全 文 ：食品与药品 Food and Drug 2015年第 17卷第1期 27
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海金沙总黄酮对鸡胚血管生成的影响的研究
熊艳梅1，亓翠玲2，李 勇2，袁俏冰2，任 军1*
（1. 广州中医药大学，广东 广州 510405；2. 广东药学院，广东 广州 510405）
摘 要：目的 研究海金沙总黄酮（Flavones from Lygodium japonicum, FLJ）对血管新生的影响。方法 应用鸡胚绒毛尿囊
膜（chick chorioallantoic membrane, CAM）模型，于鸡胚孵育的第8天，使用微量移液器对CAM加以FLJ及空白对照溶液
处理，继续孵育48 h，收集数据进行评估；鸡胚卵黄囊膜（yolk sac membrane, YSM）血管生成模型，于鸡胚孵育2 d后，
将药物加于鸡胚卵黄囊膜上，分别于加药0，12 h在体视显微镜下拍照，收集数据进行评估。结果 与空白对照组相比，
CAM模型高、中剂量药物组加药口处血管生成明显减少，YSM模型高、中剂量药物组新生血管密度增长率及数目均明显
减少。结论 海金沙总黄酮对血管生成有一定抑制作用，并呈现剂量依赖性。
关键词：海金沙总黄酮；血管生成；鸡胚绒毛尿囊膜；鸡胚卵黄囊膜
中图分类号：R285.5 文献标志码：A 文章编号：1672-979X（2015）01-0027-04
Impact of Flavonoids from Lygodium japonicum (Thunb.) Sw. on Angiogenesis in Chick
Embryo Chorioallantoic Membrane
XIONG Yan-mei1, QI Cui-ling2, LI Yong2, YUAN Qiao-bing2, REN Jun1
（1. Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510405, China; 2. Guangdong Pharmaceutical
University, Guangzhou 510405, China）
Abstract: Objective To study the inhibitory effect of fl avonoids from Lygodium japonicum (Thunb.) Sw. (FLJ) on
angiogenesis. Methods On the eighth day of incubation, the model of chicken chorioallantoic membrane (CAM) was
treated with FLJ and blank reference solution. After incubating for about 48 hours, the data were collected for the
evaluation. After two days of incubation, the model of yolk sac membrane (YSM) was treated with FLJ and the blank
reference solution. The data were collected for the evaluation by taking photos with stereoscopic microscope at 0 h
and 12 h after medicating. Results In CAM model, compared with control group, neovessels of the groups treated
with high and medium dosage of FLJ markedly decreased, and the growth rate of density and number of neovessels of
the groups treated with high and medium dosage of FLJ in YSM model signifi cantly decreased. Conclusion FLJ can
obviously inhibit the angiogenesis in a dose-dependent manner.
