全 文 ：山东中医杂志 2014 年 8 月第 33 卷第 8 期
紫萁贯众为紫萁科植物紫萁 Osmunda japonica
Thunb．的根茎及叶柄残基。 味苦，性微寒，能清热解
毒，止血。 用于防治感冒、鼻衄头晕、痢疾、崩漏。 是
中药贯众的主流商品品种之一，收载于 1977 年和
2010 年版《中国药典》一部。 药理实验表明，它们有
抗单纯性泡疹病毒、柯萨奇病毒、埃可病毒、鼻病毒、
腺病毒、脊髓灰质炎病毒、流感病毒、副流感病毒及
脑炎球菌和痢疾杆菌等作用 ［1-2］。 近年来研究发现，
紫萁的抗菌、抗病毒药理活性与其中含有的鞣质有
关［3］，鞣质具有与蛋白质结合发生沉淀、与金属离子
络合和抗氧化的性质，能凝固微生物体内原生质作
用，抑制细菌和病毒的生长，表现出抑菌、抗病毒、
抗肿瘤和抗癌变的药理活性 ［4］。 目前国内外尚未见
其抗肠道病毒 71 型（EV71）及人乙肝病毒药理活性
的相关报道。 本研究采用体外病毒感染模型研究其
对肠道病毒 71 型（EV71）及人乙肝病毒的抑制作
用，报道如下。
1 材料与仪器
1.1 材料 紫萁贯众粉末，由济南康众医药科技开
发有限公司提供；病毒株 EV71 分离自济南市传染
病医院手足口病患者，经全序列测定证实；细胞株
MA104 本实验室保存；HepG 2.2.15 引自中国人民
解放军第 302 医院；细胞培养液：1640 细胞培养液
（GIBCO公司产品），含 10%新生牛血清及 100 μg/mL
青霉素和链霉素；DMEM 细胞培养液（GIBCO 公司
产品），含 10%新生牛血清、100 μg/mL青霉素和链霉
素和 400 μg/mL G418，过滤除菌，分装置 4 ℃备用；
细胞维持液：1640 细胞培养液（GIBCO 公司产品），
含 2%新生牛血清及 100 μg/mL 青霉素和链霉素；
DMEM 细胞培养液（GIBCO 公司产品），含 2%新生
牛血清、100 μg/mL 青霉素和链霉素和 400 μg/mL
G418，过滤除菌，分装置 4 ℃备用；pH7.2 的磷酸盐
生理盐水 （PBS）：含 NaCl 8 g、KCL 0.2 g、KH2PO4
0.2 g、Na2HPO4 2.9 g，加双蒸水至 1 000 mL，过滤除
菌，分装置 4℃备用；细胞消化液：胰酶（Diffico 公司
产品）2.5 g 用 1 000 mL PBS 溶解，过滤除菌，分装青
霉素瓶，置-20℃冰箱备用。
1.2 主要仪器 CO2恒温培养箱（日本三洋公司）；
生物安全柜（济南鑫贝西公司）；离心机（贺立氏台式
低温离心机）；-80 ℃冰箱 （Thermo 公司）；-20 ℃冰
箱（中科美菱公司）；酶标仪（Thermo公司）。
2 方法与结果
2.1 实验方法
2.1.1 细胞复苏传代 将液氮冻存的 MA104、HepG
2.2.15细胞在 37℃水浴 1 min 内迅速融化，1 000 r/m
离心 3 min，吸弃上清，悬浮于细胞培养液中，于细胞
培养瓶中 37 ℃、5%CO2静止培养，3 d 后长成单层，
用 0.25%胰酶消化，按 1∶3 传代，细胞长成单层时用
于实验。
2.1.2 病毒活化和传代 将保存的 EV71毒种 0.1 mL
接种于已经长成单层的 MA104 细胞上，37 ℃、5%
CO2 培养，镜下观察待出现细胞病变，用同样方法
将病毒传代扩增。 收获的病毒冻融 3 次、吹打离心
（10 000 r/min，20 min）、定量分装、-80 ℃冰箱冻存
备用。
