全 文 ：[ 收稿日期] 　2005-03-03
[ 基金项目] 　吉林省科技发展计划项目(20030551-121)
[ 作者简介] 　付杨(1981-),女 ,硕士研究生;王丽(1957-),女 ,博士 ,教授 ,博士研究生导师 ,主要从事植物细胞工程研究.
[ 文章编号] 1000-1832(2005)02-0090-03
大叶柴胡愈伤组织继代培养及其 RAPD分析
付　杨 ,陈凤清 ,孙冬雪 ,苏全平 ,王　丽
(东北师范大学遗传与细胞研究所 ,吉林 ,长春 130024)
[摘　要] 　以野生的大叶柴胡为材料 ,通过离体培养诱导产生愈伤组织 ,利用 RAPD 分子标
记的方法 ,在 DNA 水平上分析野生植株和愈伤组织的遗传变异.从 13个 10碱基引物中筛选
出 7个引物 ,对它们的 PCR扩增结果进行了分析.结果表明柴胡愈伤组织与野生苗相比出现
了 DNA水平变异.
[关键词] 　大叶柴胡;愈伤组织;RAPD
[中图分类号] 　Q 943.1　　　[学科代码] 　180·5155　　　　[文献标识码] 　A
　　在植物无性繁育过程中尤其是植物的组织培
养过程中 ,体细胞无性系变异是普遍存在的一种
现象 ,它会直接影响到培养组织的分化能力和再
生植株的性状.这种现象有多种方法可以检测 ,最
简单的方法是表型鉴定 ,但一般需要通过特殊的
遗传设计来完成 ,需时长 、工作量大.核型分析能
够揭示显著的染色体结构变化 ,但不能发现单个
基因的变异.同工酶分析检测生化变异是相对方
便的方法 ,但可利用标记数目以及在区分近缘品
种上的困难 ,限制了它的应用.组织培养诱导的基
因序列变异 ,可以通过 RFLP 分子标记精确地检
测到 ,但受限于用做探针的基因序列 ,且耗费人力
和物力[ 1] .RAPD分析可以利用不同引物 ,同时快
速检测基因组多个位点的变异 ,此技术容易掌握
运用 ,可以大范围地检测多个基因组的变异[ 2] .
近年来 ,国外一些学者利用 PCR及其衍生技术对
多种材料如小麦 、水稻等[ 1 ,3]进行了体细胞无性
系变异的研究 ,证明 RAPD可以揭示体细胞无性
系 DNA 的多态性.
柴胡别名地熏 、茈胡 、茄草等 ,属多年生草本
伞形科植物 ,是我国的常用中草药之一.本文以大
叶柴胡为材料 ,以幼芽为外植体进行了离体培养 ,
获得了愈伤组织 ,并检测到明显的 RAPD谱带变
异 ,并对此变异进行了初步讨论 ,希望为揭示愈伤
组织细胞中体细胞无性系变异发生规律和特点提
供科学依据.
1　材料和方法
1.1　材料
供试材料为大叶柴胡(Bupleurum longira-
diatum Turcz),采自吉林省白山市江源县大阳岔
镇.取其幼芽为外植体离体培养获得愈伤组织.
1.2　愈伤组织诱导
取柴胡的幼芽用自来水反复冲洗后 ,用 75%
的乙醇灭菌3 min ,再用 0.1%HgCl2消毒 1 min.
无菌水冲洗三次 , 接种到含 6-BA 7.0mg/L ,
NAA 1.0 mg/ L 的 MS培养基上.
1.3　取样
愈伤组织形成后取样 ,从野生的大叶柴胡单
株取叶片.
1.4　DNA提取
参照 Ahuja 等人的方法[ 4] 并稍作改进.将
0.5 g 材料在液氮中用研钵研磨成粉状 , 加入
10 mL缓冲液(5 mmol/L EDTA , 350 mmol/ L 山
梨醇 , 0.1%巯基乙醇 , 10%PEG6000),将混合物
强烈振荡 5 ～ 10 s , 混匀.混合液在 4℃条件下
12 000 r/min离心 5 min.再将沉淀放入 5 mL 的
第 37 卷第 2 期 东 北 师 大 学 报 自 然 科 学 版 Vol.37 No.2
2005 年 6 月 JOURNAL OF NORTHEAST NORMAL UNIVERSITY June 2005
DOI :10.16163/j.cnki.22-1123/n.2005.02.020
CTAB(2.0%CTAB , 1.4 mol/L NaCl , 20 mmol/L
EDTA ,100 mmol/L Tris-HCl ,pH 8.0)中 ,加入 10
μL β-巯基乙醇.将混合物在 60℃下孵育 30 min.
