全 文 ：现代医药卫生2016年5月第32卷第10期 J Mod Med Health，May 2016，Vol.32，No.10
·论 著·
目前，乙型肝炎病毒（HBV）感染呈世界性流行趋
势，据世界卫生组织报道，全球约 20 亿人曾感染 HBV，
其中 2.4 亿人为慢性 HBV 感染者 [1]。2006 年全国乙型
肝炎血清流行病学调查表明，我国 1~59 岁人群乙型肝
炎表面抗原（HBsAg） 携带率为 7.18%[2-3]。据此推算 ，
我国有慢性 HBV感染者约 9 300万人，其中慢性 CHB患
者约 2 000 万例 [4]。我国是乙型肝炎大国，因此，国家将
乙型肝炎药物的研发作为重点研究项目。溪黄草属唇形
科香茶菜属，多年生草本植物，香茶菜属植物在民间做
药用，功效之一即为能够治疗各种肝炎。到目前为止，
大多数对溪黄草的研究集中在对其化学成分的分离
与鉴定上，而抗乙型肝炎的实验研究较少，对HBV 的体
外抑制作用的实验研究更少，且大部分是采用以溪黄草
为主的复方制剂为研究对象，因此，该实验研究溪黄草
单味药体外抗 HBV 活性部位有利于深度开发溪黄草。
该研究用 HepG2.2.15 作为细胞模型，将溪黄草50%乙醇
提取物配置成一定药物浓度，进行体外抑制 HBV 试验。
1 材料与方法
1.1 材料 溪黄草（购自长沙市中药大市场），乙醇（国
产分析纯），HepG2.2.15 细胞（购自中南大学细胞培养
中心），RPMI1640 干粉，胎牛血清，G-418（Geneticin），谷
氨酰胺 ，青链霉素 （双抗 ），RPMI1640 培养液 ，噻唑
蓝 （MTT）反应液，细胞消化液（0.25%胰酶），HBV 表面
抗原诊断试剂盒 （酶联免疫法 ），乙型肝炎病毒 e 抗
原（HBeAg）诊断试剂盒（酶联免疫法），HBV核酸扩增（HBV
PCR）荧光检测试剂盒，氨水，阿昔洛韦片（0.1 g/片）；CO2
细胞培养箱，倒置显微镜，离心机（KA-1000 型），超净工
作台（YJ-875 型），生化培养箱（SP-01 型），艾科浦纯水
机 （AFX-Z-1001-P 型），恒温水浴箱（HWS-26 型），酶标
仪，荧光定量 PCR仪，培养瓶，96孔板。
1.2 方法
1.2.1 HepG2.2.15 细胞株的培养、冻存、复苏。
1.2.2 药物的配制 选取溪黄草 50%乙醇提取物，阿昔
洛韦分别用 0.1%二甲基亚砜（DMSO）溶解，配成一定浓
度；5% NaHCO3、1 mol/L HCl 调 pH 值至 6.8~7.2，0.25 μm
针头过滤器过滤后备用。
1.2.3 细胞毒性测定 HepG2.2.15 细胞用 0.25%胰蛋
白酶消化液消化成单个细胞，吹打均匀后接种于 96 孔
板，每孔细胞数 2×104个，37 ℃，5%CO2孵箱培养 24 h，
待细胞贴壁后加含不同浓度药物的培养液。溪黄草提取
溪黄草抗乙型肝炎病毒体外抑制作用研究
庞 琼 1，胡志立 2△（1.郴州市疾病预防控制中心体检科，湖南 423000；2.湘南学院胃肠外科，湖南 郴州
423000）
【摘 要】 目的 为证实溪黄草单味药具有体外抗乙型肝炎病毒活性提供重要的科学依据。方法 将溪黄草 50%
乙醇提取物配置成一定药物浓度，拟采用 HepG2.2.15 细胞模型进行细胞毒试验和乙型肝炎表面抗原（HBsAg）、乙型肝炎
e 抗原（HBeAg）酶联免疫检测。结果 半数细胞抑制时其浓度为 4.275 mg/mL，溪黄草粗提物对 HBsAg的半抑制浓度（IC50）
为 2.250 mg/mL，对 HBeAg 的 IC50为 2.150 mg/mL，治疗指数小于 2。 结论 溪黄草粗提物具有抑制体外乙型肝炎病毒的
作用。
【关键词】 溪黄草； 肝炎病毒，乙型； 细胞培养技术； 植物，药用； 细胞毒性试验，免疫
doi：10.3969/j.issn.1009-5519.2016.10.010 文献标识码： A 文章编号： 1009-5519（2016）10-1465-03
Study on in vitro inhibiting effect of Rabdosia Serra in anti-HBV Pang Qiong1，Hu Zhili2△（1. Chenzhou Municipal Center
for Disease Control and Prevention，Chenzhou，Hunan 423000，China；2. Department of Gastroenterological Surgery，Affiliated
Hospital of Xiangnan College，Chenzhou，Hunan 423000，China）
【Abstract】 Objective To provide an important scientific basis for verifying the in vitro anti-HBV activity of single herb
Rabdosia Serra.Methods 50% ethanol extract of Rabdosia Serra was dispensed as certain concentrations. The HepG2.2.15 cel-
lular model was adopted to conduct the cellular toxicity test and HBsAg and HBeAg enzyme-linked immunosorbent ssay（ELISA）.
