全 文 ：Chinese Journal of New Drugs 2014，23(21)
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中国新药杂志 2014 年第 23 卷第 21 期
［基金项目］ 广西医学科学实验中心资助( KFJJ2011-09)
［作者简介］ 杨桂君，女，本科，研究方向:临床医学实验。联系电话: 13517834888，E-mail: 995210633@ qq． com。
［通讯作者］ 李勇文，男，博士，教授，硕士生导师，主要从事抗乙肝药物、抗纤维化药物研究。联系电话: ( 0773) 5895291，E-mail: liyongwen99
@ 163． com。
·实验研究·
蝉翼藤有机酸提取物抑制鸭体内乙肝病毒复制及保肝作用
杨桂君1，李 丽3，李勇文2，李勇军4，容明智3
(1 桂林医学院附属医院临床医学实验教学中心，桂林 541001;2 桂林医学院药理教研室，桂林 541004;
3 桂林医学院机能教研室，桂林 541004;4 广西柳州化工有限责任公司，桂林 545002)
［摘要］ 目的:研究蝉翼藤有机酸类提取物(CYTYJS)对鸭乙型肝炎病毒(DHBV)复制的抑制作用与保
肝的作用。方法:将 DHBV DNA 阳性的广西麻鸭，随机分成 5 组，分别为 CYTYJS 高、中、低剂量(20，10，5
mg·kg －1·d －1)组，模型组和拉米夫定(3TC)组。于用药前(T0)、用药 7 d(T7)、14 d(T14)、21 d(T21)及停药后
3 d(P3)分别采血，检测血清中 DHBV DNA 的滴度、丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天门冬氨酸氨基转移酶
(AST)的含量，实验结束时，取肝组织做病理学检查。结果:与模型组比较，CYTYJS 各剂量组用药后血清
DHBV DNA滴度显著降低(P ＜ 0． 05 或 0． 01)，停药 3 d 后，CYTYJS 各剂量组 DHBV DNA，ALT和 AST 仍在
较低水平(P ＜ 0． 05)而阳性组则有明显回升现象;镜下观察各组肝脏组织切片，与模型组比较 CYTYJS 高、
中、低剂量组肝脏的病理改变有明显改善。结论:CYTYJS有一定的抗乙肝病毒和保肝的作用。
［关键词］ 蝉翼藤;鸭乙型肝炎病毒;拉米夫定
［中图分类号］ Ｒ978． 7 ［文献标志码］ A ［文章编号］ 1003 － 3734(2014)21 － 2552 － 05
Organic extracts from the securidaca inhibit duck hepatitis B virus
replication in vivo and the hepatoprotective effect
YANG Gui-jun1，LI Li3，LI Yong-wen2，LI Yong-jun4，ＲONG Ming-zhi3
(1 Clinical Medical Experiment Teaching Center of Affiliated Hospital of Guilin Medical College，Guilin 541001，
China;2 Department of Pharmacology，Guilin Medical College，Guilin 541004，China;
3 The Functional Laboratory of Guilin Medical College，Guilin 541004，China;
4 Liuzhou Chemical Industry Co．，Liuzhou 545002，China)
［Abstract］ Objective:To determine the inhibiting effect of organic acids extracted from the securidaca in-
appendiculata (CYTYJS)on DHBV replication and the protective effect on liver function． Methods:The DHBV-