然后用 5 mL V氯仿∶V异戊基醇=24∶1的混合液萃取.
以10 000 r/min离心10 min.再重复一次后取上清.
加0.7体积的异丙醇使其沉淀 ,常温下以 12 000
r/min 离心 20 min.再用 70%的乙醇清洗 , 将
DNA在空气中干燥 ,而后溶在 1mL TE 中.RNA
污染物可用 10 μg/mL 的 RNA 酶在 37℃下消化
30 min ,最后用苯酚萃取 ,乙醇沉淀.
1.5　随机引物
从 13个随机引物中选出 7个随机引物 ,序列
见表 1(由上海 Sangon公司合成)
表 1　筛选出的引物编号及其序列
引物 序列(5 ～ 3 ) 引物 序列(5 ～ 3 )
OPA-1 CAG GCC CTT C OPC-2 GTG AGG CGT C
OPC-6 GAA CGG ACT C OPC-7 GTC CCG ACG A
OPC-8 TGG ACC GGT G OPD-8 GTG TGC CCC A
OPD-11 AGC GCC ATT G
1.6　反应程序
PCR反应在 PCR 仪(P ×2 Thermal Cycler)
上进行 ,反应体积为 10 μL ,加 5μL Taq DNA 聚
合酶 ,1μL引物 , 1μL 的 DNA 模板 ,3μL 水.先在
94℃条件下预变性 2 min ,而后 94℃30 s ,35℃30
s , 72℃90 s ,循环 40次.最后在 72℃条件下保温
10 min.扩增产物在 TAE 缓冲液(pH 8.0)中用
2%的琼脂凝胶电泳检测 ,用溴乙非啶染色 ,紫外
灯下拍照.
2　结果
2.1　愈伤组织多次继代中的生长能力
柴胡的嫩芽培养一至两周后 ,一些切口部位
开始膨大 ,逐渐形成淡黄绿色 、致密状的愈伤组
织.每过三四周即可由 0.4 ～ 0.7 g 长至 2.0 ～
3.5 g ,对之进行继代培养 ,现已培养两年 ,继代近
30次 ,仍保持旺盛的生命力(见图 1).
图 1　柴胡的愈伤组织
2.2　体细胞无性系间的 RAPD多态性
柴胡的野生苗与愈伤组织 ,经过不同的引物
扩增后 ,可发现两者之间谱带强度和带型出现明
显变异(见图 2).由此可以看出在组织培养过程
中 ,愈伤组织已经发生了遗传学上的变化.同时对
野生苗进行抽样检测 ,未观察到个体间的差异.
不同引物扩增再生植株 ,出现了主带和弱带 ,
在谱带强度变化中 ,主带在某些愈伤组织大幅度
改变 ,与野生苗相比有着极明显的差异.如图 2中
的 7道 、8道 ,主带的位置发生了明显的变化 ,几
乎丧失了主观上的同源性.
3　讨论
3.1　RAPD的稳定性和可靠性
RAPD技术具有效率高 、样品用量少 、灵敏度
高 、特异性强和容易检测等特点[ 5] ,在没有任何
分子生物学研究的情况下 , 可以对某物种进行
DNA多态性分析 ,不受环境条件和生长发育状况
的影响 ,步骤简便 ,易程序化 ,可广泛应用于基因
定位 、基因克隆 、物种分类及进化研究 、作物育种 、
遗传资源评估 、生物防治等各个方面[ 6] .RAPD技
术的不足之处在于 ,可能产生非基因组 DNA 扩
增的假带 , PCR的动力学与扩增的特征比较复
杂 ,因此 ,必须严格地选择和控制实验条件 ,任何
参数的改变都可能导致扩增式样的变化 ,造成人
为假象.另外 ,高等植物的基因组较大 ,利用少数
引物检测的 DNA 序列非常有限 ,不可能覆盖整
个基因组[ 7] ,而引起表型差异的突变则可能位于
整个基因组一个很小的位点上 ,容易造成漏检 ,所
以应用 RAPD技术检测 DNA 片段存在一定的局
限性[ 8] .为此 ,笔者对 PCR反应体系中影响结果
的各种因素如 dNTP 的浓度 、Taq多聚酶浓度 、引
物浓度 、模板 DNA 量以及反应条件等进行了摸
索 ,建立了可重复的 RAPD 反应体系 ,保证了反
应的稳定性和结果的可靠性.当然 ,还要结合新的
分子生物学方法来检测变异 DNA片段.
