全 文 ：现代预防医学 2010 年第 37 卷第 14 期 Modern Preventive Medicine， 2010， Vol.37， NO.14
文章编号： 1003-8507（2010）14-2710-03 中图分类号： R512.6 + 2 文献标识码： A 【实验技术及其应用】
罗浮粗叶木醇提物治疗鸭乙型肝炎的实验研究
徐斌 1， 2， 谢志春 1， 林新勤 2， 韦金露 1
摘要： ［ 目的 ］ 观察罗浮粗叶木醇提物体内抗鸭乙型肝炎病毒 （duck hepatitis B virus， D-HBV） 的作用。 ［ 方法 ］
采用 RT-PCR 技术筛选 DHBV 阳性 3 日龄广西麻鸭 60 只。 将麻鸭随机分为空白对照组， 模型组， 罗浮粗叶木醇提物高、
中、 低剂量组和阿昔洛韦组。 用药前、 用药 d 7、 d 14、 d 21 及停药 d 5， 取各组麻鸭静脉血， 采用实时定量荧光 PCR
技术检测血清 DHBV-DNA 含量， 并检测血清中 AST、 ALT 含量和 DHBsAg OD 值； 停药 5 d 后取肝脏组织进行病理组织
学观察。 ［ 结果 ］ 观察期内， 罗浮粗叶木醇提物高、 中、 低剂量组与模型组病毒载量随时间的变化趋势都比较接近，
差异无统计学意义 （P﹥0.05）； 罗浮粗叶木醇提物高、 中、 低剂量组与模型组比较， DHBsAg 差异无统计学意义 （P﹥
0.05）； 罗浮粗叶木醇提物高、 中、 低剂量组 ALT、 AST 值与模型组比较， 差异无统计学意义 （P﹥0.05）； 肝脏病理检查
显示各组动物肝脏病变严重程度的差异无统计学意义 （P﹥0.05）。 ［ 结论 ］ 罗浮粗叶木醇提物高、 中、 低 3 个剂量组
均未见明显抑制 DHBV 复制的作用和对 DHBV 引起的肝损伤具有保护作用。
关键词： 罗浮粗叶木醇提物； 鸭乙型肝炎病毒； 荧光定量 PCR
THE EFFECT OF LASIANTHUS FARDII HANCE ON DUCK HEPATITIS B XU Bin， XIE Zhi-
chun， LIN Xin-qin， et al. （Guangxi Medical University， Nanning 530022， China）
Abstract： ［Objective］ To study the effect of the ethanolic extract of Lasianthus fardii Hance on duck hepatitis B， and
provide a possible experimental basis for developing a new drug for the treatment of hepatitis B. ［Methods］ Sixty DHBV posi-
tive ducklings were screened by Fluorescence Quantitative Polymerase Chain Reaction （FQ- PCR）. The infected ducks were di-
vided into five groups randomly by lamination stochastic method of distribution. Six groups were administered intragastricly with
high-dose ethanolic extract， middle-dose ethanolic extract， low-dose ethanolic extract of Lasianthus fardii Hance， acyclovir
（ACV）， model-control and normal-control. There were 12 ducklings in every group， and the ducklings had been treated for 14
days. The quantity of DHBV DNA， DHBsAg， ALT and AST in serum were detected before treatment （T0）， 7days （T7） and
14days （T14） after treatment， and 5 days after stopping treatment （P5）. Liver histopathological examination was done on the
5th days after stopping the treatment. ［Results］ The amount of DHBV DNA and DHBsAg in serum were not obviously differ-
ence between treatment group and the control group （P﹥0.05）. The activity of ALT and AST was not obviously difference when
all of the treatment groups was compared with the model-control group after treatment （P﹥0.05）. No obvious difference was ob-
served in the liver pathological examination among these six groups. ［Conclusion］ The three dose of the ethanolic extract of
Lasianthus fardii Hance could not inhibit the replication of DHBV and protect the liver function which was damaged by DHBV.
