全 文 ：中国药房 2008年第 19卷第 33期 China Pharm acy 2008 Vol.19 No.33 · 2563·
复方六月雪对鸭乙型肝炎病毒的抑制作用研究 Δ
张士军 *,焦 杨 ,林 兴 ,蒋伟哲 ,黄仁彬 #(广西医科大学药理学教研室 ,南宁市 530021)
中图分类号 R285.5;R978.7 文献标识码 A 文章编号 1001-0408(2008)33-2563-03
摘 要 目的:观察复方六月雪(CLYX)对鸭乙型肝炎病毒乙型肝炎表面抗原(DHBsAg)和乙型肝炎 E抗原(DHBeAg)的抑制作
用 。方法:采用 1 d龄雏鸭接种广西麻鸭 DHBV 强阳性血清 , 13 d后用聚合酶链式反应(PCR)法筛选出 DHBV 强阳性鸭 。随机分
成 5组:CLYX 高 、中 、低剂量和模型 、阳性对照组 ,每组 10只 ,各组雏鸭均灌胃给药 14 d 。于用药前(T 0)、用药 7 d(T 7)和 14 d(T 14)
及停药后 3 d(P 3)分别采血 ,采用酶联免疫吸附(ELISA)法测定上清液 DHBsAg 和 DHBeAg 的滴度 。结果:CLYX 高、中剂量组用
药后血清 DHBsAg 和 DHBeAg 的滴度显著降低(P <0.01);停药 3 d后 ,CLYX 高 、中剂量组血清 DHBsAg 和 DHBeAg 的滴度无
反跳现象 。CLYX 抑制 DHBsAg 和 DHBeAg 的作用有明显的量效和时效反应关系 。结论 :CLYX 可有效地抑制 DHBsAg 和
DHBeAg 的表达 。
关键词 复方六月雪;鸭乙型肝炎病毒;鸭乙型肝炎表面抗原;鸭乙型肝炎 E抗原 。
Inhib itory Ef fect of Compound Liuyuexue on Duck Hepatitis B Virus
ZHANG Shi-jun , JIAO Yang , LIN Xing , JIANG Wei-zhe , HUANG Ren-bin(Dept.of Pharmacolog y ,
Guangx i M edical Universi ty ,Nanning 530021 , China)
ABSTRACT OBJECTIVE:To study the inhibito ry e ffects of t raditional chinese medicine Com pound Liuyuexue (CLYX)on
hepatitis B sur face antigen(DHBsAg)and hepa titis B e-antigen(DHBeAg).METHODS :One-day old guangx i b row n spo tted
ducks infected with DHBV w ere used as the hepatitis B virus infec ted animal m odel.Positive ducks w ere detected by PCR at 13
days a fter the infection of DHBV , and were randomly divided into five g roups:the high dose group , middle dose group and low
dose group o f Com pound Liuyuexue(CLYX), model group , and positive cont rol g roup , w ith 10 ducks in each group.CLYX
w as g iven ig.fo r 14 days.Serum sam pling w as scheduled at 0 , 7 , 14 days respective ly and 3 days af te r drug w ithdraw al , and
the contents o f DHBsAg and DHBeAg in se rum w ere measured by ELISA.RESULTS:The serum DHBsAg and DHBeAg
conten ts in high dose and middle dose groups of CLYX w ere decreased significantly(P<0.01)and w hich did no t rebound 3
days af te r drug w ithdraw al , and its inhibito ry effects on DHBsAg and DHBeAg assumed an obvious dose-and time -depen-
dent manner.CONCLUSION :CLYX can effectively inhibit the expressions o f DHBsAg and DHBeAg.