Key Words: fl avonoids from Lygodium japonicum (Thunb.) Sw.; angiogenesis; chicken chorioallantoic membrane;
yolk sac membrane
收稿日期：2014-11-10
作者简介：熊艳梅（1989-），女，硕士研究生，研究方向：肿瘤学 E-mail：630989478@qq.com
*通讯作者：任军（1965-），男，主任医师，研究方向：肿瘤学 E-mail：jun5512@sina.com
海金沙（Lygodium japonicum ）系海金沙科
（Lygodiaceae）多年生蕨类植物，全草或成熟孢子
入药，味甘淡，性寒，具有清热解毒、活血通络、
利水通淋、利湿消肿等功效，临床主要用于泌尿系
统感染、尿路结石、流行性腮腺炎、肠炎、皮肤湿
疹和带状疱疹及呼吸系统感染等病症[1-2]。据文献报
28 食品与药品 Food and Drug 2015年第 17卷第1期
道[3-6]，海金沙有利胆、防治尿结石、降血糖、抗氧
化等功效。海金沙全草富含黄酮类化合物，主要有
山奈酚、蒙花苷 [7-9]等。黄酮类化合物的抗癌活性
研究已成为肿瘤防治研究中的一个热点，大豆异黄
酮、黄芩黄酮、槲皮素、淫羊藿苷、水飞蓟素、芹
菜素、木犀草素等都具有明显的抗肿瘤作用[10]。但
目前关于海金沙黄酮是否也具有抗肿瘤作用尚未见
报道。为此，本实验通过鸡胚绒毛尿囊膜（chick
chorioallantoic membrane, CAM）、鸡胚卵黄囊膜
（yolk sac membrane, YSM）模型观察海金沙总黄酮
在活体中抑制血管生成的能力，为深入开发海金沙总
黄酮提供试验依据。
1 材料与仪器
1.1 试剂与药品
海金沙草采自广州大学城（经广东药学院刘
基柱教授鉴定为海金沙科海金沙属海金沙Lygodium
japonicum ）。受精种蛋购于华南农业大学种鸡场；
二甲基亚砜（DMSO，广州化学试剂厂）；聚酰胺
（青岛海洋化学试剂公司）。
1.2 实验仪器
体式显微镜SZX16（日本OLYMPUS公司）；
恒温恒湿孵化箱BSC-250（上海博讯公司医疗设备
厂）；超净工作台SW-CJ-2D（苏州净化集团）；数
码相机CDW-C007-01B（日本Canon公司）。
2 方法与结果
2.1 海金沙总黄酮制备
取海金沙干燥全草，剪碎，准确称取30 g，加70 %
乙醇540 mL，提取2次，每次1.5 h，合并提取液，
减压回收乙醇至无醇味，以水定容至250 mL量瓶，
转移至500 mL圆底烧瓶，加活性炭（80~100目）0.6
g，煮沸20 min，滤过，滤液浓缩并定容至25 mL，精
密吸取5 mL，通过已处理好的聚酰胺柱（30 cm×2
cm），用水洗脱至洗脱液近无色，弃去，继以70 %
乙醇500 mL洗脱，收集醇洗脱液，至无色。挥去
乙醇，减压浓缩、干燥，即得海金沙草总黄酮。加
DMSO 1.5 mL，超声处理使溶解，定容至2 mL（浓
度为3 g生药/mL），作为样品溶液。分别取样品溶液
3.2，1.6，0.8 μL溶于1 mL生理盐水，置入1 mL离心
管，即得浓度为9.6，4.8，2.4 mg生药/mL药物溶液，
用微孔滤膜（0.22 μm）除菌，4 ℃保存备用。
2.2 CAM模型的建立
2.2.1 鸡胚孵育 参考文献[11]方法并改进，选择0 d
白皮种蛋，质量相近（60±5）g，消毒后，温度
37.5℃、湿度60 %条件下孵育，每天照蛋转蛋，去死
胚，至第8天，在照卵灯下观测，选择发育良好的鸡
胚并标记气室。
2.2.2 分组情况 随机将发育良好的40枚鸡胚平均分为
4组作为对照组及实验组。
2.2.3 给药 将种蛋移入超净台，用75 %酒精消毒气室
表面后，以慢速牙科钻于气室中心磨切一个约1 mm2
小孔，用酒精棉小心擦去蛋壳粉末，避免蛋壳粉末掉
进胚体与尿囊膜粘连影响血管发育，以眼科镊于暴露
的气室蛋膜中心部位破开一个小洞，勿损坏下面的鸡
胚绒毛尿囊膜，以移液枪透过小洞分别于鸡胚绒毛尿