Key words： Ethanolic extract of Lasianthus fardii Hance； Duck hepatitis B virus； FQ-PCR
乙型肝炎是我国高发传染病之一 ， 每年有 28 万人死于
HBV 感染引起的疾病 ［1、2］。 治疗乙肝的措施主要有护肝、 调节
免疫、 抗病毒 3 个方面， 抗病毒是治疗乙肝的关键 ［3、4］。 天然
药物具有来源广泛， 毒性低和副作用小等特点。 福建宁化县畲族
群众长期以来利用罗浮粗叶木治疗肝炎及其所至的疲劳乏力［5］，
另外， 我国民间应用粗叶木植物治疗肝炎黄疸被收录在 《中华
本草》 ［6］中。 本实验旨在观察罗浮粗叶木体内抗鸭乙型肝炎病
项目基金： 广西壮族自治区教育厅研究生教育科研创新项目 （200810
5981004M230）
作者简介： 徐斌 （1976－）， 男， 硕士， 主管医师， 研究方向： 病毒性
肝炎防治
通讯作者： 谢志春， E-mail： zhichunxie@yahoo.com
作者单位： 1．广西医科大学流行病学教研室， 南宁， 530011； 2．南宁
市疾病预防控制中心
毒 （duck hepatitis B virus， DHBV） 和保肝护肝效果。
1 材料与方法
1.1 实验动物
1 日龄广西麻鸭 130 只， 购自南宁市饲料兽药禽苗市场，
雌雄不拘， 体质量 40～50 g。
1.2 主要药物
罗浮粗叶木由福建省三明市第二医院胡恩药师提供， 70%
乙醇 6 次提取后浓缩成含生药 6.62 g ／ g。 阿昔洛韦 （ACV），
由南京瑞尔医药有限公司生产， 含量： 0.1 g ／片。
1.3 主要试剂
DHBV 阳性标准血清由本实验室制备， Taq DNA 聚合酶
（Fermentas）， dNTP Mixture （上海生物工程有限公司 ） ， 6×
Loading Buffer （大连宝生物工程有限公司）， 天冬氨酸氨基转
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现代预防医学 2010 年第 37 卷第 14 期 Modern Preventive Medicine， 2010， Vol.37， NO.14
移酶试剂盒 （上海复星长征医学科学有限公司）， 丙氨酸氨基
转移酶试剂盒 （上海复星长征医学科学有限公司）， HBsAg 酶
联免疫检测试剂盒 （上海荣盛生物技术有限公司， Taqman 引
物探针由捷瑞生物工程 （上海） 有限公司合成， 扩增产物 180
bp， 上游引物： 5CCAAGATACTGGAGCCCAAATC 3， 下游引
物 ： 5GCCCATTGGAGCTTTCCTAAA 3， probe： 5FAM-CCGT
TGTCCGTCAGATACAGCAAGCCT-TAMARA 3。
1.4 主要仪器
7000 Fast Real-time PCR System （美国 ABI） ， 2 400 型
GeneAmp PCR system （美国 Perkin -Eimer corporation） UNI-
VERSAL HOOD Ⅱ型凝胶成像分析系统 （美国 Bio-Rad）。
1.5 动物模型的建立
取广西麻鸭 100 只， 腹腔注射 DHBV 强阳性血清 0.2 ml，
15 d 后经颈外静脉采血 1 ml， 10 000 r ／min 离心 5 min 后取血
清， 参考郭龙华等报道的裂解液煮沸法提取 DNA。 用 FQ-PCR
法检测， 选取血清病毒负荷在 104～106 copies ／μl麻鸭。
1.6 荧光定量 PCR 体系
反应液组成： 上游引物 0.15 μl， 下游引物 0.15 μl， Taq-
man 探针 0.15 μl， dNTP 0.25 μl， Taq 酶 0.2 μl， 10 ×PCR
buffer （without Mg2+） 2 μl， MgCl2 2 μl， 血清提取物 2 μl， 去
离子水 13.10 μl， 构建 20 μl 反应体系。 PCR 反应条件： 95℃
预变性 3 min； 95℃变性 30 s， 56℃退火 30 s， 72℃延伸 30 s，
共 35 个循环； 每次延伸结束时检测荧光强度。 数据读取和分
析均由 ABI Prism 7000 SDS 软件完成。
1.7 动物实验
RT-PCR 筛选 DHBV 血清病毒负荷在 104～106 copies ／μl 麻
鸭雏鸭 60 只， 随机分成 5 组， 每组 12 只： 模型组、 ACV 组、
罗浮粗叶木醇提物高剂量组、 罗浮粗叶木醇提物中剂量组、 罗
浮粗叶木醇提物低剂量组； 另取 PCR 筛选 DHBV 为阴性的 12
只麻鸭作为空白对照组。 各组均喂以普通饲料， 自由饮水。 将
ACV 研碎溶于水， 按 200 mg ／ kg.d 给 ACV 组雏鸭 1 次性灌胃。
