全 文 ：科技园地　Academic Field
6　 PRACTICAL FORES TRY TECHNOLOGY
二★一一年第四期　林业实用技术
长白柳组织培养繁殖技术初步研究＊
顾地周
(通化师范学院生物系　吉林　通化　134002)
[ 摘要] 　以长白柳嫩茎为外植体 ,研究不同浓度的激素对长白
柳嫩茎基部直接再生芽苗和芽苗生根的影响。 应用均匀设计
法筛选其植株再生各阶段最适合的培养基 , 结果表明 , 最适合
嫩茎基部直接再生芽苗的培养基:N-68+2ip3.56 mg/ L +
NAA 0.03 mg/ L , 诱导率为 93.5%;生根培养基为:1/ 4MS(大
量元素)+IBA 0.04 mg/ L , 生根率达 99%以上。 成功诱导出
长白柳嫩茎再生植株。
[ 关键词] 　长白柳　组织培养　植株再生　均匀设计
长白柳[ Sal ix polyadenia var.tschangbaischan-
ica(Y.L.Chou e t Chang)Y.L.Chou] 又称侏儒柳 ,
是杨柳科柳属的落叶匍匐小灌木 ,国家三级重点保护
植物 。《中国珍稀濒危保护植物名录》中定为渐危种[ 1] 。
《吉林省野生动植物保护管理暂行条例》中定其为省级
一类重点保护植物 。长白柳是多腺柳的一个变种 ,为长
白山特有种。长白柳具有喜光 ,耐寒 ,喜温 ,耐贫瘠 ,抗
风等特性 ,可防止高山苔原带的水土流失 ,对维护生态
平衡 ,美化天池环境以及引种驯化 、开发利用于绿化和
盆景有重要经济意义。研究该科植物的系统发育与地
理分布有重要的科学价值。长白柳仅分布于我国长白
山海拔2 000 ～ 2 500 m 的高山苔原带 。由于长白柳的
天然更新能力非常弱 ,又因其种子小 、寿命短 ,成熟后必
须马上播种 ,可操作性极差 ,插条繁殖生根率和移栽成
活率也极低 ,使其开发及利用受到极大限制 。因此 ,本
研究以长白柳新生嫩茎为外植体 ,采用均匀设计法 ,以
期筛选出长白柳嫩茎离体培养各阶段的培养基。目前 ,
与其同科的其它种植物的离体培养已有报道[ 2] ,但是关
于长白柳嫩茎诱导再生植株的研究 ,国内外迄今未见。
1　材料与方法
1.1　外植体材料的处理
2007年7月于吉林省长白山海拔 2 300 m的天池
附近采长白柳新生鲜嫩枝条 ,将嫩枝条切割成 2 ～ 3叶
一段 ,在超净工作台上用 75%酒精涮洗 10 s ,用质量浓
度 3%青霉素的次氯酸钠溶液(0.1%)浸泡 6 min ,无菌
水冲洗 8 次 ,无菌滤纸吸干表面水分 ,切除灭菌剂损
伤的部分并切割成一叶一段后作为外植体备用[ 3-4] 。
＊吉林省科技厅资助项目(200705C05)
作者简介:顾地周(1973-),讲师 ,主要从事长白山区珍稀濒危植
物和药用植物研究。
1.2　长白柳嫩茎基部直接再生芽苗诱导培养基的
筛选
以 N-68为基本培养基[ 5] ,内含蔗糖 20 g/L ,琼脂
粉 7.5 g/L ,再附加不同质量浓度的细胞分裂素 2ip ,
由预试验确定为 2.80 ～ 3.70 mg/ L。另外通过实验对
比了 6-BA 、ZT 、KT 等 3中细胞分裂素对芽苗的分化
情况 ,培养基中添加 6-BA 和 K T 时嫩茎基部产生大
量愈伤组织 ,不分化芽苗;添加 ZT 时尽管有芽苗分
化 ,但苗发生缩节 ,叶片变形等形态变化 ,且分化率远
不如 2ip 。这可能是长白柳对 2ip 有敏感性和依赖性
等原因和生长素 NAA(由预试验确定为 0.03 ～ 0.08
mg/L),调节 pH 值为 5.6 ,外植体在温度 22±2 ℃、
光照强度 1 500 lx 、光照周期 14 h/d条件下培养 。为
了提高再生芽苗的生长速度和诱导率 ,采用均匀设计
法[ 6-7] ,每个处理接种茎段 10 ,重复 3 次 , 选用 U 10
(102)均匀表 ,考察 2ip 和 NAA 不同质量浓度交叉配
比对诱导率的影响。嫩茎培养 50 d统计诱导率 ,筛选
最适合长白柳嫩茎基部再生芽苗的诱导培养基。
1.3　筛选 长白柳再生芽苗生根培养基
由于再生芽苗在 N-68培养基中生根率较低 ,因
此以 1/4MS(大量元素 1/4)培养基 ,加入蔗糖 15 g/L ,
琼脂 7.0 g/ L ,并附加不同浓度的 IAA(由预试验确定
为 0.10 ～ 1.00 mg/ L)、IBA(0.10 ～ 0.50 mg/L)和
NAA(0.01 ～ 0.06 mg/L),调节 pH 值为 5.6 ,将再生
芽苗切割成 1 ～ 3叶一段[ 8-9] ,茎段在温度(23±2)℃、
光照强度 1 100 lx 、光照周期 8 h/d条件下培养。为了
