全 文 ：濒危植物半日花组织培养及其调控
何丽君
(内蒙古农业大学农学院 , 呼和浩特市 010018)
摘要:本文对半日花 (H.songaricum s.)组织离体培养并附加植物生长调节物质调控进
行了论述。通过实验对半日花愈伤组织的形成过程和再分化以及培养基作用进行了分析。
阐述半日花愈伤组织分化成胚状体进而发育为试管苗的过程及其调控器官的发生 (苗的发
生和根的发生)。
关键词:半日花 愈伤组织 调控
中图分类号:S4 文献标识码:B
Tissue culture and process regulation and control of an
endangered plant Helianthemum songaricum
He lijun
(Agriculture colleg e, I nner Mongolia Agricultural
University , Huhho t , 010018)
Abstract:The tissue culture of Helianthemum songaricum and its regulation process controlled by
adding grow th regulation matter were discussed in this paper.The results showed that the forma-
tio n of callus of Helianthemum songaricum needs different species grow th and function of media.
Meanwhile, the process that the tube seeding developing from embryo like plant differentiated
through was discussed.
key w ords:Helianthemum songaricum , callus , contro l
前言
随着植被退化和荒漠化的蔓延 , 许多
植物将成为濒危物种 , 从而引起人们的重
视 , 也越来越更加提醒人们对珍稀濒危植
物的保护 。在我国对珍稀濒危树种保护已
受到政府的极大重视 , 出版了第 2批确定
的 《中国珍稀濒危树种》 , 开展了大量研
究工作 , 就组织培养方面的研究近年也有
报道。但对半日花离体培养及胚状体发生
的形态建成及调控尚无报道 , 特别是通过
离体培养及调控的研究 , 探索其导致濒危
—52—
内蒙古草业 2000 , No.4 , PP.52 ～ 57
本课题属于国家自然基金项目。
收稿时间:2000—09—08
作者简介:何丽君出生于 1963年 11月 , 女 , 在读硕士 , 从事组织培养研究。
的原因则更是鲜为人知。
半日花 (H.songaricum s.)为古地
中海残遗植物种 , 主产地中海 , 属单属种
植物 , 在我国仅分布于新疆和内蒙古两
地 , 是典型的间断分布 , 并成为亚洲中部
荒漠的特有种。因而它在研究亚洲中部荒
漠化 , 特别是研究我国荒漠植物区系起源
以及与地中海植物区系的联系等具有重要
的科学价值。它具有抗干旱 、 抗风沙 、 耐
瘠薄等特点。长期以来 , 有关专家和学者
对半日花组织培养做了一些工作。半日花
由于种子粒小 , 胚成熟度差 , 因此自然繁
殖能力低 。为了挽救半日花这一濒危植
物 , 本实验试图采用组织培养的技术和方
法对其进行离体培养 , 诱导胚状体发生 ,
通过了解体细胞生长和分化的规律 , 达到
快速繁殖的目的 , 为保护和繁育其它濒危
植物探索一条新的途径。本文对半日花组
织离体发育过程的形态建成及胚状体发生
调控进行综合论述。
1 愈伤组织的形成 、分化及其调控
1.1 愈伤组织的形成过程
半日花组织的细胞培养和大多数植物
培养依据的原理一样 , 也是建立在细胞全
能性的理论基础之上 。愈伤组织在人工培
养或自然条件下 , 植物细胞分化而不断增
殖的产生 , 主要是由薄壁细胞构成的不定
形组织。半日花愈伤组织的形成是一个由