2.1.3 病毒毒力测定 ①制备多孔板内单层细胞：
将细胞培养瓶内 MA104 细胞消化，以 105/mL 细胞
浓度接种 96 孔板，5%CO2、37℃孵箱中培养，待长成
单层，备用。 ②毒力测定：用维持液将病毒液做 10
倍比系列稀释，纵向重复 3 孔，横向依次接种在 96
孔板内单层细胞上，37 ℃、5%CO2培养，显微镜下观
察细胞病变和病变率，公式 1计算比距，比距与低于
50%的病变率病毒稀释度指数相加，获得 EV71 的
TCID50（Reed、Muench方法）为 10-5.25/mL。
2.1.4 药物处理 将受试药物进行如下处理：①取紫
萁贯众粉 15 g，加入 70 mL 单蒸水，混匀，置超声波
清洗仪超声 15 min，离心，10 000 r/min，15 min，弃沉
淀，上清分别进行过滤除菌和煮沸灭菌后用于实验；
紫萁贯众提取物体外抗病毒实验研究
马书太 1，李诗标 2
（1.山东中医药大学药学院，山东 济南 250355； 2.济南康众医药科技开发有限公司，山东 济南 250014）
［摘要］ 目的：探讨紫萁贯众提取物对肠道病毒 71 型（EV71）及人乙肝病毒（HBV）的体外抗病毒效果。 方法：应用体外细胞
培养及抗病毒实验观察紫萁贯众对肠道病毒 EV71及 HBV抑制作用。 结果：紫萁贯众水提物具有显著的抗 EV71 的活性，其抑毒
指数为 64，并且水提煮过的效果优于冷处理者；丙酮提取物实验细胞全部脱落，说明丙酮提取物能显著抑制 HBV 复制。 结论：紫
萁贯众水提物具有显著的抗肠道病毒 71 型效果；丙酮提取物具有良好的抗乙型肝炎病毒的作用。
［关键词］ 紫萁贯众；体外抗病毒；药效实验
［中图分类号］ R285.6 ［文献标志码］ A ［文章编号］ 0257-358X（2014）08-0663-02
［收稿日期］ 2014-01-23
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DOI:10.16295/j.cnki.0257-358x.2014.08.030
山东中医杂志 2014 年 8 月第 33 卷第 8 期
表 1 药物毒性实验（半数中毒浓度）
类别 水提过滤 水提煮沸 丙酮提取
MA104 1∶4 1∶4 1∶16
HepG2.2.15 1∶4 1∶4 1∶16
表 3 药物抗 HBV 实验结果
项目 水提过滤 水提煮沸 丙酮提取 细胞对照
表面抗原（IU/mL） 5.43 4.49 3.38 6.71
半数抑制表面抗原的药物浓度 1∶32～1∶64 1∶32～1∶64 小于 1∶256
E 抗原（S/CO） 65.665 54.650 17.224 109.961
半数抑制浓度/抗原量 （1∶64） （1∶128） 小于 1∶256
HBV-DNA（copies/mL） 3.38E+05 7.72E+05 1.18E+06 5.99E+05
表 2 药物抑制 EV71 病毒指数（TI）
类别 水提过滤 水提煮沸 丙酮提取
EV71 8 64 4
②取紫萁贯众粉 15 g，加入 70 mL 单蒸水与丙酮（V∶
V=1∶1）混合液，混匀，置超声波清洗仪超声 15 min，
离心，10 000 r/min，15 min，弃沉淀，上清置通风橱内
待丙酮挥发后过滤除菌，用于实验。
2.1.5 药物细胞毒性测定 ①制备多孔板内单层
细胞：将细胞培养瓶内 MA104 和 HepG2.2.15 细胞
消化分散，分别以 105/mL细胞浓度接种 96 孔板，5%
