全 文 ：[ 作者简介] 邹纯才 , 男 ,硕士 ,副研究员 ,电话:0553-3932622 , E-mail:zouchc@163.com
满山红油的高效液相特征色谱考察
邹纯才1 ,鄢海燕1 ,方芳2 , 3 ,方洪壮3　(1.皖南医学院药学系 , 安徽 芜湖 241002;2.佳木斯大学附属第一医院 , 黑龙江佳
木斯 154002;3.佳木斯大学药学系 ,黑龙江 佳木斯 154007)
[ 摘要] 　目的:探求不同产地和同一产地不同采收期的满山红油的高效液相(H PLC)特征色谱 , 为建立满山红油的色谱特征
图谱提供依据。方法:按中国药典 2005 年版一部附录Ⅹ D中挥发油测定的甲法 , 水蒸气蒸馏提取挥发油。采用梯度洗脱技术
进行 H PLC 分离分析。色谱柱为 Zo rbax Eclipse XDB-C18柱 ,流动相为乙腈-0.1%磷酸水溶液 ,流速为 1 mL·min -1;检测波长
为 210 nm。用聚类分析方法处理色谱指纹信息 , 比较色谱以 牛儿酮为参照色谱峰的 32 个特征峰的信息 、单波长的全部指
纹信息及 200～ 350 nm 全波长的二维特征图谱的指纹信息。结果:所用的特征图谱测定系统对满山红油的分离良好 , 牛儿
酮的纯色谱峰得到确认。采用 200～ 350 nm 全波长的二维特征图谱的指纹信息较采用单波长全部特征指纹信息及色谱特征
峰指纹信息的聚类结果更加可靠。结论:不同产地的满山红油中吉马酮的含量差异较大。不同产地的满山红油的色谱特征
色谱比较相近 ,但有差别。 200 ～ 350 nm 全波长的二维特征图谱的指纹信息更能全面表达满山红油的内在质量。
[ 关键词] 　满山红;特征色谱;聚类分析
[中图分类号] R282.73　　[ 文献标识码] A　　[文章编号] 1001-5213(2008)19-1662-04
Study on HPLC fingerprint characteristic features of f olium rhododendri daurici oil
ZOU Chun-cai1 , YAN Hai-yan1 , FANG Fang 2 , 3 , FANG Hong-zhuang3(1.Department o f Pha rmacy , Wannan A-
cademy of medical , Anhui Wuhu 241000 , China;2.The F rst A ffilia ted Hospital of Jiamusi Unive rsity , Heilongjiang Jiamusi
154003 , China;3.Depa rtment of Pharmacy , Jiamusi Unive rsity , H eilong jiang Jiamusi 154007 , China)
ABSTRACT:OBJECTIVE　To investig ate HPLC pro files o f f olium rhododendri daurici oil from the different sources and the
same sources of differ ent har vesting seasons and provide basis fo r the establishment of chr omatog raphic fing erprint of f olium
rhododendri daurici oil.METHODS　According to the te st for v ola tile oil me thod of appendix Ⅹ D in ChP 2005 , and the volatile
oil is distillated by steam distillation.The H PLC w as run on Zo rbax Eclipse XDB-C18 column with acetonit rile-w ater (0.1%
pho sphoric acid)as mobile phase in g radient elution a t a f low rate of 1.0 mL·min-1.The detection w aveleng th w as 210 nm ,
respectively.The w hole informa tion o f sing le-w aveleng th chromato gr aphic fingerprint , two-dimension info rmation da ta at full
wave leng th 200-350 nm and the date of 32 fing erprint peaks compared w ith Germacrone w ere tr eated by cluste r analysis.RE-
SULTS　The H PLC finge rprint of f olium rhododendri daurici oil w ere obtained with good resolution unde r the experiment
chr omatog raphic sy stem.The pure peak of chr omatog r aphic fingerprints of Ge rmacrone w as identified.Be tte r cluster re sult can
be obtained from two-dimension info rmation data at full wave leng th 200-350 nm than the w hole info rmation of sing le-w ave-
leng th chromatog raphic finge rprint and the chromatog raphic cha racteristic peaks info rmation.CONCLUSION 　There were
gr eater difference on content o f f olium rhododendri daurici o il fr om diffe rent source.Though HPLC profiles in f olium
rhododendri daurici oil fr om the diffe rent sources a re similarity , the difference of H PLC pro files can be founded.The finge r-
prints characterized by tw o-dimension informa tion da ta a t full waveleng th could prov ide mo re overall info rmation fo r the inhe r-
ent quality o f f olium rhododendri daurici oil.