提高长白柳的生根率 ,采用均匀设计法 ,每个处理接
种茎段为 10个 ,重复 3 次 ,选用 U10(103)均匀表 ,考
察生长素 IAA 、IBA 和 NAA 不同质量浓度交叉配比
对生根率的影响 。再生芽苗茎段培养 35 d 统计生根
率 ,筛选最适合长白柳组培苗生根的培养基。
1.4　数据处理与分析
采用均匀设计法进行初步规律设计性试验 ,数
据分析处理应用均匀设计软件(Unifo rm Design
3.0V)。
2　结果与分析
2.1　N-68培养基中 2ip和 NAA 配比对长白柳嫩茎
基部直接再生芽苗的影响
DOI :10.13456/j.cnki.lykt.2011.04.028
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二★一一年第四期　林业实用技术
表 1　长白柳嫩茎基部直接再生芽苗诱导培养基
的 U10(102)均匀设计试验结果
处理号
因　素
2ip(mg/ L) NAA(mg/ L)
X1 X2
诱导率
/ %
1 2.80 0.06 69.0
2 2.90 0.05 72.0
3 3.00 0.03 77.0
4 3.10 0.08 70.5
5 3.20 0.04 79.0
6 3.30 0.04 80.5
7 3.40 0.07 77.0
8 3.50 0.03 89.0
9 3.60 0.05 83.5
10 3.70 0.06 82.0
由表 1 试验结果可得回归方程:Y =34.6 +
16.5X 1 -203X2 ,经计算 , 复相关系数 R=0.982 0 ,
剩余标准差 s=1.34 , 检验值 F t =94.52 , 临界值
F(0.01 , 2 , 7)=9.547 , F t >F(0.01 , 2 , 7) ,表明回归方程有意
义。对各方程项进行显著性检验可知:各方程项对Y 影
响均显著。根据回归方程求出Y 的最优组合为:X 1 =
3.70 ,X 2 =0.03 ,在此组合基础上求得最优解:y=89.6 ,
此解为回归方程的解析解 ,需按公式:Y =y±uα· s(其
中 uα为正态分布的双侧分位数 , s为剩余标准差)计算
出优化值区间估计为:Y =89.6±4.67 ,即 84.93%～
94.27%。通过表 1 试验结果和回归方程及芽苗诱导
情况可知 , 2ip超过 3.60 mg/L 时芽苗诱导率下降 ,
NAA 与诱导率呈负相关 , 以免 2ip 在 3.50 ～ 3.60
mg/ L 之间有较高芽苗诱导率的峰值 , 又以 2ip 为
3.51 、3.52 、3.53 、3.54 、3.55 、3.56 、3.57 、 3.58 和
3.59 mg/L ,NAA 0.03 mg/L 做了 9个处理的试验 ,
重复 3次 ,发现2ip 在3.56 mg/ L 时芽苗诱导率最高。
因此 ,将长白柳嫩茎接种到附加 2ip 3.56 mg/L 和
NAA 0.03 mg/L 的 N-68 培养基上进行再生芽苗诱
导培养 ,培养 25 d ,基部产生颗粒状突起;继续培养至
40 d ,颗粒状突起变为锥形突起并逐渐伸长为芽苗;培
养至60 d ,再生芽苗可生长至1.50 cm以上 ,且苗壮而
整齐 ,芽苗诱导率达 93.5%以上 ,在估计区间内 ,比表
1中 10 个处理的诱导率均高 。因此 ,长白柳嫩茎直接
再生芽苗的最佳诱导培养基为:N-68+2ip 3.56 mg/L
+NAA 0.03 mg/L 。
2.2　1/4M S培养基中生长素配比对长白柳再生芽苗
生根的影响
表 2　长白柳再生芽苗生根培养基的 U10(103)
均匀设计试验结果
处理号
因　　素
IAA
IBA
(mg/ L)
NAA
(mg/ L)
X 1 X 2 X 3
生根率
/ %
1 0.10 0.50 0.04 66.5
2 0.20 0.10 0.03 95.0
3 0.30 0.40 0.01 76.0
4 0.40 0.20 0.06 88.0
5 0.50 0.30 0.02 80.5
6 0.60 0.30 0.02 81.0
7 0.70 0.20 0.05 87.5
8 0.80 0.40 0.01 71.0
9 0.90 0.10 0.03 92.0
10 1.00 0.50 0.04 62.0
根据表 2 试验结果可得回归方程 Y =105 -
5.30X 1 -72.8X 2 ,经计算 ,复相关系数 R =0.994 5 ,
剩余标准差 s =1.31 , 检验值 F t =84.28 , 临界值
F(0.01 , 2 , 7)=9.547 , F t >F(0.01 , 2 , 7),显著 ,说明回归
