全 文 ：第 33 卷 第 4 期
2012 年 8 月
首都师范大学学报(自然科学版)
Journal of Capital Normal University
(Natural Science Edition)
No． 4
Aug．，2012
睡菜外植体愈伤组织诱导与培养初步研究*
吴昌宇1 华振玲2 李学东2＊＊
(1. 北京市第八十中学，北京 100102;2. 首都师范大学生命科学学院，北京 100048)
摘 要
利用睡菜带芽的嫩茎段作为外植体，切成 0. 5 cm 长的片段，通过 MS 培养基和激素配比实验，筛选出了睡菜茎
段愈伤组织诱导的最佳培养基配方 ．实验结果表明:适宜的消毒时间 75%酒精 30 s，升汞 9 min;适宜的初代培养基
为 MS + BA 1. 0 mg·L － 1 + NAA 0. 10 mg·L － 1;适宜的继代培养基为 MS + BA 0. 5 mg·L － 1 + NAA 0. 05 mg·L － 1;在培
养基中添加 1. 5 g /L 的多菌灵粉剂可以有效抑制真菌生长，诱导出愈伤组织后应在 30 d 内及时进行继代培养 ．
关键词:睡菜，组织培养，愈伤组织 ．
中图分类号:Q949. 72
收稿日期:2010-12-16
* 北京市科委重大科技计划项目(D08040600580803)资助
＊＊通讯作者
1 引 言
睡菜 (Menyanthes trifoliata L．) ，又名螟菜、醉
草，为龙胆科(或睡菜科)睡菜属多年生沼生草本植
物，根状茎匍匐状粗大，初为绿色，老熟后转为褐色，
三出复叶，叶卵圆形，挺出水面，总状花序，多花，花
白色，花冠上部内面具白色流苏状毛(见图 1，2) ，蒴
果球形，种子膨胀，圆形，花果期 5 ～ 7 月［1］． 主要分
布于北温带地区，2007 年在北京延庆县湿地资源普
查时被发现，已确定为北京的新记录种［2］．
睡菜生长迅速，适应力强，叶形优美，叶色翠绿，
初夏开花，花团锦簇，素雅别致，是很有开发利用前
景的湿地观花植物 ．睡菜还具有较好的药用价值，根
茎和叶入药，味甘微苦，性温，无毒，主治心膈邪热，
入睡困难 ．除中医外，瑞典民间也用来治疗肾炎，近
年分析睡菜粗提物中含有羽扇豆醇型三菇，其对体
外前列腺素合成具明显的抑制作用［3］．
我国目前对睡菜的繁殖现主要采取播种、扦插、
分株为主，但因其生于水中，种子采集困难，扦插和
分株繁殖速度慢，难以满足对睡菜种苗日渐增长的
需要 ．目前睡菜的组织培养国内外均未见报道，仅对
同科植物荇菜［Nymphoides peltatum (Gmel．)O．
Kuntze］［4］、印度荇菜(N． indicum Kuntze)［5］和水皮
图 1 睡菜开花植株
莲(N． cristatum (Roxb．)O． Kuntze)［6］有相关的研
究和报道，本实验对睡菜的组织培养技术进行了研
究，以期获取愈伤组织，进而解决睡菜的人工繁殖
问题 ．
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首都师范大学学报(自然科学版) 2012 年
图 2 睡菜花序特写
2 材料与方法
2. 1 实验材料
实验于 2008 年 3 月 18 日 ～ 12 月 24 日于首都
师范大学植物组培室进行，选用采集自北京延庆县
野鸭湖自然保护区，长势旺盛的睡菜植株作为实验
材料，取植株上分化程度较低的睡菜嫩茎段(直径
1 cm)10 cm 为外植体 ．
2. 2 睡菜茎形态观察
将睡菜茎段做徒手切片，制成临时装片，经 4%
HCl － 间苯三酚染色后显微镜下观察其内部结构，
并使用 Motic 数码显微镜拍照 ．
2. 3 睡菜的组织培养
2. 3. 1 培养基配置
本实验选用的基本培养基为 MS 培养基，琼脂
含量 0. 8%，蔗糖浓度 3%，加入 1. 5 g /L 的多菌灵可
湿性粉剂或不加，作为对照，pH 值 5. 6 ～ 5. 8，在
121 ℃、0. 15 MPa 条件下灭菌 20 min．
2. 3. 2 方法与条件
实验设计了 8 组不同的培养基分别对外植体进
行培养(表 1)．外植体消毒时，取采自温室生长的睡
菜茎段 10 cm 为外植体，用自来水冲洗 1 ～ 2 h，去除
叶和根，2 g /L 多菌灵悬浊液浸泡 24 h，然后在超净
工作台中用 75%酒精浸泡 30 s，放入 1 g /L HgCl2 中
消毒 9 min，然后用无菌水冲洗 5 次，浸泡 5 min，将
消毒好的材料切成 0. 5 cm 厚的薄片，共切 40 片，每
片切成四小块，用镊子接种于已灭菌的 40 个 150 mL