KEY WORDS:f olium rhododendri daurici;pro file;cluster analy sis
　　满山红(folium rhododendri daurici)为杜鹃
花科植物兴安杜鹃(Rhododendron dauricum L .)
的干燥叶 。满山红油为兴安杜鹃的干燥叶经水蒸气
蒸馏得到的挥发油 ,有止咳 ,祛痰之功效[ 1] 。其制剂
为满山红油滴丸。为更全面 、更合理的反映不同产
地或同一产地不同采收期满山红油的内在品质 ,本
实验采用梯度洗脱的高效液相色谱法来表征满山红
油的色谱特征色谱 ,并用聚类分析对不同产地或同
一产地不同采收期的样品进行分类 ,为满山红油的
进一步研究提供实验数据。
1　材料
Agilent 1100高效液相色谱仪(A gilent1100四
元泵 , Ag ilent 1100 二极管阵列检测器 , Agilent
1100色谱化学工作站); 牛儿酮对照品(中国药品
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生物制品检定所 ,批号 111665-200401);甲醇 、乙腈
为色谱纯;无水硫酸钠 、磷酸为分析纯;满山红生品
药材的样品号 、产地及采收时间见表 1。
表 1　17批满山红生药样品
Tab 1　17 batche s o f fo lium rhododendri daurici crude sam-
ple
样品号 产地 采收时间 样品号 产地 采收时间
1 黑龙江绿潭 2006年 10月 10 黑龙江浩良河 2006年 6月
2 黑龙江通河 2006年 10月 11 黑龙江浩良河 2006年 7月
3 黑龙江四丰山 2006年 10月 12 黑龙江浩良河 2006年 8月
4 黑龙江南岔 2006年 10月 13 黑龙江浩良河 2006年 9月
5 黑龙江汤旺河 2006年 10月 14 黑龙江浩良河 2006年 10月 4日
6 黑龙江申家店 2006年 10月 15 黑龙江浩良河 2006年 10月 28日
7 黑龙江朗乡 2006年 10月 16 黑龙江大兴安岭 2006年 7月
8 黑龙江勃力 2006年 10月 17 黑龙江大兴安岭 2006年 10月
9 黑龙江清河 2006年 10月
　　以上样品经佳木斯大学生药学教研室刘娟教授
鉴定为杜鹃花科植物兴安杜鹃 (Rhododendron
dauricum L.)的干燥叶 ,符合中国药典 2005 年版
一部的规定。
2　方法与结果
2.1　供试品的制备
2.1.1　满山红油的制备　取经粉碎过 30目筛的满
山红 100 g ,置于 2 000 mL 圆底烧瓶中 ,加 8倍量的
水浸泡过夜 ,按中国药典 2005 年版一部附录 Ⅹ D
中挥发油测定的甲法 ,水蒸气蒸馏提取 8 h ,收集挥
发油部分 ,加入无水硫酸钠脱水后 ,密封 、暗处冷藏 。
2.1.2　供试液制备　取满山红油 20 μL ,分别置 10
mL 量瓶中 ,加入乙腈至刻度 ,摇匀 。经0.45 μm 微
孔滤膜滤过 ,制成满山红油的供试品溶液 。取 牛
儿酮对照品约 10 mg ,精密称定 ,置 100 mL 量瓶中 ,
加入乙腈至刻度 ,摇匀 ,经0.45 μm 微孔滤膜滤过 ,
吸取滤液 1 mL 置 10 mL 量瓶中 ,加入乙腈至刻度 ,
配制 牛儿酮对照品溶液 。
2.2　色谱条件　色谱柱:Zorbax Eclipse XDB-C18
(4.6 mm ×250 mm ,5 μm),保护柱:Zo rbax SB-C18
柱(4.6 mm ×12.5 mm , 5 μm);流动相:乙腈(A)
-0.1%磷酸水溶液(B)作梯度洗脱 , 0 ～ 15 min:65%
A;15 ～ 40 min:65%A ～ 90%A;40 ～ 60 min , 90%A
～ 100%A;61 ～ 70 min:100%A 。流速:1.0 mL·
min
-1;柱温:室温;检测波长:210 nm ;光谱数据记录