方程有意义。对各方程项进行显著性检验可知:X 1
和 X 2 方程项对Y 影响均显著。根据回归方程求出Y
的最优组合为:X 1 =0.10 ,X 2 =0.10 ,在此组合基础上
求得最优解:y=96.9 ,同理 ,按公式 Y =y ±uα·s计
算出优化值区间估计Y =96.9±4.58 ,即 92.32%～
101.48%。通过表 2 试验结果和回归分析结果可
知 , X 1 和 X 2 方程项对回归的贡献(按偏回归平方和
降序排列)值为:U(2)=1.06e+3 , U(2)/U =97.9%;
U(1)=23.2 ,U(1)/U =2.14%,即 IBA 对生根率 Y 的
贡献远远大于 IAA ,又因 IBA 与生根率 Y 呈负相关 ,
猜测 IBA 在 0.10 mg/ L 以下有较高的生根率 ,又以
IBA 为 0.10 mg/ L 且不添加 IAA ,以及 IBA 为 0.10 、
0.09 、0.08 、0.07 、0.06 、0.05 、0.04 、0.03 、0.02 、0.01
和 0 mg/ L , IAA 0.10 、0.09 、0.08 、0.07 、0.06 、0.05 、
0.04 、0.03 、0.02 、0.01和0 mg/L 做了12个处理的试
验 ,重复3次 ,发现 IBA 在 0.04 mg/L ,不添加 IAA时
再生芽苗茎段生根率最高 。即待嫩茎基部分化产生
的再生芽苗长至 2.00 ～ 3.00 cm 时 ,将生长健壮的苗
切下 ,切割成 1 ～ 3叶一段 ,将其接种到附加 IBA 0.04
mg/L 的 1/4MS 培养基中 ,培养 12 d ,发现茎段基部
切口或近切口的茎部有 2 ～ 3 个独立的颗粒出现 ,继
续培养至 21 d ,颗粒由锥形状逐渐伸长为不定根 ,培
养至 35 d ,不定根可长至 2.00 cm 以上 ,所有不定根均
产生了大量的侧根 ,腋芽可萌发生长至 2.50 cm 以
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上 ,根和苗的形态 、发育均正常 ,生根率达 99%以上。
在估计区间内 ,且比表 2 所列 10个处理的生根率均
高 。可见 , 长白柳组培苗的最佳生根培养基为:1/4
M S+IBA 0.04 mg/L。
待生根苗长至 3.00 cm 时 ,从培养瓶中取出试管
苗 ,在含有 10 mg/L 杀毒矾溶液中洗去苗上残留的琼
脂 ,然后植入经 1%杀毒矾消毒过的田园土和细河砂
(3∶1)混合的基质中 ,用透光好的塑料薄膜覆盖 ,湿
度保持在 85%,温度控制在(18±2)℃,每天自然光
照 10 h ,每天适时通风 ,每天早晨喷洒清水 1次 。10 d
后揭去薄膜 ,成活率达 95%以上。
3　讨论
结果表明 ,培养基 N-68+2ip 3.56 mg/ L +NAA
0.03 mg/L 对长白柳嫩茎基部直接再生芽苗的诱导效
果最好。当 2ip质量浓度低于 2.80 mg/L 嫩茎基部几
乎不分化芽苗 ,超过 3.56 mg/L 时芽苗诱导率下降 ,均
在 85%以下 ,说明2ip浓度过高对基部直接再生芽苗起
抑制作用。在预实验中发现其对激素非常敏感 ,稍有差
异就有明显变化 , 可能长白柳分布于长白山海拔
2 000 ～ 2 500 m的高山苔原带 ,生境极其恶劣及不同环
境 、营养和激素的浓度对其生长和分化的差异明显等原
因[ 10] ,也可能是内源激素的存在打破了差异显著;NAA
质量浓度低于 0.03 mg/L 嫩茎基部产生的芽苗生长极
其缓慢 ,超过0.08 mg/ L时嫩芽基部产生愈伤组织。为
确保长白柳经组培快繁后的遗传稳定性[ 11] ,离体培养
采取新生嫩芽基部直接再生方式 ,速度快 、分化率高。
培养基 1/4MS+IBA0.04 mg/L 较适合长白柳的
生根 ,生长素 IBA质量浓度低于 0.04 mg/ L 时 ,经过
55 d的培养 ,未见长白柳再生芽苗茎段生根;质量浓
度高于 0.04 mg/ L时 ,生根率均在 95%以下 。这可能
是长白柳的生根对生长素的种类具有选择性及对所
选择的生长素的依赖性较低等原因 。长白柳的组培
快繁与同属的其它种植物不同 ,较为特殊 ,可能是其
内源激素作用等原因。另外 ,应用均匀设计法处理和
分析数据 ,可大大缩短培养基配方的摸索时间 。
本研究结果证明:已成功诱导了长白柳嫩茎的再
生植株 ,达到了预期目的。本研究结果为长白柳的开
发利用和工厂化育苗奠定了基础。
参考文献:
[ 1] 　汪　松 , 解　焱.中国物种红色名录(第一卷)[ M].北
京:高等教育出版社 , 2004:304-464.