的三角瓶的培养基中，每瓶接四小块，考虑到外植体
为匍匐生长的地下茎，不确定光照对其影响，所以分
别光照和黑暗条件培养 ．
表 1 光照和激素浓度对睡菜愈伤组织诱导的影响
处理
条件
编号 培养基
组织
块数
愈伤
个数
染菌数
光照
1L MS 24 0 9
2L
MS + BA 0. 3mg /L +
NAA 0. 03mg /L
24 6 9
3L
MS + BA 0. 5mg /L +
NAA 0. 05mg /L
24 10 17
4L
MS + BA 1. 0mg /L +
NAA 0. 10mg /L
24 19 11
5L
MS + BA 1. 5mg /L +
NAA 0. 15mg /L
24 12 13
黑暗
1D MS 24 0 8
2D
MS + BA 0. 3mg /L +
NAA 0. 03mg /L
24 2 13
3D
MS + BA 0. 5mg /L +
NAA 0. 05mg /L
24 2 12
4D
MS + BA 1. 0mg /L +
NAA 0. 10mg /L
24 3 10
5D
MS + BA 1. 5mg /L +
NAA 0. 15mg /L
24 1 19
光照培养条件为:T = 20 ℃ ± 2;L = 1 000 ～
2 000 Lx;t = 12 h /d;50% ＜ RH ＜ 70%，
黑暗培养条件为:T = 20 ℃ ± 2;L = 0;t = 12 h /d;
50% ＜ RH ＜ 70%，
定期观察，记录组织生长情况 ．
3 观察结果与分析
3. 1 睡菜茎的结构观察
睡菜的茎在水底泥中或浅水中匍匐生长，睡菜
横切面结构(见图 3、图 4) ，从外向内可分为表皮、
薄壁组织、维管柱三部分，表皮细胞排列紧密，体积
小 ．薄壁组织位于表皮内侧，细胞数量多，位于表皮
下方的数层薄壁细胞排列较紧密，叶绿体丰富，使茎
外观呈绿色 ．其内的薄壁组织中含有发达的气腔，靠
近维管柱的组织中气腔变小，薄壁组织当中有少量
散生木质化结构，推测为叶迹 ． 维管柱中有 20 余个
维管束，为外韧型，维管柱中心也是薄壁组织，与维
管柱外侧的薄壁组织结构相同 ．
3. 2 睡菜愈伤组织的诱导
外植体培养 10 d 之后，可观察到茎段截面维管
束处出现少量浅绿色愈伤组织 ． 15 d 后，维管束环内
外侧薄壁组织气腔壁上也生长出圆球形愈伤组织细
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第 4 期 吴昌宇等:睡菜外植体愈伤组织诱导与培养初步研究
图 3 睡菜茎的横切 × 2
图 4 睡菜的维管束 × 10
胞(见图 5，图 6) ，25 d 后，愈伤组织大量生长，逐渐
撑破茎段表皮，此时统计愈伤组织形成数量，列入表
1. 40 d 后愈伤组织完全覆盖茎段表面，如未及时继
代，愈伤组织形成 70 d 后会停止生长，表层细胞也
会从浅绿色转化为深绿色，同时部分细胞开始褐化，
逐渐向周围扩散 ．所以，睡菜愈伤组织诱导成功后当
在 30 d 内及时进行继代培养 ．
图 5 显微镜下睡菜的愈伤组织 × 10
图 6 实体显微镜下睡菜的愈伤组织 × 4
表 1 及图 7 结果显示，以睡菜茎段作为外植体
诱导愈伤组织时，染菌率高达 47. 1% ． 污染菌物主
要为真菌，生长于组织块边缘，可确定为植物体内生
菌经过消毒没有完全杀灭，为避免真菌对实验结果
造成影响，采取多菌灵处理的方法来抑制真菌，在接
种前先用 1 g /L 的多菌灵悬浊液浸泡 24 h，在培养
基中加入 1. 5 g /L 的多菌灵粉剂，有明显抑菌效果，
7 d 后污染率由 75%降至 20%，但随着培养时间的
延长，30 d 后污染率又上升至 45%，推测原因可能
是在培养过程中组织块周围的多菌灵被吸收所致 ．
图 7 光照和黑暗对睡菜愈伤组织诱导的影响
排除掉染菌茎段，光照处理下的睡菜茎段，愈伤
组织诱导率为 77. 0%，黑暗处理中愈伤组织诱导率
为 13. 8%，以上结果说明，睡菜与其他植物不同，光
照处理更适合其生成愈伤组织，在接下来的实验中
光照条件为 2 000 Lx．但是在光照条件下，睡菜茎不
同位置的愈伤组织生长情况有差别，取自节间位置
的茎段愈伤组织生长迅速、数量多，而取自茎节位置
的茎段容易生长出侧根和芽，愈伤组织生长缓慢，故
适宜的取材位置应该是茎的节间 ．
从表 1 结果还可看到，激素浓度对睡菜愈伤组
织诱导有较大影响 ．当培养基中无激素时，愈伤组织
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首都师范大学学报(自然科学版) 2012 年
