全 文 ：1 9 9 5 年 9 月
第 2 6卷第 5期
内蒙古大学学 报 (自然科学版 )
A e t a Sc i
e n t i a r u m N a t u r a l i u m U n i
v e r s i t a t i s N e i M o n g g o l ( N a t u r a l段 i e n e e )
eS p
t
.
19 9 5
V o l
.
2 6 N o
.
5
古地中海孑遗植物— 半 日花(万 e z i a n t人。 m u m : o o n g o l i c u m )的组织培养 ’
慈忠玲 张 衡 刘玲玉
(内蒙古林学院治沙系 , 01 0 0 1 9 , 呼和浩特 )
摘要 H . :阳 ng 汉 ic “ m 叶片外植体在 M s 加 IA A 10 m g L/ , 6 一 BA I m g L/ 培养基上
获得愈伤组织 ,然后在 M S 加 IA A S m g L/ , 6一 B A I m g / L 培养基上获得胚状体及试
管苗 . 愈伤组织的诱导及其再分化对 IA A 有特殊的要求 , 2 . 4一 D 不能取代 IA A 的
作用 ,胚状体来源于单个胚性细胞 ,由它经均等或不均等分裂形成的细胞后代继续
发育为各级胚 ,试管苗根系发育不 良 . 作者认为该种的濒危与其胚胎发生关系不
大 ,而胚根的不正常发育可能是导致其濒危的原因之一
关键词 H . : o gn of ic u m 组织培养 胚状体 濒危原因 培养基
中图资料分类号 Q 9 4 4 . 4 6 Q g 4 9 . 7 5 5 . 9
引 言
特有植物和珍稀濒危植物的研究和保护早 已引起世界各国的重视 , 我国已出版《 中国珍稀濒危
植物 》 ( 1 9 8 9 )一书 ,介绍了首批确定的我国珍稀濒危植物 38 8 种 ,并正在编辑出版第二批确定的“ 中
国珍稀濒危植物 ” . 国内有些地区已开展了大量的研究工作 , 但大多数是针对濒危特有植物的区系
特征 、 保护现状 、 濒危的原因及对今后开展研究工作的建议方面 , 组织培养方面的工作近年也有报
道 〔` , ,但对离体培养诱导胚状体发生进而探索其濒危原因方面的工作国内尚未见报道 .
半日花科是地中海植物 区系的特征植物 ,它的现代分布中心在地中海沿岸 . 在我国半 日花科只
有一属一种 ,即半日花 (H ile an t he m u m s o n go l’ cu m ) ,它分布于新疆的准噶尔和 内蒙古鄂尔多斯西
部的桌子 山山麓及其邻近地区 ,呈岛状残遗分布 . 显然是古地 中海植物区系的后裔 , 并且成为亚洲
中部荒漠的特有种 〔2 , . 因而它在研究亚洲中部荒漠 , 特别是研究我国荒漠植物区系的起源以及与地
中海植物区系的联系等方面都有重要的科学价值〔 3 , . 用组织培养的方法和技术对它进行离体培养 ,
探讨体细胞生长和分化的规律 ,诱导胚状体的发生 , 进而使之快速 繁殖 , 既是挽救这一古地中海残
遗植物的重要手段 ,又对探讨其濒危的原因具有重要的参考价值 .
1 材料与方法
以半日花幼苗的叶片为外植体 , 用 1%。的 K M n O . 溶液消毒 , 无菌水冲洗后 , 分别接种于 M S 愈
伤组织培养基 (表 l) 中 ,在温度为 25 士 2℃ ,光照 12 士 l h d/ ,光强 2 5 0 0 lu x 的培养条件下诱导愈伤
内蒙古科委基金资助课题
收稿 日期 : 1 9 9 5一 0 5 一 0 2
第 5期 慈忠玲等 古地中海孑遗植物— 半日花 (从 l必 nt加二 “ , s . n g时 i` “ , )的组织培养
组织 ,筛选出最佳愈伤组织培养基 . 然后将部分愈伤组织转入 M S 分化培养基 (表 2) 中诱导胚状体
的形成 , 从而确定最佳分化培养基 ; 20 d 后 , 随机取样固定于 F A A 固定液中 ,石蜡制片法制片 , 切
片厚 8 拌M ,海式苏木精法染色 .
