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锈叶杜鹃愈伤组织诱导和增殖研究



全 文 :·生物技术· 北方园艺2015(02):88~90
第一作者简介:周敏(1980-),女,贵州遵义人,硕士,讲师,现主要
从事植物组培及栽培技术等研究工作。E-mail:minzhou211@
126.com.
责任作者:刘燕(1981-),女,贵州贵阳人,硕士,副研究员,现主要
从事花卉开发与繁殖等研究工作。
基金项目:贵州省科技厅重大专项基金资助项目(黔科合重大专
项字[2011]6001);贵阳市科技局资助项目(筑科合同[20121027])。
收稿日期:2014-07-28
DOI:10.11937/bfyy.201502025
锈叶杜鹃愈伤组织诱导和增殖研究
周   敏1,龙 秀 琴2,刘   燕3
(1.遵义医药高等专科学校,贵州 遵义563000;2.贵州省山地资源所,贵州 贵阳550001;3.贵州省生物研究所,贵州 贵阳550009)
  摘 要:以锈叶杜鹃无菌种子萌发后的胚轴和子叶为试材,对影响其愈伤组织诱导和增殖的
几个关键因子进行了研究。结果表明:MS培养基较适宜愈伤组织的诱导和培养;TDZ和NAA
浓度对愈伤组织诱导有很大影响,TDZ 0.50mg/L+NAA 0.05mg/L对愈伤组织诱导效果较好,
诱导率为77.78%;MS+TDZ 0.10mg/L+NAA 0.05mg/L对愈伤组织增殖效果较好,增殖率为
96.67%,增殖倍数为4.50;愈伤组织需及时转瓶,转瓶时间较晚容易褐化死亡,转瓶时间以40d
为宜。
关键词:锈叶杜鹃;愈伤组织;诱导;增殖
中图分类号:S 685.21 文献标识码:A 文章编号:1001-0009(2015)02-0088-03
  锈叶杜鹃(Rhododendron siderophylumFranch.)为
常绿野生杜鹃,花期3—6月,冬季偶见开花植株,株型
优美,花冠筒状钟形,花色淡雅丰富,有白色、淡红色、淡
紫色或偶见玫瑰红色,花冠内面上方通常有黄绿色、红
色或杏黄色斑点[1],有较高观赏价值。目前,锈叶杜鹃
主要靠种子繁殖,但种子萌发率低、繁育时间长;扦插生
根困难,加之季节和资源限制,需行之有效的快繁方法
对其进行繁殖和保护。组织培养技术是当代兴起的一
种快速繁殖的培养途径,不仅简单、迅速、繁殖速度快,
更利于植物新品种的推广和规模化生产。愈伤组织诱
导和增殖是组培快繁中的关键环节,关于锈叶杜鹃组织
培养方面研究尚鲜见报道。现对锈叶杜鹃组培快繁中
愈伤组织诱导和增殖方面做了细致研究,力求为今后锈
叶杜鹃的快速育苗技术打下坚实基础,可为商品化生产
    
提供一定的科学依据。
1 材料与方法
1.1 试验材料
供试材料为锈叶杜鹃无菌种子萌发后的胚轴和子
叶,种子采自贵州百里杜鹃自然保护区和贵阳乌当区可
龙村万亩杜鹃林多年生锈叶杜鹃植株。
1.2 试验方法
1.2.1 培养条件 试验所用培养基均加入30mg/L蔗
糖、10g/L 琼脂、1g/L PVP(聚乙烯吡咯烷酮),
pH 5.4~5.8。培养条件为温度(25±1)℃,光照时间
1h/d,光照强度1 500~2 000lx。
1.2.2 筛选愈伤组织诱导最适培养基 以MS、1/2MS、
1/4MS 3种培养基为基本培养基,附加TDZ 0.10mg/L
和 NAA 0.05mg/L,对愈伤组织进行诱导培养,筛选适
合愈伤组织培养的培养基配方。50d后记录诱导结果。
1.2.3 筛选愈伤组织诱导最适激素浓度 以 MS培养
基为基本培养基,以NAA 0.05mg/L为基本生长素和
浓度,附加不同浓度TDZ(0.10~1.50mg/L),对愈伤组
织诱导进行研究,筛选诱导愈伤组织的TDZ最适宜浓
度。在筛选出TDZ适宜浓度基础上,以TDZ 0.50mg/L
为基本细胞分裂素,附加不同浓度 NAA(0.01~
      
Abstract:Taking sprawl cucumber(Cucumis sativus L.)‘129’and dwarf cucumber‘D0462’as experimental materials,the
efects of diferent light qualities on expression of the expansin were studied.The results showed that the hypocotyls
length of‘D0462’was longer or shorter by diferent light treatment.The expression of expansin was detection by Real-
time PCR.The red light inhibited the expression of expansin and blue light inhibited at first but promoted after that.It
was inferred that the dwarf character of‘D0462’was related to the expression of expansin,espcialy with the Cs-EXPA1.