囊膜上加入药液及空白对照的生理盐水溶液50 μL，
用医用胶布封闭卵壳口，平移鸡胚置入孵育箱继续保
温。孵育48 h后，沿蛋壳长轴剪开鸡胚，小心去掉内
容物，操作过程中保证加药端鸡胚绒毛尿囊膜贴壁，
以加药口为中心拍照取材、分别统计两组血管受抑制
的百分比并描述血管长势。
2.2.4 观察指标的确立 鸡胚剪开后立即观察以加药点
为中心的血管生长情况，观察有无血管向心生长情
况。若无向心生长情况，并出现血管网稀疏，苍白，
血管长势不自然，加药口及附近三、四级血管数量显
著减少，或出现较明显的无血管区域，说明可能存在
抑制血管生长作用。
2.2.5 结论及分析 在CAM实验中，空白对照组血管
网内血管均匀分布，呈现明显树枝状，开窗口处具有
丰富的三四级血管（但个别假阳性个体也可见加药口
处三四级血管抑制情况）。高、中浓度药物组血管网
内血管分布不均，加药口处血管扭曲破坏，三四级血
管生长受到抑制，新生血管不明显；低剂量组抑制情
况不明显；空白对照组只有10 %血管抑制现象。加
药组按不同（高、中、低）浓度，抑制率分别为70 %，
55 %，30 %，出现不同程度的血管抑制现象（见
图1）。
图1 不同浓度FLJ对CAM血管生长的影响
食品与药品 Food and Drug 2015年第 17卷第1期 29
图2 加药12 h后YSM新生血管情况
2.3 YSM模型的建立
2.3.1 鸡胚孵育 取孵化0 d的鸡胚种蛋，预处理方法
同CAM模型，孵化3 d后，移至超净台，去掉蛋壳，
将整个鸡胚组织置入已高压蒸汽消毒灭菌后的平皿，
剔除血管网偏离正面的样本，盖好平皿盖，继续孵育
约1 h，使暴露的鸡胚组织适应体外环境，剔除未能
良好适应环境个体。
2.3.2 分组 将发育良好的离体鸡胚40枚随机分为4
组，分别以消毒后的镊子用红色（作为加药组）和黑
色（作为空白对照组）记号笔标记的硅胶圈于YSM
血管网上血管长势、分布类似的位置，且保证覆盖约
1/3的血管网面积。
2.3.3 加药 以移液枪向药物组及空白对照组硅胶圈中
分别加入30 μL待测药物及空白对照溶液。
2.3.4 统计分析 在体视显微镜下使用OPTPRO 2007
数码显微成像分析系统采集药物处理后0，12 h胶圈
覆盖部位，保存图片。应用图像处理软件Image-Pro
Plus6.0读入拍摄的鸡胚照片，采集药物组和空白对
照组硅胶圈内的血管面积，计算两组加药12 h后胶圈
内血管面积增长率[增长率=（加药12 h后胶圈内血管
面积-加药0 h后胶圈内血管面积） / 加药0 h后胶圈内
血管面积]。以虚线沿水平方向将各胶圈均分为二，
应用图像处理软件Image-Pro Plus6.0读入拍摄的鸡胚
照片，统计通过虚线的新生血管（内径＞50 μm）数
目。所有数据采用GraphPad Prism 5.0统计软件处理，
对各药物组与空白对照组进行t检验，P＜0.05 提示差
异有统计学意义。
2.3.5 结论及分析 FLJ作用12 h后，与空白对照组相
比，FLJ高、中剂量组血管发育均受到抑制，胶圈内
血管网往前推进的面积及血管网密度及新生血管数
目（内径＞50 μm）均不及空白对照组。经GraphPad
Prism 5.0统计软件统计表明，与空白对照组比较分
析，高、中剂量药物组有一定抑制鸡胚新生血管作
用，低剂量组无显著差异（见图2~4）。
图3 加药12 h后血管面积增长率
*P＜0.05，**P＜0.01
图4 加药12 h后血管数目比较
3 讨论
医学上涉及到血管生成的疾病包括：糖尿病性视
网膜病变、银屑病、风湿性关节炎、心血管疾病等，
特别是肿瘤。肿瘤的生长和转移依赖于肿瘤血管的生
成[12-13]，经典的肿瘤血管生成理论提出，当肿瘤体积
生长超过1~2 mm3，必须借助新生血管提供的养分保
证其继续生长[14]。研究发现，肿瘤微循环血管密度远
超过身体正常组织[15]，临床上高度血管生成的肿瘤患
者一般预后较差[16]。肿瘤细胞激活的相关内皮细胞遗
传稳定，较易逆转，突变率低，很少出现肿瘤治疗中
的耐药现象，细胞表面存在特异的标记物，治疗靶点