不能形成 ．当激素浓度在 BA 0. 5 ～ 1. 5 mg /L + NAA
0. 05 ～ 0. 15 mg /L 时，愈伤组织生长情况较好 ． 其中
在 BA 0. 5 mg /L + NAA 0. 05 mg /L 的激素浓度下，
愈伤组织生长最好，愈伤组织生长率为 63% ． 因此，
适宜的外植体诱导培养基为 MS + BA 0. 5 mg /L +
NAA 0. 05 mg /L．
3. 3 愈伤组织的继代培养
在外植体诱导出愈伤组织后，需要及时进行继
代培养，以避免培养过程中微生物通过封口膜污染
和培养基营养消耗引起的愈伤组织老化死亡 ． 在继
代培养中，仍然选择不同浓度的 BA 和 NAA 作为激
素 ． 10 d 后观察并记录愈伤组织的生长情况，记录
于表 2
表 2 不同浓度的 BA /NAA 对睡菜
愈伤组织继代培养的影响
编号 培养基
组织
块数
愈伤增
殖个数
愈伤
增殖率
1 MS + BA 0. 2mg /L + NAA 0. 02mg /L 18 6 33. 3%
2 MS + BA 0. 5mg /L + NAA 0. 05mg /L 18 11 61. 1%
3 MS + BA 1. 0mg /L + NAA 0. 10mg /L 18 9 50%
4 MS + BA 1. 5mg /L + NAA 0. 15mg /L 18 10 55. 6%
从表 2 中可以看到，睡菜愈伤组织在激素浓度
范围为 MS + BA 0. 5 ～ 1. 5 mg /L + NAA 0. 05 ～
0. 15 mg /L的培养基当中均可进行增殖 ． 其中在 MS
+ BA 0. 5 mg /L + NAA 0. 05 mg /L 培养基中愈伤组
织生长最好(见图 8，图 9) ，愈伤组织生长率为
61. 1%，已经污染的材料，在继代时，将染菌的愈伤
组织先后经过 1 g /L 多菌灵悬浊液浸泡 15 min、
75%乙醇 30 s、1 g /L HgCl2 溶液浸泡消毒，消毒后的
愈伤组织在 7 ～ 10 d 后可生长出新的愈伤组织，(见
表 3)．表 3 结果显示，已经污染的愈伤组织消毒后
再培养的成活率比外植体培养要低，其原因推测为
消毒过程中 HgCl2 对愈伤组织造成损害，所以在外
植体培养时应该注意消毒的方式和时间，尽量控制
真菌污染，以免在继代培养中造成损失 ．
表 3 污染睡菜愈伤组织
消毒后继代培养结果
编号 培养基
组织
块数
愈伤增
殖个数
愈伤增
殖率
1 MS + BA 0. 5mg /L + NAA 0. 05mg /L 20 4 20%
2 MS + BA 1. 0mg /L + NAA 0. 10mg /L 20 6 30%
3 MS + BA 1. 5mg /L + NAA 0. 15mg /L 20 5 25%
图 8 继代培养后的愈伤组织
图 9 继代培养后的愈伤组织
4 结 论
本实验以睡菜茎段为外植体对睡菜进行组织培
养研究，结果表明:睡菜最适宜的外植体为节间位置，
诱导愈伤组织的最适培养基为 MS + BA 0. 5 mg /L +
NAA 0. 05 mg /L，培养条件为 T = 20 ℃ ± 2;L =
1 000 ～ 2 000 Lx;t = 12 h /d;50% ＜ RH ＜ 70% ． 外植
体诱导愈伤组织时容易被污染，污染物多为真菌，在
外植体处理时先用 2 g /L 多菌灵悬浊液浸泡 24 h，
在培养基中也加入 1. 5 g /L 的多菌灵可湿性粉剂可
有效控制真菌的污染 ．为避免愈伤组织死亡和污染，
愈伤组织形成后应该在 30 d 内及时进行继代培养，
继代培养最适的培养基为 MS + BA 0. 5 mg /L +
NAA 0. 05 mg /L，培养条件同外植体诱导愈伤组织，
继代培养时可以将已染菌的组织消毒后重新培养，
但成活率比不经过消毒的未染菌组织有所下降 ．
5 讨 论
由于睡菜为水生植物，植物体内通气组织发达，
且其处于水环境中，其容易携带大量的微生物及藻
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第 4 期 吴昌宇等:睡菜外植体愈伤组织诱导与培养初步研究
类等植物，所以外植体的灭菌消毒工作尤为重要，如
果消毒不彻底，染菌率非常高，污染物主要是真菌和
少量细菌以及少量藻类 ． 但是也因为其通气组织发
达，在灭菌的时候，消毒用的药品也很容易残留于组
织当中，对植物细胞的存活和组织的生长容易造成
影响 ．因此消毒剂用量的大小、种类以及消毒的时间