Keywords:light quality;expansin;dwarf;expression
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北方园艺2015(02):88~90 ·生物技术·
0.50mg/L),对愈伤组织进行诱导培养,筛选诱导愈伤
组织的NAA最适宜浓度。50d后记录诱导结果。
1.2.4 筛选愈伤组织增殖最适激素浓度 在筛选出愈
伤组织诱导最适宜培养基配方的基础上,进行植物激素
浓度的优化调整试验,对愈伤组织进行继代增殖培养,
筛选愈伤组织增殖的适宜激素和浓度。45d后记录增
殖结果。
1.2.5 筛选愈伤组织继代增殖最适转瓶时间 愈伤组
织增殖后,需及时转瓶来保持愈伤组织的活力,否则愈
伤组织容易褐化、死亡。以40、50、60d为转瓶时间,对
愈伤组织的继代增殖进行了培养研究。转瓶45d后记
录培养结果。
2 结果与分析
2.1 培养基对愈伤组织诱导的影响
由表1可知,MS培养基较1/2MS培养基和1/4MS
培养基对愈伤组织的培养效果好,在此培养基上,愈伤
组织诱导率高,质量好,活力强,易于增殖。1/2MS培养
基和1/4MS培养基的诱导率结果相差甚微,但诱导出愈
伤组织品质差异大。1/4MS培养基诱导出愈伤组织颜
色黄,致密,增殖后生长较慢,增值倍数低;1/2MS培养
基诱导出的愈伤组织的致密程度不及1/4MS培养基,愈
伤组织略带绿色,增殖后生长速度较1/4MS培养基培养
的愈伤组织效果好。
表1 培养基对愈伤组织诱导的影响
  Table 1 The efect of diferent media on calus induction
编号
Number
培养基
Medium
接种数
Inoculation
number/个
出愈数
Calus
number/个
诱导率
Induction
rate/%
生长状态
Growth
state
生长势
Growth
potential
A1 MS  230  152  66.08 黄绿色,蓬松 *****
A2  1/2MS  90  42  46.67 黄色略带绿色,致密 ***
A3  1/4MS  90  40  44.44 黄色,致密 ***
  注:“*”表示生长状况,数量越多表示生长情况越好,下同。
Note:“*”indicates the growth status,the more“*”indicate the better of the
growth situation,the same below.