罗浮粗叶木醇提物高、 中、 低剂量组分别按 2.86、 1.43、 0.72
g ／ kg.d 给药， 1 次 ／ d； 复测体质量 1 次 ／周， 根据体质量调整
用药剂量。 连续喂药 14 d 后， 停药观察 5 d。
1.8 检测指标
于用药前、 用药 d 7、 d 14 及停药后 d 5 各抽取雏鸭颈静
脉血 1.5 ml， 分离血清， 分装成两份， 分别用于 AST、 ALT、
DHBsAg 和病毒载量检测检测。 停药后 d 5， 将全部实验动物
处死后剖腹， 取肝脏组织行常规 HE 染色后观察炎症情况。
1.9 统计方法
数据处理分析均采用 DPS 统计软件 ［7］。 血清 DHBV-DNA
含量、 AST、 ALT 的数据采用重复测量资料的方差分析进行分
析， 病理检查的数据采用 Kruskal-Wallis 法进行秩和检验。
2 结果
2.1 用药前后病毒载量变化情况
罗浮粗叶木醇提物各剂量组 DHBV-DNA 载最变化的总体
趋势与模型组相似， 差异无统计学意义 （P﹥0.05）； ACV 组的
病毒载量与模型组的差异有统计学意义 （P = 0.043）， 但停药
后 DHBV-DNA 载量升至用药前水平。
2.2 用药前后 DHBsAg A 值的变化情况
正常组的 DHBsAg A 值明显低于各感染组， 差异有统计学
意义 （P﹤0.05）， 高、 中、 低剂量组以及 ACV 组与模型组比
较， 差异无统计学意义 （P﹥0.05）。
2.3 用药前后 ALT、 AST 活性变化情况
整个观察过程中， 各个时点正常组的 ALT、 AST 值明显低
于各感染组， 差异有统计学意义 （P﹤0.05）； 高、 中、 低剂量
组以及 ACV 组与模型组比较， 差异无统计学意义 （P﹥0.05）。

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现代预防医学 2010 年第 37 卷第 14 期 Modern Preventive Medicine， 2010， Vol.37， NO.14
在光镜下对每个标本的病变范围进行估计后， 以病变范围
占全部视野的 1 ／ 3、 2 ／ 3 作为划分肝脏病变轻、 中、 重的界线，
用 Kruskal-Wallis 法进行秩和检验得出 χ2 = 0.248， P﹥0.05，
各治疗组与模型组鸭子肝脏病变范围， 即严重程度总体相同。
见表 5。
3 讨论
DHBV 与 HBV 同属嗜肝 DNA 病毒科 ， 它们在形态 、 结
构、 复制、 组织亲和性等生物学特性等方面十分相似， 并且
DHBV 可人工感染雏鸭和鸭胚， 感染持续时间长， 无明显的自
然转阴现象， 因此国内外学者目前普遍采用 DHBV 感染 1～3
日龄雏鸭建立乙型肝炎动物模型进行筛选有效治疗药物， 因此
本实验应用 1 日龄雏鸭经颈静脉感染 DHBV 的方法来建立鸭
乙型肝炎动物模型进行罗浮粗叶木醇提物抗 HBV 疗效的初步
评价， 并用阿昔洛韦作为阳性药物对照。
本实验采用的基于 TaqMan 探针的实时荧光定量 PCR 法，
其基本原理是在常规 PCR 技术的基础上加入荧光素标记的探
针， 以显示 PCR 产物的动态积累， 在得到的 S 型扩增曲线的
前期阶段， PCR 反应符合指数性扩此可以在单纯指数方程的基
础上， 通过比较产物积累的速度 （时间） 进而确定初始模板的
分子量。 与传统的 Dot 免疫印迹法以及基于荧光染料的实时荧
光定量 PCR 法相比， 具有灵敏度高、 特异性强、 所需时问短
等特点。
本次动物实验结果表明： 罗浮粗叶木醇提物高、 中、 低剂
量 3 个治疗组都没有显示出明显的抑制鸭血清中 DHBV 活性
和抑制 DHBsAg 表达的的作用； 罗浮粗叶木醇提物的 3 个剂量
组均无降低 ALT、 AST 水平及改善肝功能的作用； 本实验中肝
脏 HE 染色病理检查各实验组间无统计学上的差异， 说明罗浮
粗叶木醇提物的 3 个剂量组均无保护肝脏的作用。 出现这种结
果的原因可能为： ① 用药剂量没达到有效水平； ② 观察例数
过少， 导致检验效能低； ③ 鸭乙型肝炎病毒作为人乙型肝炎
病毒的替代模型， 本身存在种属差异从而影响结果； ④ 罗浮
粗叶木醇提物没有抑制 DHBV 和保肝护肝的作用。
参考文献：
彭文伟. 传染病学 ［M］. 第 6 版. 北京： 人民卫生出版社， 2005.
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唐启义， 冯明光 . 实用统计分析及其 DPS 数据处理系统著［M］.
北京： 科学出版社， 2002.
（收稿日期： 2009-08-31）
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