范围:200 ～ 350 nm ,波长间隔:2 nm;色谱记录时
间:0 ～ 70 min;进样量:20 μL。
2.3　色谱指纹峰标定
2.3.1　特征峰选定　按“2.1.2”项下方法做空白试
验 ,结果见图 1。检出峰中峰面积最大值及峰高最
大值分别在 20 A 及 10 mAU 以下 ,因此选取 A rea
Reject=20 , Height Reject=10 对所有供试品进行
积分 ,选取有积分值的峰作为满山红油的特征峰 。
取满山红油(3号样品)的供试液按选定色谱条件测
定 ,记录其色谱图 ,按规定方法积分 ,有 32 个特征
峰。结果见图 2。
2.3.2　特征峰确认　取 牛儿酮对照品溶液按上
述色谱条件测定。比较对照品溶液的色谱图与供试
品溶液的色谱图 ,由色谱保留时间初步确定图 2中
的 9号峰为 牛儿酮峰 , 牛儿酮所在的 9号峰在
所选定的特征峰中 ,其峰高值居中 。采集纯组分对
照品色谱峰峰值处的光谱数据 A 和供试品溶液相
对应的色谱峰所包含的光谱数据矩阵 B(b1 , b2 , …
b i , …bm), m 为供试品目标色谱峰的保留时间点 ,运
用光谱相关色谱方法[ 2] ,分别以 B 的每一光谱矢量
b i对 A 进行正交投影运算(I-AA+)b i ,按公式 ci =
b iT(I-AA +)b i/ ( b i . (I-AA +)b i )计算
供试品溶液光谱正交投影前后光谱矢量的夹角余弦
ci(i=1 ,2 , … ,m),通过 ci接近于零的程度判定色谱
峰的纯度 。由计算结果得到 ,图 2 中的 9号峰为
牛儿酮纯色谱峰。选定 牛儿酮色谱峰为满山红油
图谱的参照峰 。
2.4　方法学考察
2.4.1　稳定性试验　取满山红生品药材(3 号样
品),制备满山红油供试液 ,分别于 0 , 8 ,16 ,24 ,32 h
测定特征图谱 ,考察相对保留时间 、峰面积比值的一
致性 。分析结果表明 ,供试品溶液在 32 h 内稳定 ,
选定的特征峰的相对保留时间的 RSD小于0.79%,
峰面积比值的 RSD小于1.11%。结果表明 ,选定的
特征峰的相对保留时间和峰面积比值相当一致 ,稳
定性良好 。
2.4.2　精密度试验　取由满山红药材(3号样品)
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制备的满山红油供试液 ,连续重复进样 5次 ,记录指
纹图谱。结果表明 ,所选定的 32个特征峰的相对保
留时间和相对峰面积比值无明显变化 , RSD分别小
于0.69%和1.65%,符合特征图谱要求 。
2.4.3　重复性试验　取满山红药材(3号样品)制
备 5份满山红油供试液 ,进行色谱测定 ,记录指纹图
谱。结果表明 ,所选定的特征峰的相对保留时间和
相对峰面积有较好的重复性 , RSD分别小于1.02%
和2.37%。
2.5　样品的特征色谱　制备满山红油供试液 ,在色
谱仪上于同 1 d内测定。按方法原理处理[ 3] ,得满
山红油供试液的全波长二维特征图谱 ,见图 3 。由
图 3可知 ,在 3号样品色谱中选定的 32个特征峰在
其它样品的色谱中存在 ,各样品之间的特征色谱较
相似 。
图 3　样品的全波长 HPLC二维特征图谱
Fig 3　HP LC f ingerprint tw o-dim en sion information data at fu ll
w avelength
2.6　信息处理
2.6.1　特征峰的聚类　采集满山红油特征图谱 32
个特征峰的相对峰比值数据 ,计算相应的均值(n=
5),以欧氏距离计算样品间的相似性近邻矩阵 X ,以
类平均法计算样本的同现矩阵Y ,由 X 和Y 计算得
同现相关系数为0.930 8[ 4] 。进行系统聚类 ,绘制系
统聚类树图 ,结果见图 4。由图 4的分析可知 ,由特
征峰的信息可将样本粗略地分为 2 类 ,即 1 号样品
与其他样品 ,但细化时又可归为若干小类 , 其中 3