[ 2] 　顾地周 , 高捍东 , 顾美影 , 等.应用均匀设计法优化钻天
柳嫩叶柄植株再生体系[ J].东北林业大学学报 , 2009 , 37
(11):21-23.
[ 3] 　欧阳磊 , 郑仁华 , 翁玉榛 , 等.杉木优良无性系组培快繁
技术体系的建立[ J].南京林业大学学报(自然科学版),
2007 , 31(3):47-51.
[ 4] 　顾地周 , 何晓燕 , 朱俊义 , 等.细叶杜香的组织培养和快
速繁殖[ J].植物生理学通讯 , 2007 , 43 (5):898.
[ 5] 　曹孜义 , 刘国民.实用植物组织培养技术教程[ M ].兰
州:甘肃科学技术出版社 , 2002.
[ 6] 　顾地周 , 邓志刚 , 綦茂伟 , 等.苞叶杜鹃离体培养及种质
试管保存体系的建立[ J].南京林业大学学报(自然科学
版), 2009 , 33(3):20-24.
[ 7] 　顾地周 , 朱俊义 , 姜云天 , 等.东北刺人参组培快繁培养
基的筛选[ J].林业科学研究 , 2008 , 21(6):867-870.
[ 8] 　顾地周 , 丛小力 , 姜云天 , 等.色木槭的组织培养与快速
繁殖[ J].植物生理学通讯 , 2008 , 44(2):432.
[ 9] 　顾地周 , 丛小力 , 宋利丽 , 等.木通马兜铃的组织培养和
快速繁殖[ J].植物生理学通讯 , 2008 , 44(1):136.
[ 10] 　吕秀立 , 施季森.欧洲七叶树的离体培养及快速繁殖
[ J].南京林业大学学报(自然科学版), 2004 , 28(6):
41-44.
[ 11] 　邹永梅 ,施季森.北美悬铃木的组织培养[ J].南京林业
大学学报(自然科学版), 2006 , 30(6):61-65.★
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河北林业外来“害虫”193种防治形势严峻
2011 年 4 月 7 日讯 ,目前河北省林业外来有害生物已达 193种 , 对森林生态系统的功能和结构产生了不良影响 , 特别是
对生物多样性构成了威胁。过去 5 年 , 河北省林业有害生物年均发生面积达 4.46 万 hm2 ,去年更是达到了 57.8 万 hm2 ,年
均增加约 4 万 hm2。美国白蛾 、春尺蠖等常发性有害生物危害加剧 , 天幕毛虫 、舞毒蛾等偶发性有害生物暴发周期缩短。特
别是美国白蛾已蔓延到除张家口外的 10 个市 112 个县(市 、区), 局部甚至有暴发成灾之势。目前北京已发现苹果蠹蛾 ,辽宁
和山东发生的日本松干蚧等已逼近河北省。世界上最具危险性的森林病害松材线虫病已在河北省周边的山东 、河南相继发
生 ,传入河北省的风险极高。
面对严峻防治形势 ,河北省日前召开林业有害生物防治工作会议要求 ,今年全省确保林业有害生物成灾率控制在 4.3‰
以下 ,无公害防治率达到 82%以上 ,测报准确率达到 82%以上 , 种苗产地检疫率达到 92%以上。
(中国新闻网)