DNA positive ducks from Guangxi Zhuang Autonomous Ｒegion were randomly divided into five groups，and treated
with CYTYJS (20，10 and 5 mg·kg －1·d －1)or lamivudine (positive control)． Before treatment (T0) ，seventh
days (T7) ，fourteenth days (T14)and twenty-first days (T21)after treatment，and third days after drug withdrawal
(P3) ，blood samples were collected to determine the serum contents of DHBV-DNA，ALT and AST，respectively．
At the end of the experiment，histopathological changes of the liver were examined． Ｒesults:After treatment with
CYTYJS，the serum DHBV DNA titer significantly decreased compared with the model group (P ＜ 0． 05 or 0． 01)．
At the 3th day after withdrawal，the titer of DHBV DNA，and the levels of ALT and AST in each CYTYJS group
were still in a lower level，while there was an obvious rebound phenomenon in the positive control (lamivudine)．
The light microscopic examination of liver biopsy showed that pathological changes were significantly improved in
CYTYJS groups and the positive control group compared with model group． Conclusion:CYTYJS have the anti-
hepatitis B virus and hepatoprotective effect．
［Key words］ securidaca;duck hepatitis B virus;lamivudine
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乙型肝炎是感染乙肝病毒(HBV)引起的一种
常见传染病和多发病，易转化为慢性，甚至发展为肝
硬化、肝癌。目前研究表明，乙型肝炎的发病主要与
免疫力低下、病毒持续感染以及进行性肝细胞损伤
有关，而某些中药提取物可三方面并重，从而提高疗
效［1］。广西特色植物蝉翼藤(Securidaea inappendic-
ula Hasskd．)为远志科、远志族蝉翼藤属攀援灌木，
味酸涩，性凉，有祛风湿、清热利尿、活血化瘀、消肿
止痛等功效，现代药理学研究显示其具有较强的抗
菌消炎、抗癌、抗病毒、抗 HIV、免疫增强等多种活
性，主要用于治疗急慢性肝炎，黄疸，跌打损伤、风湿
骨痛等［2 － 3］。本课题组通过鸭乙肝模型，首次观察
了蝉翼藤有机酸类提取物(CYTYJS)对鸭乙型肝炎
病毒(DHBV)复制的抑制作用与保肝的作用。
材 料
1 动物与试药
广西麻鸭，体重 40 ～ 50 g，1 日龄，雌雄兼用，由
桂林畜牧种苗场提供(动物生产许可证号:SYKG 桂
2003-0003)。鸭乙型肝炎病毒 DNA(DHBV DNA)
阳性血清采自广西桂林麻鸭，经 4 000 r·min －1离心
分离所得，并于 － 20 ℃保存。该血清经 PCＲ 检测，
证实其含有 DHBV DNA，并以此血清作为实验
毒种。
蝉翼藤(购自广西玉林药材市场，经广西医科