KEY WORDS Com pound Liuyuexue(CLYX);Duck hepa titis B v irus(DHBV);DHBsAg ;DHBeAg
六月青系爵床科 (Acanthaceae)肖鸡笼属植物肖鸡笼
Taraphochlamys a f f inis(Giff)Brem ekhu的干燥地上部分 [1 ] ,
为广西民间草药 。它与白花蛇舌草等组成复方六月雪(CLYX)。
CLYX 是通过民间长期临床观察而拟定的治疗急 、慢性乙型肝
炎的验方 ,临床疗效显著 。
实验研究发现 , CLYX 对四氯化碳 、对乙酰氨基酚 、D -半
乳糖胺等所致小鼠急性化学性肝损伤均有显著的保护作用 [2 ];可
有效抑制 HepG2.2.15细胞 HBsAg 和 HBeAg 的表达 [3 ]。笔者
以广西麻鸭为研究对象 , 观察 CLYX 在体内对鸭乙型肝炎病
毒乙型肝炎表面抗原(DHBsAg)和乙型肝炎 E抗原(DHBeAg)
的抑制作用 ,为开发 CLYX用于乙型肝炎治疗提供实验依据。
1 材料
1.1 仪器
Model 450型自动酶标仪(美国 Bio-Rad公司)。
1.2 试药
CLYX(广西医科大学药理学教研室采用全方醇水双提的
最佳工艺 [4 ]提取 ,其中齐墩果酸含量为 1.24 mg ·g -1 , 总黄酮
含量为 13.03 mg ·g -1);阿昔洛韦(ACV , 湖南迪诺制药有限
公司医药工业研究所 , 批号:20040829):HBsAg 和 HBeAg 酶
联免疫检测试剂盒 (上海荣盛生物技术有限公司 , 批号 :
20041209)。
1.3 动物
广西麻鸭 ,体重(50±5)g , 1 d龄 , ♀♂不限 , 60只 ,由广西
畜牧良种养殖场提供 (动物生产许可证号:SYKG 桂 2003-
0005)。
2 方法与结果
2.1 广西麻鸭乙肝动物模型的建立
采用健康成年广西麻鸭产的蛋孵化 1 d龄雏鸭 ,ip 0.2 mL
DHBV DNA 强阳性病毒血清 。接种 1周后分别从胫静脉采血
约 0.2～ 0.3 mL 左右 ,装入一次性 Eppendo ff管中 ,整个过程不
能交叉污染 。4 000 r ·min -1离心 5 min ,取血清 , —20 ℃保存 ,备
用 。采用聚合酶链式反应(PCR)法检测筛选出阳性感染鸭 。
2.2 实验分组及用药
经 PCR法检测筛选出阳性感染鸭共 50只 , 饲养至 13 d ,
作为实验动物 。将 50只鸭随机分为 5组 ,每组10只 。各组动物
Δ广西科学研究与技术开发计划项目(桂科攻 0322024-5E);广
西科学基金项目(桂科基 0731066);广西研究生教育创新计划资助项
目(2006105981007D14)
*副教授 ,博士。研究方向:抗肝炎药物。电话:0771-5358272。
E-mail:zsjun66@sina.com
#通讯作者:教授 , 博士研究生导师。研究方向:抗肝炎和抗心血
管疾病药物。 E-mail:huangrenbin518@163.com
· 2564· China Pharmacy 2008 Vol.19 No.33 中国药房 2008年第 19卷第 33期
在同样条件下饲养 ,均按下列药物以每日 2次(早 、晚各 1次)、
空腹 ig 给药 14 d 。模型组:等量的生理盐水;ACV 组:ACV ,
0.1 mg ·kg -1·d -1;CLYX 高 、中 、低剂量(CLYXH 、CLYXM 、
CLYX L)组:6.6 、3.3 、1.7 g ·kg -1·d -1。于用药前(T 0)、用药 7
d(T 7)、用药 14 d(T 14)、停药 3 d(P 3)时 ,分别从胫静脉采血 ,每
只采血 0.5 mL左右 ,分离血清 , —20 ℃保存 ,备用。
2.3 统计学方法
采用 S PSS 11.0统计软件分析数据 , 治疗前 、后比较采用
配对资料 t检验 ,组间比较采用方差分析 ,各为均数两两比较 。
2.4 酶联免疫吸附 (ELISA)法定量检测 DHBsAg 和
DHBeAg的滴度
将 —20 ℃保存的血清同时同批试剂盒采用 ELISA 法检测
DHBsAg 和 DHBeAg 的滴度 , 结果以抑制率表示 。药物对抗原
的抑制率= [ 1 —实验孔抗原光密度 (OD)值/对照孔抗原 OD