2.2 TDZ对愈伤组织诱导的影响
由表2可知,TDZ浓度从0.10~1.50mg/L均能诱
导愈伤组织的产生,但诱导率差异较大。TDZ 0.10~
0.50mg/L诱导效果好,不仅出愈率高,愈伤组织活力
强,且易增殖;随着TDZ浓度升高,愈伤组织诱导率逐渐
下降,尤其是当TDZ浓度增至1.50mg/L后,诱导效果
最差,诱导率仅达到44.44%,与 TDZ 0.50mg/L诱导
率相差33.34百分点。此外,愈伤组织的质量随着TDZ
浓度的升高也逐渐降低。愈伤组织由低浓度黄绿色、蓬
松状,逐步变为高浓度黄色、致密状,生长势变差。当
TDZ浓度高于1.00mg/L后,愈伤组织为白色,蓬松状,
后期无增殖能力,继续培养褐化死亡。由此可见,TDZ
浓度控制在0.10~0.50mg/L诱导效果较好,而TDZ
0.50mg/L时诱导率最高,愈伤组织的活力最强,是诱导
愈伤组织最适宜浓度。
表2 TDZ对愈伤组织诱导的影响
  Table 2 The efect of diferent concentrations of
TDZ on calus induction
编号
Number
TDZ
/(mg·L-1)
接种数
Inoculation
number/个
出愈数
Calus
number/个
诱导率
Induction
rate/%
生长状态
Growth
state
生长势
Growth
potential
B1  0.10  60  40  66.67 黄绿色,蓬松 ****
B2  0.50  90  70  77.78 黄绿色,蓬松 *****
B3  1.00  80  40  50.00 黄色,致密 ***
B4  1.50  90  40  44.44 白色、蓬松 *
2.3 NAA对愈伤组织诱导的影响
由表3可知,NAA浓度在0.01~0.05mg/L间诱
导效果好,逐步增加NAA浓度,诱导率降低,愈伤组织
逐渐致密,变硬,生长势差。故诱导愈伤组织时NAA浓
度控制在0.10~0.05mg/L为宜。
表3 NAA对愈伤组织诱导的影响
  Table 3 The efect of diferent concentrations of
NAA on calus induction
编号
Number
NAA
/(mg·L-1)
接种数
Inoculation
number/个
出愈数
Calus
number/个
诱导率
Induction
rate/%
生长状态
Growth
state
生长势
Growth
potential
C1  0.01  30  22  73.33 黄绿色,蓬松 ****
C2  0.05  30  23  76.67 黄绿色,蓬松 *****
C3  0.10  30  18  60.00 黄绿色,蓬松 ****
C4  0.50  30  15  50.00 黄色,致密 ***
2.4 TDZ和NAA对愈伤组织继代增殖的影响
由表4可知,TDZ浓度在0.08~0.10mg/L,
NAA浓度在0.05mg/L时愈伤组织增殖效果较好,增
殖率和增殖倍数都较高,尤其是TDZ 0.10mg/L配以
NAA 0.05mg/L时诱导效果最好,增殖率达到了
96.67%,增殖倍数在4.50以上,愈伤组织活力强。继续增
加TDZ浓度至0.30mg/L,NAA浓度至0.10mg/L后,
愈伤组织增殖速度减慢。故选TDZ 0.08~0.10mg/L配
以NAA 0.05mg/L对愈伤组织进行增殖培养为宜。
表4 TDZ和NAA浓度和配比对
愈伤组织增殖的影响
  Table 4 The efect of diferent concentrations of
TDZ and NAA on calus multiplication
编号
Number
TDZ
/(mg·L-1)
NAA
/(mg·L-1)
增殖率
Proliferation
rate/%
增殖倍数
Proliferation
times
生长状态
Growth
state
生长势
Growth
potential
D1  0.08  0.05  93.33  4.50 绿色、蓬松 ****
D2  0.10  0.05  96.67  4.50 绿色、蓬松 *****
D3  0.30  0.05  83.33  2.50 黄绿色,致密 **
D4  0.50  0.05  66.67  3.00 黄绿色,致密 ***
D5  0.08  0.10  83.33  3.50 黄绿色,致密 **
D6  0.10  0.10  80.00  3.50 黄绿色,致密 **
D7  0.30  0.10  73.33  2.50 绿色,致密 **
D8  0.50  0.10  73.33  2.00 黄色,致密 **
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·生物技术· 北方园艺2015(02):88~90
2.5 转瓶时间对愈伤组织继代的影响
由表5可知,继代转瓶时间对愈伤组织增殖和培养
有很大影响。转瓶时间过晚,愈伤组织容易褐化、死亡,
增殖率、增殖倍数都较低,转瓶后的愈伤生长势也较差,
容易在转瓶10d后死亡,故转瓶时间控制在40d为宜。
表5 转瓶时间对愈伤组织继代的影响
  Table 5 The efect of diferent days of
transferring medium on calus multiplication