Results IC50 was 4.275 mg/mL，IC50 of crude extract of Rabdosia Serra on HBsAg was 2.250 mg/mL，which on HBeAg was 2.150
mg/mL，the therapeutic index（TI）<2. Conclusion The crude extract of Rabdosia Serra has the effect for in vitro inhibiting HBV.
【Key words】 Isodon striatus； Hepatitis B virus； Cell culture techniques； Plants，medicinal； Cytotoxicity tests，
immunologic
作者简介：庞琼（1981-），硕士研究生，主治医师，主要从事临床及相关基础研究工作。
△通讯作者，E-mail：50381234@qq.com。
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现代医药卫生2016年5月第32卷第10期 J Mod Med Health，May 2016，Vol.32，No.10
物 3 g，用 100 mL 的 0.1%DMSO 稀释成 30 mg/mL 制成
储备液，再用 0.1%DMSO稀释成 2.5、3.5、4.0、4.5、5.0 mg/mL
5 个浓度，每孔 20 μL 加于 96 孔板，每浓度 4 孔，分别
在 3、6、9 d 换同浓度药液，设无药物细胞对照组和培养
液空白对照组及阿昔洛韦阳性对照组，作用 9 d 后显微
镜下观察细胞生长状态。吸取上清用于抗原检测，每孔
加入 100 μL 培养液，加入 10 μL 浓度为 5 mg/mL 的噻唑
蓝（MTT）；在 37 ℃，5%CO2培养箱内培养 4 h，可见紫黑
色颗粒，弃去培养液及 MTT液，每孔加入 DMSO 150 μL，
振荡后颗粒溶解，用酶联免疫检测仪测 450 nm 光密
度（OD）值 OD450。
1.2.4 对 HepG2.2.15 细胞 HBsAg、HBeAg 合成分泌的
抑制实验 用 0.1%DMSO 稀释成 0.3、0.8、1.0、2.0、
2.5 mg/mL 5 个浓度，设无药物细胞对照组和培养液空
白对照组，阿昔洛韦阳性对照组，作用 9 d后检测细胞培
养上清中 HBsAg、HBeAg 抗原含量。每孔加入待测标
本（即上清培养液 ）50 μL，再将每孔中加入酶结合
物50 μL（空白对照组除外），充分混匀后封板，置 37 ℃
孵育 8 h。手工洗板，弃去孔内液体，洗涤液储满各孔，
静置 5 s 后甩干，重复 5 次后拍干。每孔加入显色板 A、
B 液各 50 μL，充分混匀，封板，置 37 ℃ 孵育 15 min。最
后，每孔加入终止液 50 μL，混匀。用酶标仪测定，先用空
白孔校零，然后读取450 nm 处各孔 OD 值。当日不进行
测定的细胞培养上清，需放置在-20℃保存。
1.2.5 对 HepG2.2.15 细胞 HBV DNA 合成分泌的抑制
实验 对抗原检测确实有效的药物，留存细胞培养上清。
采用 HBVPCR 荧光检测试剂盒，检测细胞培养上清中
HBV DNA 含量。具体操作，取 9 d 的上清合并液加等量
DNA 提取液打匀，沸水浴 10 min（误差不超过 1 min），
转至 4 ℃静置 8~12 h 以保证病毒颗粒充分裂解 。
10 000 r/min离心 5 min，取上清保存 DNA于-20℃备用。
提取上清液中的 DNA 加入 HBV DNA PCR 荧光检测试
剂盒中的 PCR 反应管（已加入 HBV DNA 特异性引物、
一条 HBV DNA特异性荧光探针、耐热 Taq DNA聚合酶、
4 种核苷酸单体 dNTPs，PCR 反应液）。用 ABI7000 实时
定量检测。
