全 文 ：第 31 卷 第1 期
2 0 1 3 年 l 月
中 华 中 医 药 学 刊
A R C H IV 注5 O F T R A D IT 旧 N A L C H IN E S E M E D !C !N E
V ol.3 1 N o . l
8阴. 2 0 1 3
H PLC 法测定照山白中黄酮类成份的含量
李福荣 . ,夏成才 -,冯蕾2,张伟 .
(1.泰山医学院药学院 ,泰安 山东 27 1016 ;2 .泰山医学院生命科学研究中心 ,泰安 山东 27 l XX) )
摘 要:目的:建立浏定照山白中黄酮类化合物含量的高效液相色谱(H卫LC )方法方法:85 e 下用无水乙
醉采用索氏提取装里制备粗黄酮 ,经过旋转蒸发仪浓缩成浸膏 ,用高效液相色谱法进行含量浏定采用W a1Le rS
XT era O M S cl :色语柱(1.5 ~ x 10 ~ ,3.5 林m ) ;流动相:甲醇一0.2% 磷酸水溶液;检浏波长:340 一3so nm ;
流速 :0 .Z mL #面n一.;柱温:室温;自动进样结果:照山白中黄酮类化合物芦丁 ,拼皮素 , 山奈酚在 0 .0203 -
162 .5 此 #mL 一.范围内进样量与峰面积呈良好线性关系, 其线性回归方程分别为 y 二23 18 .3x 一240 89 8 , r =
0 .99卯 ;y =5仍5.1:+ 143452 ,; = 0.卯99;y =2953.lx + 414574 , ;= 0.9999 方法学考察表明 ,黄酮类的最低检测
限为0 .08 3 卜g #mIJ 一. ,加样回收率为 96 .60 % ,98 .7% ,97 .5% ,Rs D 为 1.09 % , 1.20 % , 1.16 % (n 二3)
关键词 :高效液相色谱法;照山白;黄酮;芦丁;拼皮素;山奈酚
中图分类号:R2 84 .3 文献标志码:A 文章编号:1673 一7 17( 20 13) 0l 一01 69 一03
D eterm inat ion of the Flav one in R hododendro m m iera nthum Tum z by H P LC
1 Fu ro呢 I , r E N e 玩 11 , H u A N G x i而 n Z , z 拟 N e 跳 11
(1.Tai shan M 诫司 C olege , Tai an 27 10 16 , Shando ng, China ;
2 !u 免Seienc e C enter in Tai sban M ed ica] C lle罗 ,T ~ 27 10 16 ,Shan dong ,C hina)
A bat 9act刃妙-姗 :To es tablish th e me th od for deten 0Ination of th e flavone in R五odol en山ro m 而cran thum TUIC z 场
H PLC. 甭肠甘切击:Th e 曲solu te eth yl al eohol was us ed to eol eet flav one 场 50划日etextn沈tion ,斌er eonc entrat ed to extra ct
场 the rot 娜 ev 聊 rators,sim ult an eous det e耐 nation was m ade by high pe对brm an ce li咖 d e肠 m ato邵agh y in th e 85 e .
Th e determ in ation was cari ed out on a W aters X T eITa O M S C 18 eolunm # T he m obile p has e , m eth 叨 01 一phosph ori e
ac id wa ter sol uti on of 0 .2 % at a fl ow vel oeity of o .2 m L #而n 一. . Th e detec ti on w avelen gt h wa , 34() 一3s o nm . T he ol -
um n te mP erat uI.e is ~ te山Pera ture an to m ati o sam Pl ing. 五己su俪:Th e nav one of R hododen山ronl m ierathum Ture: cali 一
b ra tio n eurve was lin eax over th e ran 罗 Of 0 .020 3 一162 .5 此 # m L
kae am Pfe ro l w as y = 23 18.3x 一24() 898 ,r = 0.9 9 9 ,
0 .99 99 . Th e 卿 eatab il ity Pre eisi on was 0 . 0 83 哪 #
1.09% , 1.20% ,1.16% (n = 3 ).