表 I M S 愈伤组织培养基 表 Z M S 分化培养基
T a b l e 1 M S m e d ia f o r e u ll us (m g /L ) T a b le 2 M S m e山 a f o r s o m a t i e e m b r y o ( m g /L )
烹鳄罗 2 . 4一D 6一 B A I A A , {卜矍 m p o s , t , o n嚣苏乏\ 2 . 4一 D 6一 B A IA A
l )
2 )
6 )
7 )
0
.
1 5
3 )
4 )
0
.
5
0
.
5
8 )
9 )
0
.
1 2 5 5
5 ) 1 1 0 1 0 ) 0 0 0
2 结果与讨论
2
.
1 愈伤组织的诱导及最佳培养基的筛选
1) 号培养基 ,接种后 10 d ,叶片 、 叶柄均失去绿色 ,转成灰黄色或变成黑色 ,无明显的生长现象 ;
1 4 d
,外植体缓慢生长 ,但失去柔软性 ,变脆 ; 24 d , 长出很少一点白色颗粒状愈伤组织 ,生长很慢 .
2 )号培养基 ,接种后 10 d , 没有明显的失绿现象 ; 14 d , 生长不明显 ; 24 d ,诱导 出愈伤组织 , 但
生长缓慢 .
3) 号培养基 , 10 d ,叶柄变黑死亡 , 叶片转变为黄绿色 ,生长不明显 ; 14 d , 仍为黄绿色 ,无 明显
生长 ; 24 d ,诱导出淡绿色愈伤组织 ,长势好 , 已增至原外植体的 3 倍 .
4) 号培养基 , 10 d , 叶转为黄色 ; 14 d 明显生长 , 已增至原外植体体积的 6一 8 倍 ; 24 d ,诱导 出
淡绿色愈伤组织 ,长势一般 .
5) 号培养基 , 10 d ,叶转为淡绿黄色 ,有 明显生长 , 14 d ,整个叶片脱去分化状态 , 转变为疏松的
愈伤组织 ,愈伤组织表面呈紫色 , 下面呈淡绿黄色 ; 24 d , 愈伤组织迅速生长 , 已增至原外植体的 15
倍以上 ,从紫色愈伤组织上又长出绿色 、 白色愈伤组织 ,质地疏松长势最好 .
5) 号培养基从诱导脱分化的时间 、 愈伤组织的生长速度及其发展势态上都明显优于其它四种
培养基 . 40 d 后观察 , 5) 号培养基中的愈伤组织 已增至原外植体的 50 多倍 . 因而确定 5) 号培养基
为愈伤组织最佳培养基 . 从培养基成分来看 , 5) 号培养基用 IA A 取代了 2 . 4一 D ,说 明对半 日花来
说 ,诱导愈伤组织 , I A A 比 2 . 4一D 的作用更显著 . 大多数植物都可在 2 . 4一 D 培养基上诱导 出愈伤组
织 , 加入细胞分裂素可促进愈伤组织的诱导 , 但也有的植物组织只对特殊的生长素类物质做 出反
应 ,有时甚至需要较高的浓度 , H o k e r 和 N a b or s 表明甜菜 ( B et a v ul g ar i : ) 的愈伤组织诱导需要高
浓度 ( 10 一 25 m g / L )I A A ,而 2 . 4一 D 在高于 1 m g / L 时则表现出明显的抑制作用 〔“ . 这与本文的情
况相 符 ,但本实验中 2 . 4一 D 表现抑制作用的浓度则更低 (0 . 5 m g / L ) .
2
.
2 胚状体的诱导及最佳分化培养基的筛选
获得愈伤组织后 , 部分在 5) 号培养基 中继续培养 , 部分转移至分化培养基中 (表 2) .
6 )号和 8) 号分化培养基中 , 7 d 观察 ,愈伤组织生长减慢 , 变为颗粒状 ; 14 d ,分化出球形胚 ,分
化频率很高 , 但在 以后的生长中 ,球形胚不能分化成苗 , 而是失去极性 , 越长越大 , 最后又变为一团
内蒙古大 学学报 (自然科学版 ) 19 9 5年
无分化状态的愈伤组织 (图 )2 .
7 )号分化培养基 7 d观察 , 愈伤组织长势下降 ,多为灰暗色 ; 14 d 分化出许多根 ( 图 3 ) ,但不分
化胚状体及地上器官 .
