低于 1. 0 mL·min －1分析时间过长，高于
1. 0 mL·min －1大多数色谱峰分离度差。因此选择
便于控制的柱温 25 ℃与流速 1. 0 mL·min －1。
综上所述，经过试验确定了紫参片的 HPLC 指
纹图谱分析方法，同时测定了 10 批次该制剂中的 5
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个物质，含量均一。上述两方法准确、稳定，操作简
单易于实施，同时为规范和优化本品的生产工艺，保
证质量的均一性和稳定性，达到用药安全、稳定的目
的提供了理论依据，因此两方法均可用于紫参片的
质量控制。
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