CO2、37℃培养，待长成单层，备用。 ②将受试药物用
细胞维持液从 1∶2 开始倍比稀释 8 个浓度，接种于
多孔板中已经长成单层的 MA104 细胞上，每个稀释
度设重复 3 孔，37 ℃、5%CO2培养，每日观察细胞病
变，连续 3 d 观察药物毒性，细胞出现病变者判为药
物毒性，结果见表 1。
2.1.6 药物体外抗病毒实验 ①制备多孔板内单层
细胞：将细胞培养瓶内 MA104、HepG2.2.15 细胞消
化分散，分别接种 96 和 24 孔板，5%CO2、37℃培养，
待长成单层，备用。 ②药物体外抗 EV71 实验：将受
试药物用细胞维持液自 1∶4 开始做倍比稀释共 8 个
浓度，分别重复 3 孔，依次加入 96 孔板内的单层
MA104 细胞上，100 μL/孔，设细胞对照、病毒对照，
除细胞对照外，各孔加 100 个 TCID50 的 EV71 病
毒（100 μL）。 37℃、5% CO2培养，每日观察病变，待
病毒对照出现 90%细胞病变后终止培养，中性红染
色，读取 A540 值，计算病变抑制率，获得药物抑毒
指数（TI）结果见表 2。 ③药物体外抗 HBV 实验：将
水提受试药物用细胞维持液自 1∶8 开始、丙酮提受
试药物自 1∶16起（半数中毒浓度）做倍比稀释共 6个
浓度，依次加入 24 孔板内的单层 HepG2.2.15 细胞
上，1 mL/孔，设细胞对照，37 ℃、5% CO2培养，每日
观察。
48 h后做显微镜观察结果如下：①细胞对照：细
胞生长良好，呈致密单层。 ②水提过滤和水提煮沸
者，细胞生长良好。 ③丙酮提取者 6 孔细胞全部肿
胀、聚集、从板壁脱落。
将各上清液做表面抗原、E 抗原和病毒 DNA 检
测，结果见表 3。
3 讨论
3.1 抗 EV71 效果观察 紫萁贯众水提物具有显
著的抗 EV71的效果，其抑毒指数为 64，该效果为粗
体药物中比较难得；另外值得关注的是，水提煮过的
效果优于冷处理者，该结果有必要进一步研究其机
制。 丙酮提取物未测得抗 EV71活性。
3.2 抗 HBV 效果观察 镜下观察发现，丙酮提取
物实验细胞全部脱落，说明丙酮提取物具有显著抑
制 HBV 复制的效果，且半数抑制浓度小于 1∶256，效
果突出。2.2.15 细胞载有 HBV 基因组，且在 G418选
择培养基下生长，丢失病毒基因的细胞不能生存，因
此，显微镜下观察到细胞死亡，是细胞丢失病毒基因
造成的，表明药物具有显著抑制病毒的效果。
3.3 水提物各组细胞生长良好，未见明显形态学改
变。 但检测上清液的病毒载量和抗原载量发现，水
提物对表面抗原和 E 抗原及 DNA 均具有一定的抑
制活性，但是活性远不及丙酮提取物。
总之，本研究将紫萁贯众作为抗肠道病毒和抗
乙肝病毒药材用于临床提供了依据，并为其抵抗不
同病毒提供了合理的提取方法，为临床用药奠定了
基础。
［参考文献］
［1］ 陶海南，刘辉，薛喜文，等. 紫萁多糖抗菌活性初步研究［J］. 南
昌大学学报：理科版，1996，20（4）：306-308.
［2］ 全国中草药汇编编写组. 全国中草药汇编（上册）［M］. 北京：人
民卫生出版社，1983：847.
［3］ 戴金凤，李磊 ，刘辉 ，等 . 紫萁的研究进展 ［J］. 中草药 ，1999，
30（9）：717-719.
［4］ 石碧，狄莹，何有节 ，等 . 鞣质的药理活性 ［J］. 中草药 ，1998，
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