大学李梅教授鉴定为远志科五味藤属蝉翼藤) ;蝉
翼藤有机酸提取物(本教研室自行提取与鉴定) ;拉
米夫定(葛兰素-史克制药(苏州)有限公司产品，批
号:09010007) ;ALT，AST 检测试剂盒(南京建成生
物工程研究所) ;荧光定量 PCＲ检测试剂盒(北京爱
德莱生物科技有限公司)。
根据 GenBank 鸭 HBV 基因序列(登录号:
M32990)和参照文献［5］，设计引物序列(FP:5-AAC-
CATTGAAGCAATCACTAGAC-3，ＲP:5-ATCTATGGTG-
GCTGCTCGAACTA-3) ，扩增片段大小为:218 bp，引物
由上海基康生物技术有限公司合成。
方 法
1 蝉翼藤有机酸提取物的制备
蝉翼藤根皮粗粉，用石油醚 30 ～ 60 ℃回流提
取脱醋，残渣用乙醇加热回流提取，滤过，取滤液减
压浓缩至无醇味，加水适量使溶解，通过大孔树脂
柱，相继用水、乙醇适量洗脱，收集 60%乙醇洗脱
液，减压浓缩至干，残渣用甲醇使溶解，活性碳脱色，
加入倍量乙醚，置 5 ～ 8 ℃冷藏 12 h 以上，滤过，残
渣以甲醇-乙醚重结晶，得到白色无定形结晶，经鉴
定为有机酸类化合物。
2 动物模型的构建
给健康成年广西麻鸭产的蛋孵化 1 日龄雏鸭，
胫静脉注射 0． 1 Ml DHBV DNA 阳性病毒血清。接
种 3 d后分别从颈静脉采血 0． 2 ～ 0． 3 mL，分别装入
一次性 Eppendoff 管中，整个过程避免交叉污染。
14 000 r·min －1离心 3 min，取血清，PCＲ法检测筛选
出阳性感染鸭(血清病毒负荷 106 ～ 108 copies·
μL －1)。PCＲ扩增条件:94 ℃预变性，10 min;94 ℃
变性，30 s;58 ℃退火，30 s;72 ℃延伸，30 s。共反应
25 个循环。最后一个循环后 72 ℃延伸 10 min。
3 实验分组及给药
经 PCＲ法检测筛选出阳性感染鸭共 50 只，作
为实验动物。将 50 只鸭随机分为 5 组，每组 10 只。
各组动物在同样条件下饲养，均按下列药物以每日
2 次(早、晚各 1 次) ，空腹灌胃给药 21 d。模型组
(生理盐水) ，拉米夫定(20 mg·kg －1·d －1) ，CYTYJS
高、中、低剂量组(20，10，5 mg·kg －1·d －1)按相应剂
量处理，并于用药前(T0)、用药 7 d(T7)、用药 14 d
(T14)、用药 21 d(T21)、停药 3 d(P3)时，分别从胫静
脉采血，每只采血 1． 5 mL 左右，4 000 r·min －1离心
分离血清，－ 20 ℃保存，备用。
4 FQ-PCＲ检测鸭血清中 DHBV DNA的滴度
提取的 DHBV DNA 进行 PCＲ 扩增，将扩增产
物用 DNA片段玻璃奶快速纯化回收后，用核酸蛋白
测定仪测定浓度后作为定量对照品。检测方法按照
荧光定量 PCＲ 检测试剂盒要求操作，扩增条件:
95 ℃变性 10 s;55 ℃退火 20;72 ℃延伸 30 s。共反
应 40 个循环。
5 肝功能的测定
用全自动生化分析仪测各组鸭血清中 ALT 和
AST的含量，方法按试剂盒说明书进行。
6 各组鸭肝脏组织病理(HE染色)的检测
停药 3 d后，剖杀各组麻鸭，取小块肝组织固定
于 10%甲醛溶液中，石蜡包埋并切片，HE 染色，光
镜下观察各组肝组织病理学变化。
7 统计学分析
应用 SPSS 17． 0 软件进行统计学处理，计量资
料均采用 珋x ± s 表示，治疗前后比较采用配对资料 t
检验，组间比较采用方差分析，各均数两两比较。
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结 果
1 鸭血清中 DHBV DNA的滴度变化
各组鸭血清中 DHBV DNA 的滴度变化结果见
表 1，结果显示模型组用药前后血清中 DHBV DNA
滴度无明显降低。拉米夫定组用药 7 d 后血清中
DHBV DNA滴度显著降低(P ＜ 0． 01) ，但停药 3 d后
有显著的反跳现象。CYTYJS 20，10，5 mg·kg －1·d －1
分别于 d 7(T7)、d 14(T14)、d 21(T21)开始出现 DH-