编号
Number
转瓶时间
Change the
bottle time/d
增殖率
Proliferation
rate/%
增殖倍数
Proliferation
times
生长状态
Growth
state
生长势
Growth
potential
E1  40  93.33  4.50 增殖正常 *****
E2  50  66.67  2.50 部分愈伤褐化 ***
E3  60  40.00  2.00 部分愈伤褐化、死亡 **
3 结论与讨论
野生杜鹃因其极强的野生性和保守性,对培养基、
培养条件、植物激素种类和浓度选择性都较强,只有根
据不同的基因型选择合适的培养基、植物激素、培养条
件才能得到理想的培养效果。大量研究表明[2-10],低无
机盐类培养基如Read、1/4MS适合杜鹃的离体培养,高
盐培养基MS培养效果较差,不适合杜鹃类植物。该研
究发现,1/4MS未取得很好的培养效果,而 MS较适宜
锈叶杜鹃的组织培养,与前人结果不一致,可能受杜鹃
种类的基因型影响有关。
范玉清[7]、管耀义等[8]用杜鹃叶片诱导愈伤组织时
发现,TDZ配以NAA对诱导杜鹃叶片愈伤组织十分有
效,愈伤组织在TDZ处理上的分化率较高。该试验发
现,TDZ 0.50mg/L配以NAA 0.05mg/L对胚轴和子
叶愈伤组织诱导效果较好,不仅出愈率高,愈伤组织活
力强,且易增殖。野生杜鹃的野生性强、保守性高,一般
的细胞分裂素较难诱导出芽或愈伤组织,而TDZ具有
很强的细胞分裂素活性(CTK),因此,TDZ诱导野生杜
鹃的愈伤组织效果较好,配以生长素NAA的相互作用,
使其生理活性与功能达到最佳。
杜鹃组织培养中愈伤组织褐化常常严重影响植株
再生的效率。目前,已有研究者对光照强度、温度、抗氧
化剂、吸附剂[9]、消毒方式[10]等抗褐化方面进行了研究,
但对不同继代培养时间间隔的研究鲜有报道。该研究
表明,继代转瓶时间对愈伤组织增殖和培养有很大影
响。转瓶时间过晚,愈伤组织容易褐化、死亡,这可能与
愈伤组织在瓶内对营养物质吸收和环境改变有关。锈
叶杜鹃继代时间不宜过晚,以40d为宜,这样可以保持
愈伤的活力,有效的减少愈伤的褐化和死亡率。
参考文献
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Study on the Calus Induction and Multiplication of Rhododendron siderophylum
ZHOU Min1,LONG Xiu-qin2,LIU Yan3
(1.Zunyi Medical and Pharmaceutical Colege,Zunyi,Guizhou 563000;2.Guizhou Research Center of Karst Resource Environment and
Development,Guiyang,Guizhou 550001;3.Guizhou Institutes of Biology,Guiyang,Guizhou 550009)
Abstract:Taking cotyledon and hypocotyl of seed of Rhododendron siderophylumas experiment material,the several key
factors on calus induction and multiplication of Rhododendron siderophylumin tussue culture were studied.The results
showed that MS medium was suitable for induction and multiplication of calus.The concentrations of TDZ and NAA had
a strong influence on calus induction.The MS medium supplemented with TDZ 0.50mg/L and NAA 0.05mg/L had
high induction efect,and the induction rate was 77.78%.The MS medium supplemented with TDZ 0.10mg/L and NAA
0.05mg/L was suitable for calus multiplication,the multiplication rate could reach 96.67%,the multiplication ratio was
4.50.In order to keep calus multiplication more and more,the calus needed to transfer medium again and again.The
ideal time for transferring medium was 40days,so that it could avoid browning of calus.
Keywords:Rhododendron siderophylum;calus;induction;multiplication
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