值] ×100%。
采用 ELISA 法 , 检测 CLYX 治疗前 , 后鸭血清 DHB-
sAg 的滴度 。与模型组比较 ,ACV 组与 CLYXH 、CLYXM 组
用药 7 d(T 7)后 , 均可使鸭血清 DHBsAg 的滴度显著降低
(P <0.01), 且随着药物浓度和作用时间的增加 , 其抑制作用
逐渐增强 , 呈现明显的量效和时效反应关系;停药 3 d(P 3)后 ,
CLYXH 组血清 DHBsAg 的滴度无反跳现象 。CLYX 体内抗
DHBV DNA 的作用强于阳性对照药物 ACV , 其中 CLYXH 组
抑制效果最佳 ,其用药 14 d(T 14)和停药 3 d(P 3)的抑制率分别
达到 50.70%和 58.02%。CLXY 对鸭血清 DHBsAg 表达的抑
制作用见表 1。
采用 ELISA 法 , 检测 CLYX 治疗前 、后鸭血清 DHBeAg
的滴度 。与模型组比较 ,ACV 组与 CLYXH 、CLYXM 组用药 7 d
(T 7)后 ,均可使鸭血清 DHBeAg 的滴度显著降低(P <0.01或
P <0.05),且随着药物浓度和作用时间的增加 ,其抑制作用逐
渐增强 , 呈现明显的量效和时效反应关系;停药 3 d(P 3)后 ,
CLYXH 组血清 DHBeAg 的滴度无反跳现象 。CLYXH组抑制
效果最佳 , 其用药 14 d(T 14)和停药 3 d(P 3)的抑制率分别达到
33.21%和 39.23%。CLXY 对鸭血清 DHBeAg 表达的抑制作
用见表2。
表 1 CLYX对鸭血清 DHBsAg表达的抑制作用(x ±s , n=10)
Tab 1 Inhib itory ef fect of CLYX on DHBsAg in serum of duck(x ±s , n=10)
组别 T 0 T 7 T 14 P3
OD OD 抑制率/% OD 抑制率/ % OD 抑制率/ %
模型组 0.198±0.019 06205±0.020 - 0.201±0.019 - 0.216±0.018 -
ACV组 0.200±0.026 0.121±0.026* 41.33 0.097±0.028* 51.74 0.137±0.027* 36.48
CLYXH组 0.209±0.031 0.128±0.031* 37.88 0.099±0.030* 50.70 0.091±0.030* 58.02
CLYXM 组 0.207±0.027 0.138±0.027* 32.86 0.117±0.026* 41.83 0.155±0.026* 28.43
CLYXL组 0.202±0.032 0.181±0.032 11.78 0.172±0.041 14.34 0.193±0.032 10.86
与模型组比较:*P<0.01
v s.model g roup:*P<0.01
表 2 CLYX对鸭血清 DHBeAg表达的抑制作用(x ±s , n=10)
Tab 2 Inhib itory ef fect of CLYX on DHBeAg in serum of duck(x ±s , n=10)
组别 T 0 T7 T 14 P3
OD OD 抑制率/% OD 抑制率/ % OD 抑制率/ %
模型组 0.137±0.029 0.143±0.028 - 0.131±0.019 - 0.138±0.024 -
ACV组 0.154±0.035 0.092±0.034** 35.62 0.081±0.035** 38.23 0.112±0.031 18.86
CLYXH组 0.151±0.025 0.101±0.024** 29.45 0.088±0.024** 33.21 0.084±0.023** 39.23
CLYXM 组 0.144±0.027 0.113±0.024* 20.76 0.103±0.024* 21.55 0.119±0.023 14.31
CLYXL组 0.137±0.023 0.119±0.024 16.48 0.018±0.026 17.59 0.133±0.027 3.68
与模型组比较:*P<0.05 , **P<0.01
v s.model g roup:*P<0.05, * *P<0.01
3 讨论
乙型肝炎是由 HBV 引起的 , 以肝脏炎性病变为主的一种