9) 号和 1 0) 号分化培养基中 , 7 d 观察均有胚状体的发生 . 14 d , 9) 号培养基中愈伤组织生长旺
盛 , 分化也较强 ; 1 0) 号培养基中愈伤组织生长减慢 ,分化加强 . 30 d , 9) 号和 1 0) 号培养基 中均 长出
绿色苗 (图 4 ) , 解剖镜 下可观察到各级胚 . 培养中还发现在 5) 号培养基中培养 ,长时期不继代 , 最终
也分化出胚状体和绿色苗 .
经以上筛选 ,确定 9) 号培养基做为最佳胚状体分化培养基 . 1 0) 号培养基 中未加任何激素 ,也
同样分化 出胚状体 . 这种结果的产生可能与愈伤组织的培养基有关 . 转入分化培养基中的材料都来
自于 5) 号培养基 l( A A 10 m g / L , 6 一 B A I m g / L ) , 当愈伤组织刚刚由 5) 号培养基转入 1 0) 号培养基
中时 ,愈伤组织中所携带的激素是它们分化的基础 . 当分化出原胚以后 ,它们便可以 自己产生激素 ,
培养基中就不需再加激素了 〔5 , . 5) 号培养基 中的材料 ,如果长时间不继代 ,也会分化出胚状体 , 这说
明在培养过程中 I A A 不断被分解 . 生活的组织和器官都能产生 I A A 氧化酶 , 另外光对 I A A 也有
分解破坏作用 . 当 I A A 被降解到一定水平时 ,就启动了分化过程 , 从这个意义上说 ,胚状体的诱导
并不需要较高浓度的 I A A ,但对 I A A 确有一定的依赖性 .
6) 号培养基 (2 . 4一 D 0 . 1 5 m g / L ) 能诱导原胚及球形胚的形成 , 但不能使之继续发 良 . 这种现象
在其它许多植物中也都存在 , 如在含 2 . 4一 D 的培养基 中 ,石龙苗 、 芹菜可发育到圆球胚 ;甘蔗可发
育到鱼雷胚 ;茄子 、 金鱼草等可发育到成熟的胚状体 〔` , . 这是否说明 ,外源人工合成生长素能诱导原
胚的形成 ,但却抑制其进一步发育 . 由于植物体不能分解 2 . 4一 D 等人工合成生长素 ,所以尽管 2 . 4 -
D 浓度很低 ,也仍能对胚的发育起抑制作用 .
7 )
、
8 )
、
9) 号三种培养基相 比较 , I A A 浓度 (5 m g / L )相同 ,所不同的是 6 一B A 浓度 , 6一 B A 从无
到有 ,愈伤组织从生根到形成胚状体 (球形胚 ) , 6一B A 从少 (0 . 1 25 m g / L )到多 l( m g / L ) ,愈伤组织
从形成退化的胚到形成正常的胚状体并发育成试管苗 . 由此看出 ,诱导胚状体的发生及其进一步发
育需要较高浓度的细胞分裂素 (1 m g / L 以上 ) .
细胞分裂素对胚状体发生和发育的影响比较复杂 ,有些实验支持起抑制作用 ,有些实验支持起
促进作用 ; 在生长素和细胞分裂素的配合使用中也有三种情况 , 即 A ) 细胞分裂素抑制生长素诱导
的胚状体发生 ; B ) 细胞分裂素促进生长素诱 导的胚状体发生 ; C )胚状体的发生需要生长素与细胞
分裂 素的配合使用 〔` , ,第三种情况与本文相符 .
对半 日花来说 ,无论是愈伤组织的诱导 , 还是胚状体的发生 , 都是 I A A 最有效 , 同时需要适当
浓度的 6一 B A ,而含 2 . 4 一D 的培养基 , 即使含有适当浓度的 6一 B A ,也不能有效地诱导愈伤组织及胚
状体 ,这说明外植体细胞的脱分化及愈伤组织的再分化对生长素的种类有特殊的要求 , 人工合成生
长素 (2 . 4一 D )对愈伤组织的诱导及胚状体的发育都表现出抑制作用 .
2
.