外植体 (茎 、叶等)材料 、培养基成分和
外界环境等诸多因素之间相互作用的重要
复杂过程 。大致可分为诱导 、 细胞分裂和
细胞分化 3个阶段。
1.1.1 愈伤组织诱导 半日花愈伤组织
诱导是外植体组织受到外界条件的刺激 ,
改变原有的代谢方式 , 代谢能力加强 , 迅
速合成细胞质各主要成分 , 如核酸 、 蛋白
质等 , 为细胞分裂作准备。在形态上无明
显变化 。通过培养一段时间改变外源激素
的浓度和种类 , 以刺激并诱导半日花愈伤
组织的形成 , 经试验观察 , 温度在 25±
2℃, 光照强度为 12±1h/d , 25001ux 的
条件下对生长植株诱导率最高。
1.1.2 愈伤组织的分裂 半日花外植体
经过最佳激素的培养形成愈伤组织 , 一旦
诱导 , 其外层细胞便开始发生分裂 , 使细
胞脱分化。处于分裂期的愈伤组织细胞分
裂快 , 结构疏松 , 缺少组织结构 , 呈浅绿
色 , 表面呈紫色 , 下面呈淡绿色 , 当愈伤
组织迅速生长时 , 其体积已增至原外植体
20倍以上 , 从紫色愈伤组织又生长绿色 、
白色愈伤组织 , 质地疏松部位长势最好 。
从石蜡切片上观察可见细胞排列紧密 , 细
胞核比例很大 , 细胞数目明显增多 , 有许
多细胞处于不同分裂时期 , 若进一步继代
培养在新的培养基上 , 愈伤组织还可以继
续细胞分裂 , 并维持其不同分化状态 。总
体来看 , 外植体的脱分化因植物器官及生
理状况而有很大差异 。一般花器官分化较
易 , 茎 、叶较难 , 幼嫩组织脱分化较易 ,
成熟组织脱分化较难。下胚轴分化比叶 、
茎先分化。
1.1.3 愈伤组织的分化 半日花的分化
是细胞的体积不断增加 , 愈伤组织表层细
胞不断分裂逐渐增大成紫红色颗粒状 , 分
裂逐渐停止并汇集在愈伤组织内部深处的
局部地区 , 同时改变分裂面的方向 , 出现
疏松的绿色颗粒结构组织。在解剖镜下可
—53—
第 4 期 何丽君 濒危植物半日花组织培养及其调控
观察到一定形状的胚性细胞团 , 其为后述
胚状体的前身。同时 , 愈伤组织在分化期
出现导管 、 筛管 、 分泌细胞 、 毛状体细
胞 、 木栓细胞等 , 并形成小而密集的分裂
细胞构成的细胞团 , 即拟分生组织 。这些
区域化的细胞团往往在以后的分化过程中
是形成芽原基及根原基的中心 。同时愈伤
组织呈颗粒状的外形 , 细胞数目显著的增
加 , 由紫红色变为绿色疏松的组织团块 ,
其中有韧皮部 、 木质部 、 形成层等组织。
这些组织在发育过程中也有形成不定芽和
不定根的能力。
外植体经过一系列的复杂变化后 , 愈
伤组织被诱导分裂 、 分化 , 由于培养基中
水分和养分的消耗 , 及愈伤组织分泌物的
大量积累不利于愈伤组织分化成胚状体 ,
使愈伤组织变为黑紫色 , 并停止生长 , 逐
渐衰退甚至死亡 。当愈伤组织被继代最佳
新的分化培养基中 , 则可增殖并诱导 , 分
化成胚状体。将半日花连带原培养基切割
成小块 , 直径 3mm , 重量 50mg , 转移到
成份相同的新鲜 MS 培养基上 , 8d后恢
复分裂能力 , 迅速生长 , 15 ～ 20d在新鲜
培养基下生长旺盛并开始由形成愈伤组织
转化为胚的发生 。通过观察愈伤组织再分
化培养这一阶段其内部和表面的个别细胞
可以转化为胚性细胞 , 其细胞核大 , 原生
质浓 , 无液泡或具有小液泡 , 胚性细胞具
有旺盛的分裂能力 , 并成为后述的胚状
体。
1.2 愈伤组织的调控
半日花愈伤组织的诱导 、 增殖及后述
的形态建成主要受外植体本身 、培养基和
营养环境 3大因素调控。并非所有的植物
愈伤组织都具有形态建成能力。具有形态
建成能力的愈伤组织一般具有一定的形态
结构特点 , 但这 2种愈伤组织的差异是相
对的 , 可以通过控制培养条件 (特别是生
长调节物质)和继代的技术将无形态建成
能力的愈伤组织转变为有形态建成能力的
愈伤组织。
生长素 (IIA)和细胞分裂素 (6-
BA)对半日花外植体具有很明显的作用 。
半日花外植体在 IAA 和细胞分裂素 6-
BA配合的培养基中可形成愈伤组织 。但