传染性疾病 。尽管已有干扰素及核苷类等各种抗病毒药物 , 但
其疗效均不理想 。乙型肝炎抗病毒药物开发和评价中的重要环
节之一就是建立一种方便有效的体内病毒感染模型 。HBV 是
比较严格的嗜肝 DNA 病毒 , 其感染的宿主范围狭窄 , 具有明
显的种属特异性 ,很难在普通实验动物中建立疾病模型 。
1980年 ,Mason 等 [5 ]观察到鸭乙肝病毒直径约为 40 nm ,
其形态与HBV 相似;病毒 DNA 呈环状或部分单链结构 ,内源性
DNA 聚合酶可将其转变为双链环状 ,其 DNA 长度约为 3 000
bp , 和 HBV 一样;病毒基因不仅在肝脏内复制 , 而且也可在肝
外脏器 ,如肾 、心 、胰 、脾等脏器中复制 ,说明鸭乙肝病毒与人乙
肝病毒属于同一病毒属 。由于麻鸭易于孵育 、饲养 ,容易在麻鸭
等品种的雏鸭中获得实验感染成功和建立 DHBV 持续感染状
态 , 从而较易建立一个与 HBV 感染相近似的体内实验系统 。
因此 , 鸭乙型肝炎病毒实验动物模型已被作为 HBV 感染的模
型用于实验研究 [6 ] 。现已成为申报抗乙肝病毒新药必做的体内
实验模型 。
目前 ,中草药抗病毒已成为国内 、外研究的热点 。本研究应
用广西 1 d龄雏鸭经腹腔感染 DHBV 的方法来建立鸭乙型肝
炎动物模型 , 进行 CLYX 抗乙肝病毒实验 。研究结果表明 ,
CLYX 能够有效抑制 DHBsAg 和 DHBeAg 的分泌 , 说明
CLYX 在体内有抗乙肝病毒作用 ,且抗病毒效果与药物剂量大
小有一定的关系 。研究结果提示 , CLYX可有效地抑制 DHB-
sAg 和 DHBeAg 的分泌 , 这可能是其治疗慢性乙型肝炎的途
径之一 。
参考文献
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中国药房 2008年第 19卷第 33期 China Pharm acy 2008 Vol.19 No.33 · 2565·
Δ江苏省科技厅高技术研究课题(BG2003315);江苏省高校自然
科学基础研究项目(07K JD360165);江苏省中医药管理局科技研究专
项基金(HZ 07044)
*讲师 , 博士。研究方向:中药及天然药物化学。电话:025-
85814035。 E-mail:hel iw ei@vip.sina.com
#通讯作者:教授 , 博士研究生导师。研究方向:中药及天然药物
化学。电话:025-51998182。E-mail:Lixiang 8182@163.com
板蓝根抗病毒有效部位筛选 Δ
何立巍 *,李 祥 # ,陈建伟 ,张军峰 ,孙东东 ,王莹莹(南京中医药大学 ,南京市 210046)
中图分类号 R284.2;R965.1 文献标识码 A 文章编号 1001-0408(2008)33-2565-02
摘 要 目的:对板蓝根药材中提取的 10个化学部位进行体外抗单纯疱疹病毒(HSV)活性研究 ,确定板蓝根抗病毒的有效部位 。
方法:利用溶剂法和色谱法从板蓝根中提取分离出 10个粗提和精制部位 , 用 M TT 法检测这 10个部位体外对 HSV -Ⅰ及
HSV -Ⅱ 型病毒的抑制作用 ,以病毒抑制率和治疗指数(TI)为评价指标 ,比较各化学部位体外抗病毒的效果 。结果:水提大孔树
脂吸附的 10%、50%醇洗部位(Ⅷ 、Ⅹ)作用最强 ,对 HSV -Ⅰ型病毒的抑制率为分别为 53.21%、56.28%,接近阳性对照药阿昔洛
韦(62.55%),其 TI 分别为 4.61 、18.62 。结论:板蓝根不同化学部位的抗病毒作用强度有较大差异 。
关键词 板蓝根;单纯疱疹病毒;抗病毒;有效部位
Screening of the Antiviral Active Parts from Isatis indigotica
HE Li-wei , LI Xiang , CHEN Jian-wei , ZHANG Jun-feng , SUN Dong -dong , WANG Ying -ying
(Nanjing Universi ty of T radit ional Chinese M edicine ,N anjing 210046 , China)