1.3 统计学处理 应用 SPSS19.0 统计软件进行数据
分析，计量资料以 x±s 表示，采用 t检验，P<0.05 为差异
有统计学意义。
2 结 果
2.1 细胞毒实验结果 细胞抑制百分率（%）=[（细胞对
照 OD450 值-加药组 OD450 值）/（细胞对照 OD450 值-空白
OD450）]×100%。 TC50：以细胞抑制率对药物浓度用 Origin
软件拟合，若曲线形状为典型的 S 型浓度-效应曲线，可
得到抑制细胞生长 50%时所需药物浓度，即 TC50。取储
备液稀释成 2.5、3.5、4.0、4.5、5.0 mg/mL 5 个浓度 ，作
用于 HepG2.2.15，MTT 实验后，经计算得抑制率分别为
1.0%、7.2%、21.0%、56.0%、60.3%，经 Origin 软件拟合，其
半数细胞抑制时其浓度为 4.275 mg/mL， 即 TC50为 4.275
mg/mL，阳性对照组的 TC50为 0.370 mg/mL。
2.2 抗原分泌抑制实验结果 抗原抑制率（%）=[（细
胞对照 OD450-加药组 OD450 值）/（细胞对照组 OD450-空
白 OD450）]×100%。将药物浓度与抑制率输入软件，通过
量效关系来拟合曲线，从而推算出半抑制浓度（IC50），即
半数有效浓度，也是抑制抗原分泌达 50%时所需的药
物浓度。溪黄草 50%提取物有抗 HBV 活性。在无毒浓度
2.5 mg/mL 时对 HepG2.2.15 分泌 HBsAg 的抑制率为
51.8%；对 HBeAg 的抑制率为 53.4%。经 Origin 软件 S 曲
线拟合，溪黄草粗提物对 HBsAg的 IC50为 2.25 mg/mL，对
HBeAg的 IC50为 2.15 mg/mL。见表 1、2。
2.3 TI TI=TC50/IC50 当 TI<1.0 表明受试样品为无效；
1~2 为低效有毒，即弱阳性；>2~<10 为有效低毒，即阳
性；≥10 为高效低毒，即强阳性。根据细胞毒实验，及体
外乙型肝炎抗原分泌抑制实验，计算得到溪黄草 50%
提取物对 HBsAg 的治疗指数为 1.90；对 HBeAg 的治疗
指数为 1.99。因此，为有效低毒。阳性对照组 HBeAg 的
IC50为 7.750 mg/mL，TI为 0.048<2；HBsAg 的 IC50为 0.001
mg/mL，TI为 328.472>2。
2.4 对 HepG2.2.15 细胞合成 HBV DNA 作用结果 为
进一步确证溪黄草 50%提取物的抗病毒作用，采用荧
光定量 PCR 方法检测细胞培养上清中 HBV DNA 含
量。即浓度为 0 mg/mL，DNA 拷贝数为 280×103；浓度为
0.5 mg/mL，DNA 拷贝数为 190×103；浓度为 1.0 mg/mL，
DNA拷贝数为 96×103；浓度为 2.0 mg/mL，DNA拷贝数为
57×103；浓度为 2.5 mg/mL，DNA拷贝数为 22×103。
溪黄草粗提物对 HepG2.2.15 细胞分泌 HBV DNA
表 2 溪黄草 50%乙醇提取物对 HepG2.2.15 分泌 HBeAg 的抑制作用
抑制率
（%）
IC50/TI
（mg/mL）
0.00
2.21
6.86
11.00
46.69
53.91
IC50=2.15
2.596±0.000
2.539±0.446
2.418±0.227
2.310±0.439
1.383±0.116a
1.196±0.097b
OD 值
（x±s）
组别
对照组
0.3 mg/mL 组
0.8 mg/mL 组
1.0 mg/mL 组
2.0 mg/mL 组
2.5 mg/mL 组
注：与对照组比较，aP<0.05，bP<0.01。
表 1 溪黄草 50%乙醇提取物对 HepG2.2.15 分泌 HBsAg的抑制情况
对照组
0.3 mg/mL 组
0.8 mg/mL 组
1.0 mg/mL 组
2.0 mg/mL 组
2.5 mg/mL 组