y 二
m L
50 38 . lx +
, th e eali bra tion ctirve Of ru tin 四 erc eti n ;querC etin ;
14 345 2 , r = 0 .9 99 , y = 295 3 . lx + 4 14 874 , r =
th e re eovery w as 9 6 .6 0 % , 98 . 7 % , 9 7 . 5 % , 讯th RS D Of
K ey w o rd s :H PL C ;R五od od end ro m 而 cran thu m T urez. ;n av on e ;ru 血 ;qU ero eti n; kaem p fe ro l
一华中医药169学刊
照山白为杜鹃花科植物照山白(R hod od elldrom 血cran ,
th um )的枝叶 ,用于治疗急慢性气管炎 !哮喘 !痢疾 !痛经 !产
后周身疼痛 !高血压等川 照山白浸膏片用于治疗前列腺
增生有一定的疗效 ,黄酮类化合物治疗前列腺增生主要活
性成分[z] ,研究表明,照山白总黄酮(TF R :tot al n~ 台帅
Rh od od en dj ro m 而cra nthuln )有抗炎[a] !镇痛和抗前列腺增生
作用[2, 52,H PL c 检测发现 ,懈皮素 ,山奈酚 ,芦丁在总黄酮
中含量较高[.] ,应是发挥作用的有效物质
黄酮类物质的含量测定方法有分光光度法 !气相色谱
法 !液相色谱法 !毛细管电泳法卜 6]等 分光光度法处理简
单 ,操作速度快 ,便于推广 但该方法只能表示化合物的总
量 ,不能反映照山白单个活性成分的浓度 ,高效液相色谱法
具有应用范围广 !分离效率和灵敏度高 !分析速度快 !自动
化程度高 !样品制备步骤少 !成本低 !测定结果准确 !重现性
好等优点 ,高液相色谱法的应用使不同成分的分离和测定
收稿 日期 :2012 一08 一20
基金项目:泰安市科技局资助项目(2 01 03 0 3)
作者简介:李福荣(197 0 一) ,女 ,山东荷泽人 ,副教授 ,硕士 ,研究方
向:药物化学教学与科研
成为可能
随着科技的发展 ,对照山白中单体成分的研究越来越
广泛 本文通过黄酮类含量测定为以后更深人的研究提供
参考
1 仪器与试剂
1.1 仪器
美国 W aters公司 zQ 一4以刃液相色谱 一质谱联用仪;
W at ers 29 6 二极管阵列检测器;M eul er fToledo A B265 一S
电子天平;KQ 600D B 型数控超声波清洗器(昆山市超声仪
器有限公司);索氏提取器 so mL (水市市长风仪器仪表公
司) ;RE 一5298A 旋转蒸发仪 (西安德派生物科技有限公
司); 中草药粉碎机 FW l3 5( 天津市泰斯特仪器有限公司);
标准样品筛 18 目(中国宝平振兴分子筛)
1.2 试剂和材料
泰山照山白,采自泰山(经天然药物化学教研室高红
莉老师鉴定);黄酮类化合物对照品(含芦丁 ,懈皮素 ,山奈
酚 ,规格均为 9 .8% )上海生物制品研究所 ;甲醇(色谱纯 ,
天津市凯通化学试剂有限公司);去离子水( 自制) ;无水乙
醇(分析纯 ,天津市凯通化学试剂有限公司) ;0.45 四 有
机相 / 水相滤膜(上海兴亚净化材料厂) ;石油醚 (天津市
DOI：10.13193/j.archtcm.2013.01.173.lifr.059
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巴斯天化工有限公司);磷酸 (分析纯 ,天津市凯通化学试
剂有限公司)
1.3 溶液配制
1.3.1 对照品溶液的配制 精密量取黄酮类化合物对照
品 0.325 m g ,用50 % 甲醇水溶液溶解并于20 mL 容量瓶中
定容 ,得 162 .s m 扩L 黄酮类对照品溶液
1.3.2 样品浓液的配制 取照山白的干燥粉末 20 9 ,用石
油醚在85 e 下索氏提取至无色 ,去除叶绿素 ,然后与3(X) mL
95 % 乙醇混合,85 e索氏提取,过滤得滤液,将所得滤液旋
转蒸发 ,得浸膏 用 50 % 甲醇一水溶液溶解 ,过滤 ,0.45 脚
微孔滤膜过滤后 ,定容至 50 mL ,进行高效液相分析
2 实验方法与结果
2 .1 色谱方法
色谱柱:Wa te rs X Te rTa O M S C ::柱(1.5~ x 10 ~ ,
3 .5 卜m ); 流动相 :甲醇 一0 .2% 磷酸水溶液 ;梯度洗脱条
件 ,见表 1
表 1 梯度洗脱条件
时间(而n) 甲醇 0.2% 磷酸水溶液
只. 胭
氛亩石件艾蓄俪
巧%
8 5 %
10 %
20 %
85 %
15 %
0
80 %
j!a气qn2八,q气
流速 :0 .2 m L #而n一.;紫外检测波长:340 一380 ;柱
温:室温;进样方式 :自动进样;色谱工作站:M as sl ynx ve 卜