号 、14号归为一小类 , 4号与 12号归为一小类 , 11
与 13号归为一小类 ,2号与 7号归为一小类。
图 4　样品的特征峰数据的层次聚类树图
Fig 4　T he dendrogram of hierarchical clustering f rom date of char-
acteri st ic peaks
2.6.2　单波长全部信息的聚类　首先采用局部最
小二乘校正方法[ 5] ,选定 3 , 19 , 29号特征峰对单波
长(210 nm)的各色谱保留时间进行校正 ,分别计算
满山红油样品的全部色谱信息的均值(n=5),而后
选用标准欧氏距离计算样品间的相似性的近邻矩阵
X ,选用类平均法计算样品的同现矩阵Y ,并进行系
统聚类分析 ,绘制系统聚类树图 ,结果见图 5 。对图
5的分析可知 ,样品的单波长全部信息的特征色谱
可分为 2类 ,即 1号样品与其它样品分别各归为一
类 ,在其他样品的一类中 ,归为若干小类 ,其中 15 ,
16号样品归为一小类 , 3 , 14 号样品归为一小类 , 4 ,
13号样品归为一小类 ,10 ,11号样品归为一小类 ,6 ,
12号样品归为一小类 ,7 ,8 号样品归为一小类。由
X 和 Y 计算同现相关系数 ,结果同现相关系数为
0.944 8。表明分类结构的拟合程度较特征峰的聚
类好 。
图 5　样品单波长全部信息的层次聚类树图
Fig 5　Dend rogram of hierarchical clus tering f rom w hole information
of sin gle-w avelen gth
2.6.3　全波长全部信息的聚类　首先采用局部最
小二乘校正方法[ 5] ,选定 3 , 19 , 29号特征峰对满山
红油的全波长(200 ～ 350 nm)二维特征图谱的各色
谱保留时间进行校正 ,分别计算满山红油样品的全
部色谱信息的均值(n=5),而后选用标准欧氏距离
计算样品间的相似性的近邻矩阵 X ,选用类平均法
计算样品的同现矩阵Y ,并进行层次聚类分析 ,绘制
层次聚类树图 ,结果见图 6。对图 6的分析可知 ,样
品的全波长的全部信息的特征色谱可分为 2类 ,即 1 ,
2 ,3 ,4 ,10 ,11 , 12 , 13号样品与 5 ,6 , 7 ,8 , 9 ,14 ,15 , 16 ,
17号样品分别各归为一类 ,其中 1 ,2号样品归为一
小类 ,3 ,4 号样品归为一小类 ,8 , 9号样品归为一小
类 ,10 ,11号样品归为一小类 ,14 , 15号样品归为一小
类 ,7 ,16号样品归为一小类。由 X和 Y计算同现相
关系数 ,结果同现相关系数为0.982 8。表明分类结
构的拟合程度较单波长全部信息的聚类好。
3　讨论
常规的 HPLC 特征图谱 ,需要选定一个波长以
保证色谱信息最大化 ,波长的选取缺乏客观性;在数
据处理过程中 ,因只有一个波长的色谱信息得到利
用 ,造成信息量的浪费 。所以单一波长下的特征图
·1664· 中国医院药学杂志 2008年第 28卷第 19期 Chin H osp Pharm J , 2008 Oct , Vol 28 , No.19
　　
图 6　样品全波长全部信息的层次聚类树图
Fig 6　Dendrogram of hierarchical clu sterin g f rom w hole informat ion
of fu ll w avelength
谱往往很难全面表达中药的内在质量信息。
全波长全部特征指纹信息的层次聚类树图与单
一波长全部信息和 32 个特征峰的层次聚类树图比
较分析表明 ,特征峰的信息可将样本粗略地分为 2
类 ,即第 1号样品与其他样品 ,但对不同产地或同一
产地不同采收期的样品较难断定。单一波长全部信
息的聚类结果表明单波长全部信息的特征色谱可分
为 2类 ,即第 1号样品与其他品分别各归为一类 ,但
对不同产地或同一产地不同采收期的样品的判断不
够理想。全波长全部色谱指纹信息的层次聚类表明