3.2　愈伤组织基因突变的分子机理探讨
从研究结果可以推断 ,柴胡外植体(嫩芽)在
离体培养阶段 ,细胞在 DNA 水平已发生了变异 ,
从而产生基因突变.长期继代培养改变了柴胡基
因组中某些 DNA 序列的结构 ,使该部位原来的
结合位点发生变化或遭到破坏 ,甚至产生新的位
点 ,导致扩增带的缺失或增加;多拷贝引物结合位
点上某些碱基发生突变 ,使引物结合量减少 ,造成
了扩增量减少 ,或者新扩增片段与原有某条片段
具有相近的相对分子质量 ,导致谱带加深.
91第 2 期 付　杨等:大叶柴胡愈伤组织继代培养及其 RAPD 分析
1 , 3 , 5 , 7 , 9 , 11 , 13的DNA模板为野生的柴胡苗;2 , 4 , 6 , 8 ,10 , 12 , 14的 DNA 模板为愈伤组织.1和 2的引
物为 OPA-1 , 3和 4的引物为 OPD-8 , 5和 6的引物为 OPD-11 , 7和 8的引物为 OPC-2 , 9和 10的引
物为 OPC-6 , 11和 12的引物为OPC-7 , 13和 14的引物为 OPC-8.
图 2　柴胡野生苗及其愈伤组织用引物扩增后的实验结果
　　凝胶电泳显示出扩增产物的差异 ,证明遗传
物质 DNA发生了明显变化.这些序列很可能是
控制某些性状正常表达的结构基因或调节基因 ,
它们的变化干扰了这些基因的正常表达 ,使愈伤
组织无法再分化为再生苗.要提高柴胡体胚成苗
率 ,不能纯粹从生理的角度 ,仅由体胚发生与发育
以及再生过程来考虑 ,而应注意控制柴胡胚性愈
伤组织诱导 、继代 、体胚发生及其植株再生过程中
的变异.柴胡体胚发育障碍的根本原因是遗传因
素 ,而非生理因素.如果所诱导的体胚异常是由于
严重的遗传变异引起的 ,则通过调整培养基与培
养条件是无法使其植株再生的.同时 ,本试验还发
现离体培养中的诸多因素在一定程度上也影响柴
胡离体培养物的变异程度.因此 ,要减少柴胡离体
培养中的变异程度 ,解决柴胡体胚发育障碍 ,也要
从 2 ,4-D质量浓度 、继代时间 、外植体类型等影
响因素着手 ,以尽量减少离体培养过程中的遗传
变异.
[参　考　文　献]
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Long-term subculture of calli and RAPD analysis
in Bupleurum longiradiatum Turcz.
FU Yang ,CHEN Feng-qing , SUN Dong-xue , SU Quan-ping , WANG Li
(Institute of Genet ics and Cytology , Northeast Normal University , C hangchun 130024 , China)
Abstract:Bupleurum longiradiatumTurcz.were used fo r inducat iong of calli in vit ro.Genet ic dif ferences
between w ild plantlets and calli had been analysed on DNA level with the application of random amplified
polymo rphic DNA(RAPD)technology to the molecular genetic marker.The fingerprints amplification by
polymerase chain reaction(PCR)w ith 7 polymorphic 10-based random primers selected f rom 13 ones was
analy sised.The results indicated that there were genetic variation betw een wild plantlet and calli.
Keywords:Bupleurum longiradiatum Turcz;calli;RAPD
(责任编辑:方　林)
92 东 北 师 大 学 报 自 然 科 学 版 第 37卷