sion 4.0 系统
2 .2 色谱方法验证
分别取甲醇 一水(1 :l) 空白对照 20 林L !1.3.1项下浓
度为 162 .s m岁L 的黄酮类对照品溶液 20 卜L !1.3.2 项下
的样品溶液20 泌 在 2.1项色谱条件下进样 ,记录色谱图
(见图 1 一3 )
图3 样品溶液色谱图
由图2 对照品色谱图可知 ,相同色谱条件下芦丁 ,懈皮
素 ,山奈酚分别在 巧.58 而n , 18 .65 面n , 20 .3 而n 出峰
由图1可知流动相在相应时间左右没有大峰出现 ,对样品
检测产生干扰较小 由图3 可知 ,各个峰分离较好 ,相应的
在 15 .43 而n , 18 .53 而n,20 .2 而n 出现了一个大的吸收
峰 ,与对照品色谱图对照可知此峰即为样品中黄酮类化合
物的最大吸收峰
2 .3 方法学验证
2 .3.1 线性关系试验 精密量取 1.3.1 项下黄酮类化合
物对照品溶液 5 m L 置于 10 mL 容量瓶中 ,用 50 % 甲醇水
溶液溶液定容至刻度 ,即得浓度为81 .25 m g/ L 黄酮类化合
物对照品溶液 精密量取 81 .25 m 岁L 上述黄酮对照品溶
液 2.5 m L 置于 10 mL 容量瓶中,用 50 % 甲醇水溶液定容
至刻度 ,得浓度为 20 .3l m岁L 对照品溶液 ,精密量取20 .31
m 梦L 黄酮对照品溶液 1 m L 置于 10 ml. 容量瓶中 ,用 50 %甲醇水溶液定容至刻度 ,得浓度为 2.03 m岁L 对照品溶液 ,
精密量取2 .03 m 扩L 上述黄酮对照品溶液 0.l mL 置于 10
m L 容量瓶中,用 50 % 甲醇水溶液定容至刻度 ,得浓度为
0.02 03 m岁L 对照品溶液 分别取浓度为 2.03 m 岁L 黄酮
类对照溶液 10 林L ,20 .3l m 9 L 黄酮类化合物对照品溶液
10 林L !40 卜L ,81.25 m岁L 黄酮化合物类对照溶液 20 卜L !
40 泌 !80 泌 , 162 .s m留L 黄酮类化合物对照溶液 60 林L 进
样 ,进样量分别为 20.3 !203.1 !812.4 !1625 !3250 !65(X) !
97 50 ng ,记录色谱图 ,测得数据见表 2 一4 以进样量为横
坐标 ,芦丁 ,懈皮素 ,山奈酚色谱峰峰面积为纵坐标绘制标
准曲线 ,见图4 一6
表 2 芦丁标准曲线参数
进样量(叼 加.3 203 .1 812.4 1砚5 3珊 姗 卯匆
峰面积 37臼7.11 1肠袱)02 1454和5.13 3549 572 7305 印 147侧14 翔557叨
华中医药
可70
图2 黄酮类对照品溶液色谱图
图4 芦丁标准曲线
由图4 可看出,芦丁在 0.0203 一9.75 阿 范围内进样
量与峰面积呈良好线性关系 ,线性回归方程为y 二23 18 .3x
一2 40 898 , r 二0 .9 99
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Jan . 2 0 1 3
表 3 懈皮素标准曲线参数
进样量(ng ) 20 .3 203 .1 8 12.4
峰面积 12 1785.62 4 98685, 50 54伪81.69 1149 756 3 32 711138
3 0 0印0 0 0
2 5 0图0 0
2 0 0仍0 0 0
1 5 0加0 0
1 0 0的0 0
O田0 0
0 10加 沁0 3伪0 10 0 0 浦 0 0 6 (叹闭 7 01刀
图5 懈皮素标准曲线
由图5 可看出 ,懈皮素在 0.0203 一6.5 林g 范围内进样
量与峰面积呈良好线性关系 ,线性回归方程为 y = so38.lx
+ 14 34 52 , r = 0 .9 999
表 4 山奈酚标准曲线参数
进样量(叱) 20.3 812.4 一625 3250 650 9750
峰面积 68205 .肠 361708 75 75307 34,50 9675217 19850656 29072142
0 2 0 0 0 4田 0 6 0 0 8的 0 1伪 00 12 0加
图6 山奈酚标准曲线
由图6 可看出 ,山奈酚在 0 .0203 一9 .75 林g 范围内进
样量与峰面积呈良好线性关系 ,线性回归方程为 y 二
29 53 . lx + 4 1487 4 , r = 0 .99 99
2.3.2 定量限的建立 取 1.3.1项下浓度为0.0203 m岁L
对照品溶液 ,在相应的色谱条件下 ,进样 10 林L ,进样量分
别为 0.203 ng ,记录色谱图 ,计算出黄酮类化合物的对照品
溶液的定量限S/ N = 4.05 当信噪比S/ N > 3 时(见图 7) ,
芦丁对照品溶液定量限为0 .203 ng
怕
七. 解卜. . 阅 .