明确[17]。开发以肿瘤血管为靶点的血管生成抑制剂成
为目前抗肿瘤药物研究的热点。
由于CAM模型操作方法简单方便、受其他干扰
因素情况影响较少、实验结果指标清晰，而作为最常
用的血管生成评价在体模型。传统模型一般均需暴露
CAM血管网进行加药膜或直接加药物处理，但考虑
到暴露操作也是影响血管生长的干扰因素，本实验在
传统的CAM模型操作方法上做了一些改进，在开窗
加药处理时以眼科镊在气室中心处破开一个小洞，使
药物顺着小洞作用于CAM膜，使外界刺激降至最低。
海金沙作为凉茶的主要成分，在我国南方运用广
泛，无毒副作用，价廉，资源十分丰富，若能充分开
30 食品与药品 Food and Drug 2015年第 17卷第1期
收稿日期：2014-07-10
基金项目：山东省科技攻关课题（No. 2010G0020209）
作者简介：刘瑾（1973-），女，副研究员，研究方向：中药药理毒理及新药研究 E-mail：jinanlj56@163.com
*通讯作者：程丽芳（1956-），女，研究员，研究方向：中药药理及新药研究 E-mail：chenglifang517@163.com
发利用将有广阔的应用前景。本实验使用血管生成
经典模型CAM首次筛选出FLJ具有一定抗血管新生作
用，为海金沙及海金沙总黄酮的进一步开发应用提供
了基础。
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菊葛天麻颗粒镇痛作用及对血瘀动物模型的影响
刘 瑾1，程丽芳1*，王爱洁1，李桂耘1，于蓓蓓1，崔兵兵2，王 烁2，隋在云1，李晓晶1，李克明1
（1. 山东省中医药研究院，山东 济南 250014；2. 山东中医药大学，山东 济南 250355）
摘 要： 目的 探讨菊葛天麻颗粒（JGTM）的镇痛作用及对血瘀动物模型的影响。方法 采用扭体法、热板法观察JGTM对
小鼠的镇痛作用；采用大鼠体内血栓形成试验，肾上腺素致小鼠耳廓微循环障碍试验，观察JGTM的活血化瘀作用。结果
JGTM可明显延长小鼠疼痛潜伏期，减轻H+所致小鼠疼痛扭体反应，明显提高热板法所致小鼠的痛阈值；具有延长大鼠体
内血栓形成时间，拮抗肾上腺素所致血瘀小鼠耳廓微循环障碍的作用。结论 JGTM具有镇痛作用及活血化瘀的作用。
关键词：菊葛天麻颗粒；紧张型头痛；镇痛；活血化瘀；微循环障碍
中图分类号：R285.5 文献标识码： A 文章编号：1672-979X（2015）01-0030-04
Analgesic Action and Effect on Blood Stasis Animal Model of Juge Tianma Granules
LIU Jin1, CHENG Li-fang1, WANG Ai-jie1, LI Gui-yun1, YU Bei-bei1, CUI Bing-bing2, WANG Shuo2, SUI Zai-yun1,
LI Xiao-jing1, LI Ke-ming1
(1. Shandong Academy of Chinese Medicine, Jinan 250014, China; 2. Shandong University of Traditional Chinese
Medicine, Jinan 250355, China)
Abstract: Objective To observe the analgesic action and the effect on blood stasis animal model of Juge Tianma
Granules. Methods Analgesic role of Juge Tianma Granules were investigated by pain model in mice induced by
acetic acid or hot plate. The thrombus formation experiment of rats and the auricle microcirculation disturbance of