3 胚状体分化过程的组织学观察
将生长在 9) 和 10 )号分化培养基中的愈伤组织用石蜡制片技术观察其分化状况 . 愈伤组织在
分化培养阶段其内部和表面的个别细胞可以转化为胚性细胞 ,其细胞核大 ,原生质浓 ,无液泡或只
有小液泡 (图 5 ) ,胚性细胞具有旺盛的分裂能力 ,图 5 示胚性细胞的细胞核 已分裂为 2 . 胚性细胞的
第一次分裂可以是均等分裂 ,也可以是不均等分裂 ( 图 6 ) ,胚性细胞经多次分裂形成原胚 (图 7 、 8 ) ,
有些原胚有明显的胚柄和胚体之分 , 原胚可进一步发育为球形胚 、 心形胚 (图 9) 和子叶胚 (图 1 0) 等
各级胚 ,并进一步分化出小植物体 .
内蒙古大 学学报 (自然科学版 ) 1 9 95年
无分化状态的愈伤组织 (图 2 ).
) 7号分化培养基 7d观察 , 愈伤组织长势下降 ,多为灰暗色 ; 14 d 分化出许多根 ( 图 3 ) ,但不分
化胚状体及地上器官 .
9) 号和 1 0) 号分化培养基中 , 7 d 观察均有胚状体的发生 . 14 d , 9) 号培养基中愈伤组织生长旺
盛 , 分化也较强 ; 1 0) 号培养基中愈伤组织生长减慢 ,分化加强 . 30 d , 9) 号和 1 0) 号培养基 中均 长出
绿色苗 (图 4 ) , 解剖镜 下可观察到各级胚 . 培养中还发现在 5) 号培养基中培养 ,长时期不继代 , 最终
也分化出胚状体和绿色苗 .
经以上筛选 ,确定 9) 号培养基做为最佳胚状体分化培养基 . 1 0) 号培养基 中未加任何激素 ,也
同样分化 出胚状体 . 这种结果的产生可能与愈伤组织的培养基有关 . 转入分化培养基中的材料都来
自于 5) 号培养基 l( A A 10 m g / L , 6 一 B A I m g / L ) , 当愈伤组织刚刚由 5) 号培养基转入 1 0) 号培养基
中时 ,愈伤组织中所携带的激素是它们分化的基础 . 当分化出原胚以后 ,它们便可以 自己产生激素 ,
培养基中就不需再加激素了 〔5 , . 5) 号培养基 中的材料 ,如果长时间不继代 ,也会分化出胚状体 , 这说
明在培养过程中 I A A 不断被分解 . 生活的组织和器官都能产生 I A A 氧化酶 , 另外光对 I A A 也有
分解破坏作用 . 当 I A A 被降解到一定水平时 ,就启动了分化过程 , 从这个意义上说 ,胚状体的诱导
并不需要较高浓度的 I A A ,但对 I A A 确有一定的依赖性 .
6) 号培养基 (2 . 4一 D 0 . 1 5 m g / L ) 能诱导原胚及球形胚的形成 , 但不能使之继续发 良 . 这种现象
在其它许多植物中也都存在 , 如在含 2 . 4一 D 的培养基 中 ,石龙苗 、 芹菜可发育到圆球胚 ;甘蔗可发
育到鱼雷胚 ;茄子 、 金鱼草等可发育到成熟的胚状体 〔` , . 这是否说明 ,外源人工合成生长素能诱导原
胚的形成 ,但却抑制其进一步发育 . 由于植物体不能分解 2 . 4一 D 等人工合成生长素 ,所以尽管 2 . 4 -
D 浓度很低 ,也仍能对胚的发育起抑制作用 .
7 )
、
8 )
、
9) 号三种培养基相 比较 , I A A 浓度 (5 m g / L )相同 ,所不同的是 6 一B A 浓度 , 6一 B A 从无
到有 ,愈伤组织从生根到形成胚状体 (球形胚 ) , 6一B A 从少 (0 . 1 25 m g / L )到多 l( m g / L ) ,愈伤组织
从形成退化的胚到形成正常的胚状体并发育成试管苗 . 由此看出 ,诱导胚状体的发生及其进一步发
育需要较高浓度的细胞分裂素 (1 m g / L 以上 ) .
细胞分裂素对胚状体发生和发育的影响比较复杂 ,有些实验支持起抑制作用 ,有些实验支持起
促进作用 ; 在生长素和细胞分裂素的配合使用中也有三种情况 , 即 A ) 细胞分裂素抑制生长素诱导
的胚状体发生 ; B ) 细胞分裂素促进生长素诱 导的胚状体发生 ; C )胚状体的发生需要生长素与细胞
分裂 素的配合使用 〔` , ,第三种情况与本文相符 .