满山红油的全部特征色谱可分为 2类 ,即 1 ～ 4 , 10
～ 13号样品与 5 ～ 9 , 14 ～ 17 号样品分别各归为一
类。 10 ～ 17号样品各为同一产地不同采收期的样
品 ,其中 16 , 17号样品其虽为同一产地 ,但由于采收
时间的不同而没有归为同一小类 ,而是 16号样品与
7号样品归为同一小类并与 17号样品归为同一层
次;10 ～ 13号样品与 14 , 15号样品虽为同一产地的
样品 ,但由于采收期的不同而没有归为同一层次 ,各
样品的聚累情况与根据样品的推断相符。这是由于
采用全部色谱信息充分地利用了信息量 ,包含了所
有的特征色谱 ,更能提示色谱指纹的微小差异。
中国药典 2005年版一部采用 牛儿酮为鉴别
指标来控制满山红油的质量 ,但在满山红油的特征
色谱图中 牛儿酮并非为含量最高成分且含量分布
并不均匀 ,而满山红油中的高含量化学成分应有待
进一步深入研究 ,以便更科学合理的阐明满山红油
的内在质量。
在聚类分析计算过程中 ,曾选用最短距离法 、最
长距离法 、平均距离法 ,重心距离法和平方和递增
法 ,通过原始距离与各种算法的聚类树中的距离相
关性分析比较 ,所得的同现相关系数以平均距离法
即类平均法的结果为最佳 ,更接近于 1。聚类分析
时当使用欧氏距离 ,马氏距离或布洛克距离时 ,与标
准化欧氏距离的层次聚类结果接近 ,但计算所得的
同现相关系数均小于标准化欧氏距离的计算结果。
参考文献:
[ 1] 　中国药典.一部[ S] .2005:283.
[ 2] 　胡芸 ,梁逸曾 ,李博岩 ,等.多组分光谱相关色谱及其在中药色
谱指纹图谱中的应用[ J] .化学学报, 2003 , 61(9):1466-1470.
[ 3] 　邹纯才 ,鄢海燕.中药指纹图谱及其数字化[ M] .合肥:安徽科
学技术出版社 , 2008:196-197.
[ 4] 　T heodoridis S , Kout roumbas K.Pat tern Recognit ion(s econd
edi tion)[ M] .Beijing:China machin e press , 2003:66-70.
[ 5] 　谢培山.中药色谱指纹图谱[ M] .北京:人民卫生出版社 , 2005:
150-152.
[收稿日期] 2007-08-02
[ 作者简介] 魏玉辉 ,男 ,博士研究生 ,主管药师 ,电话:0931-8616392 , E-mail:xiananw u6511@163.com
六味地黄丸对大鼠肝微粒体代谢酶 P450活性的影响
魏玉辉1 ,秦红岩1 ,段好刚1 , 2 ,李波霞1 , 2 ,武新安1 　(1.兰州大学第一医院药剂科 ,甘肃 兰州 730000;2.兰州大学药学
院 ,甘肃 兰州 730000)
[ 摘要] 　目的:考察六味地黄丸对大鼠肝微粒体代谢酶 P450 活性的影响。方法:大鼠灌胃分别给予生理盐水 、西咪替丁 、苯
巴比妥钠和六味地黄丸 7 d 后 , 腹腔注射非那西丁 ,不同时间点采集血样 ,用 HPLC 法测定血浆中探针药物非那西丁的浓度 ,
用 DAS 软件估算其药动学参数。结果:生理盐水组 、西咪替丁组 、苯巴比妥钠组和六味地黄丸组探针药物的 t1/2分别为(93.5
±9.2),(161.7±11.0),(85.4±9.0),(67.0±6.7)min。结论:六味地黄丸对大鼠肝微粒体代谢酶 P450活性有一定的诱导作
用。
[ 关键词] 　六味地黄丸;肝微粒体代谢酶 P450;非那西丁
[中图分类号] R963　　[ 文献标识码] A　　[ 文章编号] 1001-5213(2008)19-1665-04
Effects of Liuwei Dihuang pill on liver cytochrome P450 in rats
·1665·中国医院药学杂志 2008年第 28卷第 19期 Chin H osp Pharm J , 2008 Oct , Vol 28 , No.19