对组织培养的成败非常重要 ．
与扦插繁殖相比，离体组织培养具有增殖系数
高，生产方便快捷等优点，利用组培快繁途径，可以
建立睡菜组织培养无性系，有利于睡菜这一优良水
生观赏植物更大范围的推广和普及 ．此外，也可进一
步用于分子系统学的研究 ． 本实验研究只是初步探
索了睡菜组织培养的激素浓度，从取材方面来讲，重
复实验的时间是冬季，睡菜嫩茎段比春季时其细胞
内含水量有所下降，表现为茎不如春季时坚实，有萎
蔫感．如果在春季取材，可能会产生更好的实验效果．
参 考 文 献
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［2］ 张雨曲，胡东，杜鹏志 ． 北京地区湿地植物新记录［J］． 首都师范大学学报，2008，29(3) :56 － 59．
［3］ 黄驰 ． 睡菜中的抗炎成分［J］．药学学报，1995，30(8) :621 － 626．
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［J］． Plant Cell，Tissue and Organ Culture，2001，63:1 － 8．
［6］ Niranjan M H，Sudarshana M S． In vitro plant regeneration in Nymphoides cristatum (Roxb．)O． Kuntze［J］．
Phytomorphology，2000，50(3 － 4) :343 － 344．
A Preliminary Study of Tissue Cultrue and Rapid
Propagation on Menyanthes trifoliata L．
Wu Changyu1 Hua Zhenling2 Li Xuedong2
(1. Beijing No. 80 Middle School，Beijing 100102;2. College of Life Science，Capital Normal University，Beijing 100048)
Abstract
The study takes fresh stem with bud from Menyanthes trifoliata as explants，then cut it into fragments about
0. 5cm long． Through a series of optimization expriment for cultural medium composition of phytohormones，the best
culture medium formula for callus induction of this plant’s stem fragments was selected． The results indicated that
the young stem segment with buds was the best explant;the suitable sterilization time with 75% alcohol was 30s
and with 1 g·L － 1 HgCl2 9 min． MS + BA 1. 0 mg·L
－ 1 + NAA 0. 10 mg·L － 1 was the proper medium for primary
culture，and MS + BA 0. 5 mg·L － 1 + NAA 0. 05mg·L － 1 was the proper medium for subculture． Adding 1. 5 g /L of
carbendazim powder to the medium containing could inhibit the growth of fungi effectively． The callus should be
timely subcultured in 30 days after callus has been inducted．
Key words:Menyanthes trifoliata，tissue culture，callus．
作者简介 吴昌宇(1984 －) ，男，北京第八十中学生物教师，首都师范大学生命科学学院 2006 级研究生，研究方向为植物多
样性与保护 ． E-mail:the18thangel@ 163． com．
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