对半 日花来说 ,无论是愈伤组织的诱导 , 还是胚状体的发生 , 都是 I A A 最有效 , 同时需要适当
浓度的 6一 B A ,而含 2 . 4 一D 的培养基 , 即使含有适当浓度的 6一 B A ,也不能有效地诱导愈伤组织及胚
状体 ,这说明外植体细胞的脱分化及愈伤组织的再分化对生长素的种类有特殊的要求 , 人工合成生
长素 (2 . 4一 D )对愈伤组织的诱导及胚状体的发育都表现出抑制作用 .
2
.
3 胚状体分化过程的组织学观察
将生长在 9) 和 10 )号分化培养基中的愈伤组织用石蜡制片技术观察其分化状况 . 愈伤组织在
分化培养阶段其内部和表面的个别细胞可以转化为胚性细胞 ,其细胞核大 ,原生质浓 ,无液泡或只
有小液泡 (图 5 ) ,胚性细胞具有旺盛的分裂能力 ,图 5 示胚性细胞的细胞核 已分裂为 2 . 胚性细胞的
第一次分裂可以是均等分裂 ,也可以是不均等分裂 ( 图 6 ) ,胚性细胞经多次分裂形成原胚 (图 7 、 8 ) ,
有些原胚有明显的胚柄和胚体之分 , 原胚可进一步发育为球形胚 、 心形胚 (图 9) 和子叶胚 (图 1 0) 等
各级胚 ,并进一步分化出小植物体 .
内蒙古大学学报 (自然科学版 ) 1 9 9 5年
胚状体的起源问题 ,越来越多的学者认为起 源于单个胚性细胞〔 7 , ,也有学者认为起源于细胞聚
合体 〔幻 . 我们的观察表明 : 半 日花的胚状体起源于单个胚性 细胞 ,这与前者的观点相符 . 赵洁等 〔10J
对石刁柏的研究证明 , 胚性细胞的第一次分裂是不均等分裂 ,这种不均等分裂的基础在于胚性细胞
亚微结构的不均等分 布 . 在我们的实验 中 , 胚性细胞的第一次分裂可 以是均等分裂 , 也可以是不均
等分裂 ,原胚中有些具有胚柄 ,有些不具有胚柄 . 我们考虑 , 半日花胚状体的发育极性是否在胚性细
胞中就已经确定 , 是否胚性细胞的第一次分裂一定是不均等分裂 (包括亚微结构上的不均等分布 ) ,
或者胚状体的极性是在胚的发育过程中逐步确立的 ,这些问题还有待更进一步的证实 .
半 日花的愈伤组织能诱导出正常的胚状体 , 另外半 日花能产生成熟的种子 , 并且种子能萌发形
成植株这一点也说明它能形成正常的合子 . 因而我们认为半日花的濒危与其胚胎发生关系不大 .
2
.
4 胚状体的发育及合子胚发芽情况的观察
将图 4 中的小植物体转移至无激素培养基 中继续培养 ,苗高达 2 ~ 3 。 m , 但根系发育 不良 ( 图
1 1)
. 为进一步观察根系的生长状况 ,把小植物体分株 ,在无菌水 、 自然光下培养 , 发现小植株的地上
器官发育正常 , 但胚根逐渐膨大退化 , 不能形成根系 (图 1 2) 说 明半 日花的体细胞能形成正常的胚
状体 , 但胚根不能正常发育为根系 . 据此 ,我们对半 日花种子的发芽情况进行 了观察 , 其发芽率大约
在 4 0%左右 ,但出芽不齐 ,最快的需要 7 d ,最慢的需要 20 d ,发芽的种子有 1 3/ 胚根能继续生长 ,
其余都在出芽后不久就停止生长了 . 据此我们考虑胚根的不正常发育或许就是其濒危的原因之一
3 参考文献
1 慈忠玲 , 于福杰 ,魏学坤 . 珍稀濒危树种— 沙冬青体细胞胚胎发生的组织学观察 . 内 蒙古林学院 学报 ,1 9 9 4 , ( 1 ) : 3 6~ 3 9
2 中国科学院内蒙古宁夏综合考察队 . 内蒙古桂被 . 北京 : 科学出版社 , 198 5 . 67 0 ~ 67 3
3 傅立国 . 中国珍稀濒危植物 . 上海 :上海教育出版社 , 198 9 . 10 1
4 S t
r e e t H E
.