BV DNA滴度降低(P ＜ 0． 05 或 P ＜ 0． 01) ，停药 3 d
DHBV DNA滴度仍在较低水平，反跳现象不显著，
见表 1 及图 1。
表 1 蝉翼藤有机酸成分对鸭血清 DHBV DNA滴度的影响 × 108，n = 10，珋x ± s
组别 剂量 /mg·kg －1·d －1 T0 T7 T14 T21 P3
模型组 — 1． 50 ± 0． 77 1． 44 ± 0． 80 1． 40 ± 0． 91 1． 45 ± 0． 81 1． 42 ± 0． 74
拉米夫定 20 1． 51 ± 1． 07 0． 61 ± 0． 34b 0． 47 ± 0． 24b 0． 38 ± 0． 32b 1． 20 ± 0． 71
CYTYJSH 5 1． 48 ± 0． 76 0． 88 ± 0． 48a 0． 63 ± 0． 40b 0． 57 ± 0． 52b 0． 68 ± 0． 21b
CYTYJSM 10 1． 46 ± 0． 75 1． 11 ± 0． 27 0． 79 ± 0． 57a 0． 72 ± 0． 59a 0． 85 ± 0． 31a
CYTYJSL 20 1． 47 ± 0． 54 1． 17 ± 0． 48 0． 89 ± 0． 64a 0． 81 ± 0． 51a 1． 01 ± 0． 69
与模型组比较，a:P ＜0． 05，b:P ＜0． 01(下同)
图 1 蝉翼藤有机酸成分对鸭血清
DHBV DNA滴度的影响
2 CYTYJS对鸭肝损伤的保护作用
各用药组与模型组比较，用药前(T0)AST 和
ALT含量无差别，用药 2 周(T14)、3 周(T21)后，谷草
转氨酶 AST 有下降趋势，而 ALT 含量只有在 3TC
组、高剂量组和中剂量组中才出现下降趋势，且 3TC
与 CYTYJS高剂量组有显著性差异(P ＜0. 01)。
见表 2 ～ 3 及图 2。
图 2 CYTYJS对鸭血清 ALT和 AST的影响
表 2 CYTYJS对鸭血清谷丙转氨酶(ALT)的影响 U·L －1，珋x ± s
组别 剂量 /mg·kg －1·d －1 T0 T7 T14 T21 P3
模型组 — 17． 58 ± 3． 44 28． 30 ± 5． 41 41． 74 ± 3． 33 47． 45 ± 4． 21 55． 20 ± 3． 89
拉米夫定 20 16． 11 ± 2． 23 26． 18 ± 3． 22 19． 27 ± 1． 13b 17． 34 ± 1． 45b 41． 76 ± 7． 65b
CYTYJSH 5 16． 85 ± 2． 12 21． 14 ± 3． 44a 16． 53 ± 1． 23b 15． 67 ± 2． 22b 47． 51 ± 4． 45a
CYTYJSM 10 15． 08 ± 2． 34 26． 48 ± 5． 11 23． 48 ± 3． 44b 19． 84 ± 4． 22b 50． 20 ± 3． 21
CYTYJSL 20 17． 58 ± 2． 33 27． 30 ± 2． 11 23． 48 ± 3． 44b 43． 67 ± 2． 11 53． 85 ± 6． 22
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表 3 CYTYJS对鸭血清谷草转氨酶(AST)的影响 U·mL －1，珋x ± s
组别 剂量 /mg·kg －1·d －1 T0 T7 T14 T21 P3
模型组 — 12． 13 ± 4． 11 41． 75 ± 5． 23 42． 20 ± 3． 66 44． 36 ± 7． 11 45． 51 ± 4． 89
拉米夫定 20 9． 66 ± 4． 55 35． 94 ± 6． 44 28． 90 ± 5． 22b 20． 70 ± 4． 54b 36． 10 ± 7． 32a
CYTYJSH 5 10． 95 ± 7． 33 31． 35 ± 6． 33a 25． 38 ± 6． 44b 20． 81 ± 8． 11b 41． 67 ± 4． 44
CYTYJSM 10 13． 82 ± 4． 55 33． 09 ± 6． 57a 27． 46 ± 7． 33b 25． 45 ± 5． 33b 42． 56 ± 7． 44