在 IAA 浓度很高 , 6—BA 浓度很低 , 长
期不继代培养基中也可诱导分化成胚状
体 , 这是半日花植物所特有的生长适应
性 , 表现为在 IAA浓度高时诱导试管苗 ,
降低 IAA浓度和配合萘乙酸 NAA浓度时
分化根 , 若转入无激素的培养基中则可使
其试管苗生长。但芽的分化可在含有生长
素 (IAA , 2.4-D)的培养基中培养 。不
同植株部位来源的外植体 , 所产生的愈伤
组织在产生器官时具有外植体来源的特异
性 , 如根外植体产生愈伤组织形成器官时
易产生根。茎产生愈伤组织形成器官易形
成茎 , 叶形成愈伤组成易形成叶 。我们经
过对半日花愈伤组织的分化培养 , 得出愈
伤组织在生长素 (IAA)比例相对高于细
胞分裂素 (6—BA)的培养基中易生茎 ,
在有生长素 (IAA)而无细胞分裂素 6—
BA 的培养基中易形成根 (或 6-BA 少
时)。对于半日花这种特殊的植物在生长
素浓度达到 10mg/L , 6-8A1mg/ L 时长
期不继代也能分化出胚状体 。说明半日花
植物愈伤组织分化形成胚性细胞至胚状体
发生依赖于 IAA 和 6—BA , 同时半日花
—54—
内蒙古草业 2000 年第 4 期
愈伤组织的诱导 , 分化产生胚性细胞的形
成及其增殖还受到培养环境的调控 , 如温
度 、 光照等。
2 器官的发生
2.1 胚状体的发生
通过观察 , 半日花的胚状体起源于单
个胚性细胞 , 愈伤组织在分化培养阶段其
内部和表面的个别细胞可以转化为胚性细
胞 , 其胚性细胞具有旺盛的分裂能力 , 胚
性细胞核已分裂为 2个如图 1 , 胚性细胞
的第一次分裂可以是均等分裂 , 也可以是
不均等分裂 , 经多次分裂后形成原胚 , 原
胚中有些具有胚柄 , 有些不具有胚柄 , 有
些由愈伤组织经过胚发育的各时期形成胚
状体 , 而有的由胚性细胞直接发育为胚状
体。无论是怎样一种胚状体发生 , 其胚原
基 (原性细胞)的形成都是极为重要的 ,
它从细胞分裂的启动开始 , 经过分裂形成
拟发生组织或分生组织中心 , 然后形成胚
原基 , 最后发育为胚状体 。
2.2 苗的发生
半日花苗再生的主要途径有顶端分生
组织 (茎尖)再生 , 愈伤组织诱导的不定
分生组织再生。从半日花不定分生组织诱
导不定芽 、苗等有 2种情况:①从愈伤组
织中诱导 , ②从悬浮培养细胞中诱导 , 下
面分别阐明。
2.2.1 愈伤组织诱导苗 在愈伤组织中
诱导苗时生长素与细胞分裂素的配合在 3
种情况下可诱导 , 即 A)细胞分裂素抑制
生长素诱导的胚状体发生;B)细胞分裂
素促进生长素诱导胚状体发生并产生苗;
C)胚状体的发生而发育成苗需要生长素
与细胞分裂素的配合使用。而半日花属于
第 3种情况 , 无论是愈伤组织诱导 , 还是
胚状体的发生 (苗的生长)都是 IAA 有
效 。同时需要适当 6—BA 的浓度配合 。
半日花愈伤组织从生根到形成胚状体 (或
球形胚), 6—BA 不可少于 0.125mg/L ,
甚至高达 1mg/L。愈伤组织从形成退化
的胚到形成正常的胚状体并发育成试管苗
都需要两者的配比。因而 , 诱导胚状体的
发生及其进一步发育成苗需要较高浓度的
细胞分裂素 (1mg/L), 并且在胚状体发
生诱导苗的过程中并不需要较高浓度的
IAA , 同时半日花不需继代就能产生苗的
生长 , 因而在半日花苗的培养中要加较高
浓度的 IAA 。由于光 、 温度的破坏 , IAA
被降解到一定水平时就启动了分化产生
IAA有氧化酶 , 因而半日花对 IAA 有一
定的依赖作用 , 促进半日花试管苗不断生
长 。
2.2.2 悬浮培养细胞诱导 在悬浮培养
系的体胚发生是指双倍或单倍体细胞在特
定条件下 , 未经细胞融合而直接通过合子
胚胎发生类似的途径发育出新的形态发生
过程 。体胚的发生是在生物反应器中进
行 , 可以又快又多地获得体胚。半日花和
其它植物一样由单细胞至胚的形成可分为
单细胞 、细胞团 、胚性细胞团 , 球形原胚
和球形胚等阶段 (如图 2)。开始时单细
胞的细胞质及内含物并不丰富 , 7d 后球