0.00
6.45
15.14
20.45
46.84
51.81
IC50=2.25
2.473±0.000
2.313±0.069
2.099±0.419
1.967±0.439
1.315±0.276a
1.191±0.134b
注：TI表示治疗指数；与对照组比较，aP<0.05，bP<0.01。
组别
抑制率
（%）
IC50/TI
（mg/mL）
OD 值
（x±s）
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现代医药卫生2016年5月第32卷第10期 J Mod Med Health，May 2016，Vol.32，No.10
有抑制作用，且随浓度的增加，细胞培养上清中 HBV DNA
含量减少，呈剂量依赖关系，见图 1。溪黄草 50%提取物
对 HepG2.2.15 细胞分泌 HBsAg、HBeAg 均有抑制作
用，且呈剂量-效应依赖关系。阳性对照组仅对 HBsAg有
抑制作用。从以上抑制抗原及 HBV DNA 的实验可以看
出，溪黄草 50%乙醇提取物具有抗 HBV 的活性，因此，
可将溪黄草 50%乙醇的提取物继续进行下一步的分离。
3 讨 论
目前治疗 HBV以干扰素及核苷类似物为主，而其均
具有一定的使用局限性。比如干扰素-α（INF-α），来源于
宿主细胞对病毒发生免疫应答而产生的蛋白质，既有免
疫调节作用，又有抗病毒的作用。但由于其不良反应明
显，可加重某些免疫性疾病，而且高病毒载量者应答率
低，因此，INF-α的使用受到一定的限制[5]。
我国天然植物资源丰富，从中找到了抗 HBV 的天
然有效成分，具有极其重要的社会意义和经济意义。目
前已研制出以溪黄草为组方的保健产品，溪黄草茶已在
市场上广泛应用 [6]。临床上已将溪黄草用于治疗 HBV，
例如使用新鲜溪黄草汁（溪黄草 I.Prrd）加蜜糖口服，治
疗临床诊断的 HBV[7]，采用自拟蛇参虎溪汤治疗 HBV，
总有效率达 83.8%[8]。还有研究者做过溪黄草的复方制
剂对 HBV 的体外抑制作用，发现十味溪黄草颗粒在
HepG2.2.15 细胞培养中对 HBsAg、HBeAg 的分泌有显
著的抑制作用 [9]。由此看来，从民间药用到临床使用再
到药物实验室基础研究，都为溪黄草抗 HBV 作用提供
了初步证据。本研究将单味溪黄草药物作为研究对象，
进行抗 HBV 体外抑制研究，具有新的研究价值，为开发
中草药治疗 HBV 提供科研依据。
血清 HBsAg 定量检测可用于预测疾病进展、抗病
毒疗效和预后 [10-11]。因此，本研究选取了 HBsAg、HBeAg
进行酶联免疫检测。而 HBV DNA 定量检测主要用于判
断慢性 HBV 感染的病毒复制水平，可用于抗病毒治疗
适应证的选择及疗效的判断。因此，本实验采用灵敏度
和精确度高的 PCR法来测定 HBV DNA。
虽然本研究证实了单味溪黄草具有体外抗 HBV 的
作用，但药物进入体内后，要进行复杂的代谢，产生一些
新的有效成分，也可能有些有效成分会被灭活，或体内、
体外有效的药物浓度会存在较大差距，为进一步验证溪
黄草抗 HBV的作用，下一步还应当进行体内实验。
综上所述，溪黄草 50%乙醇提取物具有体外抗 HBV
的活性，因此，可将溪黄草 50%乙醇的提取物继续进行
下一步的分离，为筛选溪黄草体外抗 HBV 活性部位提
供素材。
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（收稿日期：2016-02-18）
图 1 溪黄草 95%提取物抑制 HBV DNA 分泌活性检测情况
H
BV
DN
A
（拷
贝
数
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（收稿日期：2016-01-05）
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