ABSTRACT OBJECT IVE:To study the activ ity of 10 chemical par ts ex t rac ted f rom I satis indigot ica against herpes simplex
virus(HSV)in v itro and to de termine the antivira l ac tive par ts.METHODS:10 crude f ractions and re fined por tions were ex-
tr acted from Isat is indigotica using solvent isolation and absorption chrom atography.Their inhibito ry ef fects against HSV -Ⅰ
and HSV -Ⅱ w ere determined by MT T using virus inhibition ratio and therapeutic index(T I)as appraisal ta rgets to compare
the antiviral ef fects among all the chemical par ts.RESULTS :The par ts(Ⅷ , Ⅹ)w ith EtOH(10%and 50% in concentration)
elution via m acroporous resin absorption show ed the most po tent ac tiv ities , w hose inhibito ry ra tes against HSV -Ⅰ w ere
53.21%and 56.28% respec tively , simila r the action o f its positive control acyclovir(62.55%), and their TI w ere 4.61 and
18.62 respectively.CONCLUS ION :There w ere significant differences in t he antiviral ac tiv ity among all the chemical par ts
ex tracted from I satis i ndigotica ,
KEY WORDS I satis ind igotica ;Herpes sim plex virus(HSV);Antivirus;Active par ts
板蓝根是十字花科植物菘蓝 Isat is indigot ica Fort .的干
燥根 ,具有清热解毒 、凉血利咽之功效 ,临床上广泛用于治疗肝
炎 、腮腺炎 、流感 、丹毒 、流脑和扁桃体炎等病毒 、细菌性疾病 。
药理研究证实 ,板蓝根提取液对流感病毒 、乙型肝炎病毒 、单纯
疱疹病毒 、柯萨奇病毒 、肾综合征出血热病毒 、巨细胞病毒等均
有显著的抑制作用 。为了明确板蓝根抗病毒的物质基础 , 指导
其活性成分的分离和纯化 , 笔者对板蓝根各化学部位的抗病毒
活性进行了系统筛选 。
1 材料
1.1 仪器与试药
Power Wave 340型酶标仪(美国 Bio-Teck公司);96孔
板(美国Corning 公司);BC-J80S型 CO 2培养箱(上海博迅实
业有限公司)。板蓝根药材(产地为江苏连云港 ,经南京中医药
大学鉴定教研室陈建伟教授鉴定为真品);阿昔洛韦(ACV , 湖
北潜江制药股份有限公司 ,批号:20040802)。
1.2 病毒与细胞株
人类单纯疱疹病毒 Ⅰ型(HSV -Ⅰ)、Ⅱ型(HSV -Ⅱ), 非
洲绿猴肾(vero)细胞(为 HSV 型病毒敏感细胞)均由南京医科
大学病毒所提供;10%新生小牛血清 (中美合资兰州民海生物
工程有限公司 , 批号:20050629);RPM I1640培养基 (美国
GIBCO 公司);100TCID 50病毒液 (病毒传代培养后由南京中
医药大学微生物与免疫教研室配制)。
[ 3] 张士军 ,黄春喜 ,黄仁彬 ,等.复方六月雪对 HepG2.2.15
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(收稿日期:2008-01-10 修回日期:2008-05-06)