CYTYJSL 20 14． 37 ± 6． 44 35． 23 ± 8． 33 30． 43 ± 4． 33b 28． 52 ± 7． 44b 47． 92 ± 5． 33
3 组织病理检测结果
正常鸭肝细胞经DHBV感染后，肝细胞重度水样
变和气球样变，弥漫性重度脂变(图 3B) ;胞浆疏松，
汇管区可见炎细胞浸润;阳性组形态正常;使用不同
浓度蝉翼藤有机酸类提取物(CYTYJS)处理后的鸭肝
细胞均有不同程度肝细胞水样变和气球样变，弥漫性
脂肪变、肿胀，部分可见汇管区及小叶间隔炎症细胞
浸润。其中，CYTYJS 5 mg·kg －1·d －1组肝细胞空泡变
性程度较重，与模型组无差异，并可见坏死、增生现
象。随着 CYTYJS浓度升高，肝细胞病变程度逐渐减
轻，CYTYJS 20 mg·kg －1·d －1组肝细胞水肿程度较轻，
好于模型组对照组，与阳性对照组相比较，相差无异。
图 3 鸭肝脏组织病理检测结果(HE，× 100)
讨 论
本课题组一直致力于广西特色中草药用于抗炎
免疫的研究。蝉翼藤广泛分布于广西各地，是广西
特色中草药，也是正骨水、消肿止痛精的主要成分。
在广西民间有用于治疗肝炎的习惯，现有的药理学
研究表明，蝉翼藤具有较强的抗菌消炎、抗癌、抗病
毒、抗 HIV、免疫增强等多种活性，具有较好的研究
价值和广阔的开发前景［2 － 5］。广西麻鸭乙型模型具
有病程规律、稳定，无自然转阴、结果可靠等优点，本
研究主要是利用广西麻鸭乙肝动物模型，观察
CYTYJS 在体内的抗乙肝病毒作用及保肝作用。
肝脏感染乙肝病毒后最主要的病理组织学表现
为肝细胞的水样变和气球样变，水样变和气球样变
的程度与肝细胞的损伤程度正相关，与血清中谷丙
转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)的含量正相关。
与模型组比较，CYTYJS高、中、低剂量组肝细胞的
(下转第 2567 页)
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究基础上，将单味药建立的一测多评方法应用于中
成药复方丹参片皂苷类成分的多指标质量评价，进
一步证明了一测多评法用于中成药同类多成分质量
评价的可行性，为解决中成药多指标质量评价面临
的对照品短缺和高昂检测成本问题进行了可行性
研究［13］。
［ 参 考 文 献 ］
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编辑:周卓 /接受日期:
檴檴檴檴檴檴檴檴檴檴檴檴檴檴檴檴檴檴檴檴檴檴檴檴檴檴檴檴檴檴檴檴檴檴檴檴檴檴檴檴檴檴檴檴檴檴
2014 － 08 － 20
(上接第 2555 页)
水样变和气球样变均有不同程度的改善，高、中剂量
组血清中谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)的
含量与模型组有差异(P ＜ 0． 05 或 0． 01) ，提示
CYTYJS 具有较好的保护肝细胞作用。
本实验结果显示，CYTYJS 在携带鸭乙肝病毒
的麻鸭体内具有抑制 DHBV 复制的活性，其疗效与
用药剂量与给用时间呈现正相关。d 7 时，CYTYJS
各组均呈现出抑制 DHBV 复制的作用，高剂量组效
果最为明显，与模型组相比较差异明显，低、中剂量
虽然降低但无统计学意义。在 d 14 及 d 21 时，CY-
TYJS高、中、低剂量组均呈现出抑制 DHBV 复制的
作用，与模型组相比较差异明显，均有统计学意义。
拉米夫定在整个用药期间均明显抑制鸭乙肝病毒复
制，使病毒水平处于较低水平，效果比 CYTYJS 高剂
量组好，但在停药后的 d 3 检测时，拉米夫定组病毒
含量出现较快反弹回升。虽然在停药后 d 3 CYTYJS
各组病毒含量也有所回升，而其回升速度较拉米夫
定组慢，显示出其抑制病毒复制活性较为恒定持久
的特点。这是否预示着其具有独特的作用机制?本
次仅观察了 CYTYJS 的药效学，回答这个问题尚需
要进一步的深入研究。
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编辑:郭超伟 /接受日期:2014 － 06 － 16