形或卵形小细胞逐渐充实 , 随着细胞的继
续分裂 , 形成细胞团并在其表面或内部出
现一个或几个生长中心 , 这里的细胞分裂
迅速而扩展很慢 , 变得小而致密 , 镜下呈
现黑色 , 它们是胚的前身 (如图 4), 生
—55—
第 4 期 何丽君 濒危植物半日花组织培养及其调控
长发生最后形成胚状体和试管苗。因此以
每克半日花外植体大约可得 350 , 000 个
体胚 , 如此计算 , 每株植物在 8周内大约
即可再生 40 , 000个小植株 , 数量是十分
惊人的。用这种方法可进行特定基因型的
大量无性繁殖 , 成熟的体胚还可进行干
化 , 便于贮藏。目前应用先进技术 , 用高
分子聚合物如 (藻酸钠)营养物质 、杀菌
剂等制成人工种子包裹 , 将半日花种子包
裹起来 , 制成人工种子 , 其生活力的抗逆
能力都有极大的提高 , 更有利于克服种源
繁衍濒危植物 , 扩大树种 。
2.3 根的发生
半日花根的发生是从半日花茎形成
后 , 通过调整激素的浓度 , 改变培养基使
其形成拟分生组织 , 从而分化出根原基并
进一步发育成根 。通过组织培养对半日花
进行快速繁殖 , 甚至可达到工厂化育苗 ,
是 1项重要的生物技术 (如图 3 —完整试
管苗)。要得到足够快的繁殖速度 , 以适
应生产的需要 , 必须在培养过程中建立半
日花原始体。在最佳培养条件下进行根的
发生生长并转入土壤进行炼苗 , 繁殖体的
驯化 。无根苗的生根特别是炼苗是半日花
快繁的主要环节 。因为半日花的根系发育
不良 , 是导致其濒危的原因之一。因此必
须解决其根的发育问题 , 在 MS 培养基 ,
及低盐量 MS (1/2 , 1/3 , 1/4 , 1/5 等)
培养形成试管苗及完整的植株 , 并通过炼
苗使半日花苗达到为扩繁提供苗木 。通过
控制生长素的浓度 (如 IAA 、 NAA 、 6—
BA等)就可使半日花生长成完整的有根
苗 , 为炼苗做准备。
3 结果
半日花的外植体在一个组织培养条件
下 , 先形成愈伤组织 , 再通过人工调控 、
分化出茎 、 不定芽 , 最后诱导出根并形成
完整的试管苗 , 并可转入土壤进行驯化 ,
有利于对半日花这一濒危植物进行快繁 ,
并建立工厂化苗木。由于半日花是一种濒
危植物 , 目前仅有几百颗 , 因而在建立保
护区的同时应采用组织培养技术 , 利用茎
尖培养以消除其抗逆性 , 提高半日花的生
活力 , 即在组培的基础上促进发芽结实 ,
提高种子成熟率 , 克服其胚乳发育不良所
造成的濒危 , 并克服采种 、 采茎的困难 ,
缩短远距离运输 , 使其简便又安全地保存
其树种及种质。因此组织培养是一项重要
的生物技术 , 它能为今后快繁解决苗木 ,
扩大挽救濒危植物种群数量 。解决半日花
植物苗木生长技术是一项关键性环节 , 可
为提高炼苗的成活率提供条件。同时 , 为
开发利用和保护半日花濒危植物的物种资
源奠定基础 , 为转基因工程的可行性提供
依据。
本文对半日花的组织离体培养形成完
整植株和形态建成调控机制进行了简单的
阐述 , 有关实际研究还有待进一步深入 。
如:半日花的炼苗 , 快繁驯化等 , 以便更
好地挽救濒危植物半日花 , 为探讨其濒危
的原因奠定基础 , 有利于今后的保护和快
速繁殖 。
参 考 文 献
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lianthemum songarcum)的双受精作用及
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内蒙古草业 2000 年第 4 期
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图 1 胚性细胞的分裂×196 图 2 悬浮培养细胞×196
图 3 由胚发育幼苗×3 图 4 悬浮培养胚性细胞团×196
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第 4 期 何丽君 濒危植物半日花组织培养及其调控