P l a n z T i
s s u e a n d eC l l uC l
之u er , S e c o n d e d i t io n . O x f o r d , L o n d o n , E d in b u ig h , M e lb o u r n e : B l a e k -
w
e
ll cS i
e n t i fi
e P u b li
e a t io n s
,
1 9 8 3
.
1 2~ 1 3
5 刘春明 ,姚敦义 . 陆地棉体细胞胚胎发生及其细胞组织学研究 . 桂物 学报 , l ” 1 , 3 3 ( 5 ) : 37 8~ 38 4
6 周俊彦 . 植物体细胞在组织培养中产生的胚状体 . 桂物生理学报 , 1 98 2 , ( 1 ) : 91 ~ 9
7 赵洁 ,程井辰 . 石刁柏体细胞胚胎发生的细胞组织学研究 . 植 物学报 , 1 992 , 3 4 ( 7) : 4 91 ~ 4 95
8 桂耀林 ,徐廷玉 ,顾淑荣等 . 黄连体细胞胚胎发生的研究 . 杭物学报 , 1 9 89 , 31 (1 2 ) : 92 3~ 92 7
C u l t u r e o f H
e l i a n t h e m u m s o o n g o l i c u m
— A K i n d o f S u r v iv i n g P l a n t o f t h e A n e i e n t M e d i t e r r a n e a nC i Z h o n g l i n g Z h a n g h e n g L i u L i n g y u
( D eP
a rt m
e , , t of D
e s e 月 T er a t m e , , t , N e i入了d ,: 9 9 0 1 F o r e s t砂 OC l l e g e , 0 1 0 0 1 9 , H ol h o t , P R C )
T h e e a l l u s 15 i n i t ia t e d i n M S rn e d ia f r o m t h e e u t t i n g o f l e a v e s o f H
e l i a , , t l` e , n u m 5 0
,: g o l i c u l n
.
T h e M S m e d i u m w i t h I A A 1 0 m g / L
,
6
一
BA 1 m g / L 15 s e l e e t e d a s t h e b e s t m e d i u m f o r e a l l u s e u l
-
t u r e a m o n g t h e f i
v e m e d i a
.
T h e n t h e e a l l u s 15 e u l t u
r e d i n t h e f i
v e M S m e d i a w i t h d i f f e r e n t g r o w t h
-
r e g u l a t i n g s u b s t a n e e s t o s t im u la t e e m b r y o f o r m a t i o n
.
T h e M S m e d i u m w i t h IA A 5 m g / L
,
6
一
B A I
m g / L 15 s e l e e t e d a s t h e b e s t m e d i u m f o r e m b
r y o f o r m a t i o n
.
C a l lu s i n i t i a t i o n a n d r e
一
d i f f e r t i a t i o n
n e e d s p e e ia l a u x i n ( I A A )
,
2
.
4
一
D e a n n o t t a k e t h e p l a e e o f I A A
.
T h e e m b r y o id s o
r i g i n a t e f r o m t h e
5 i n g l e e e l l s w i t h e m b r y o g e n e t i e a b i l i t y e a l l e d e m b r y o n i e e e l l s
.
T h e e m b r y o n i e e e l l 15 d iv id e d e q u a l
-
l y o r u n e q u a l l y in t o t w o e e l l s
,
w h i e h d e v e l o P i n t o g l o b u l a r
、
h e a r t
一 s h a P e d e m b r y o id s a n d P l a n t l e t s
.
T h e r a d i e l e o f t h e t e s t
一
t u b e
一
P l a n t le t 15 n o t w e l l d e
v e l o p e d
.
T h e e m b r y o g e n e s i s h a s l i t t l e b e a r in g
o n t h e e n d a n g e r m e n t
.
T h e r a d ie l e a bm o r m a l g r o w t h e o u l d b e o n e o f t h e f a e t o r s e a u s i n g t h e e n d a n
-
g e
r
m e n t
.
K e y w o r d s H
e l i a , , t ]: e ,花 u m 5 0 0 , , g o l i c u m e u l t u r e e m b r y o id n一 e d i u m e n d a n g e r i n g f a e t o r s