下吕. 1 冬e s 孔U
含 O 七白 内曰
1祀
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华药中医七. 脚卜, . 川 口 生 侧匕白 内口日
学刊
图7 进样量为 2.203ng 时的色谱图
2.3.3 精密度实验 精密吸取浓度为 2.03 m扩L 的对照
品溶液50 卜L ,按 3.1项下色谱条件重复进样 5 次 ,测定黄
酮类化合物的峰面积 ,芦丁,懈皮素 ,山奈酚的 R SD 分别为
0 .9 9 % ,2 . 17 % ,0 .66 %
2.3.4 重复性试验 取精制照山白 2 9 ,加人 50 m L 95 %
乙醇溶液溶解 ,按样品处理方法制备3 份样品溶液 ,在一天
内按 3.1 项下色谱条件重复进样 ,测定黄酮类化合物的峰
面积 ,代人标准曲线计算含量 ,芦丁 ,榭皮素 ,山奈酚的含量
分别为 0.0363% , 0.(X) 233% , 0.01036% ,其 RSn 分别为
l , 93 % , 1.5 0 % , 0 .87 %
2.3.5 稳定性试验 取刚制备的样品溶液 20 林L 进样 ,测
定黄酮类化合物的含量放置在冰箱中 1 周后 ,再次进样
20 林L ,测定黄酮类的含量 结果发现 , 1周后黄酮类化合物
的含量分别为放置前的89 .7% ,8 .5% ,90 .2% , RS D 分别为
4.43% ,4.68% ,4.51 % 表明该样品在 1周内基本稳定
2.3.6 回收率试验 精密称取照山白粉末 20 9,按 1.3.2
项下制备样品溶液 精密量取 5 m L ,3 份 ,分别精密加人对
照品溶液稀释液 0.001625 m留 m L ,0.1 !0.2 !0.5 m L ,置 10
m L 容量瓶中按 2.3.1 线性关系试验下方法测定 ,计算回收率 ,结果见表5
表 5 加样回收率试验结果(n = 3)
项目 芦丁 懈皮素 山奈酚
样品含量(嗯) 5% .2 四2.2 192 .9
加人量(ng) l位.5 325.0 812 5 162.5 325.0 名12.5 1能.5 325 0 812.5
回收量(ng) 712.1 821.3 1325.6 451.2 6的.8 11肠.1359.2 512 7 9 8.9
回收率(% ) 93.86 89.16 94 .10 99.23 98.80 1叨.13101.07102.86 9 .35
平均回收率(% ) 92.37 9 .39 101 .的
RSD (% ) 2.78 0.679 1.76
2.4 含量测定
精密称取精制照山白样品粉末 3 份 ,每份 2.0 9 ,用
1.3.2 项下的黄酮类样品溶液制备方法制备 3 份样品溶
液 ,配成同种浓度后 ,按2 .1项下色谱条件进高效液相色谱
检测峰面积 ,代人标准曲线计算黄酮类含量结果见表 6
表 6 黄酮类的含量
序号
含量 )
1 2 3 平均
芦丁 0 .02874 % 0 .03025 % 0.03以4 % 0 .02981%
懈皮素 0.(X) 1567 % 0 .001324 % 0.(X) 149 2% 0 .(X) 146 1%
山奈酚 0.0() 9 876 % 0 .009378 % 0.0() 9687% 0 : 09 64 7 %
3 讨 论
本实验测得的照山白黄酮类含量为春季(201 0 年 5 月
24 日)采集于泰山山脉的照山白黄酮类含量 ,照山白中榭
皮素 ,山奈酚 ,芦丁的平均含量为 0.0 1461 % ,0 .0 964 7% ,
0 .0 298 1%
本实验建立的黄酮类含量测定的高效液相色谱法方法
简便 !快速 !准确度高 !测定结果重现性好 ,且具有精密度
好 !加样回收率高 !标准曲线线性关系良好等优点 ,可用于
照山白中黄酮类含量测定的研究
参考文献
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