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DOI:10．3870 / j．issn．1004-0781．2015．10．025
高效液相色谱法测定阴地蕨中山奈酚和槲皮素含量*
何可群
(贵州民族大学化学与环境科学学院，贵阳 550025)
摘 要 目的 通过高效液相色谱-质谱串联( HPLC-MS /MS) 法鉴定阴地蕨中山奈酚成分，并建立 HPLC法同时测
定阴地蕨中山奈酚和槲皮素含量。方法 采用 Agilent 1200 LC 高效液相色谱仪及 API3200 QTＲAP MS /MS 质谱仪，
Ecilipse XDB-C18( 15 mm×4．6 mm，5 μm) 色谱柱，甲醇-0．1%甲酸溶液( 85∶ 15) 为流动相，鉴定阴地蕨中山奈酚及槲皮素;
用 Agilent 1260 LC高效液相色谱仪，Eclipse plus C18色谱柱( 100 mm×4．6 mm，5 μm) ，甲醇-0．4%磷酸溶液( 45∶ 55) 为流
动相，流速 0．8 mL·min－1，检测波长 360 nm，测定阴地蕨中的山奈酚及槲皮素含量。结果 出现 m/z 287．1［M+H］+及
m/z 301．0［M+H］+峰为质谱的特征峰，分别与山奈酚及槲皮素对照品具有高相似度，证明样品中含有山奈酚和槲皮素;
山奈酚和槲皮素的线性范围均为 2．500～25．000 μg·mL－1，r分别为 0．999 9和 0．999 8;精密度实验 ＲSD分别为0．98%和
0．79%( n= 5) ;加样回收率 ＲSD分别为 1．89%，2．70%( n= 5) 。结论 阴地蕨中含有丰富的山奈酚及槲皮素，HPLC 法适
于同时测定阴地蕨中的山奈酚及槲皮素含量，方法简便可行，重复性好，精密度高，结果可靠。
关键词 阴地蕨;山奈酚;槲皮素;高效液相色谱-质谱串联法
中图分类号 Ｒ927．1; 282．71 文献标识码 B 文章编号 1004－0781( 2015) 10－1360－04
Determination of Kaempferol and Quercetin in Botrychium ternatum by HPLC
HE Kequn ( College of Chemistry and Environmental Science，Guizhou Minzu University，Guiyang 550025，
China)
ABSTＲACT Objective To establish a method for simultaneous determination of kaempferol and quercetin in Botrychium
ternatum ( a kind of Ethnic Chinese herbal medicine) by HPLC and HPLC-MS /MS． Methods Agilent 1200 HPLC，API3200
QTＲAP MS /MS，Ecilipse XDB-C18 column ( 15 mm×4．6 mm，5 μm) and the mobile phase consisting of methanol-0．1%formic-
water ( 85∶ 15) were applied to identify kaempferol and quercetin in Botrychium ternatum; Agilent 1260 HPLC and Eclipse plus
C18( 100 mm×4．6 mm，5 μm) column were used for determination of the two．The mobile phase was a mixture of methanol and
0．4% phosphoric acid solution ( 45∶ 55) with a flow rate of 0．8 mL·min－1 and the detection wavelength was 360 nm． Ｒesults
In mass spectrogram of Botrychium ternatum，characteristic peaks of m/z 287． 1［M+H］+ and m/z 301．0［M+H］+ were
consistent with those of standard sample of kaempferol and quercetin，which confirmed their existence in Botrychium ternatum．The
two flavonoids both had a good linearity in the range of 2．500– 25．00 μg·mL－1( r = 0．999 9 and 0．999 8，respectively) ．ＲSD
of precision and reproducibility of kaempferol and quercetin were 0．98%，1．89% and 0．79%，2．70%，respectively． Conclusion
The method is simple，accurate with high sensitivity and suitable for the determination of kaempferol and quercetin in
Botrychium ternatum．
KEY WOＲDS Botrychium ternatum; Kaempferol; Quercetin ; HPLC-MS /MS
阴地蕨(Botrychium ternatum)是阴地蕨科阴地蕨
属多年生草本植物，又名肺心草、蕨叶一枝蒿、独蕨箕、
一朵云等［1-4］。阴地蕨以全草入药，具有清热解毒、止
咳平喘、平肝息风的功效，主治风热感冒、咽喉肿痛、百
日嗽、肺结核、乳腺炎、腮腺炎、小儿惊风、疮痈肿毒、目
生翳障、火眼肿痒等，是我国西南地区白族、彝族、纳西
族、苗族等少数民族常用的野生草药［1-5］。目前对阴
地蕨的研究报道还很少，已有的资料表明，阴地蕨的化
·0631· Herald of Medicine Vol. 34 No. 10 October 2015
学成分主要为黄酮、三萜、皂苷、香豆素、挥发油等，其
黄酮类成分为阴地蕨素，槲皮素 3-O-α-L-鼠李糖-7-O-
β-D-葡萄糖苷及木犀草素等［4-6］。通过文献检索，笔
者还未见有关阴地蕨中山奈酚的研究报道。本实验采
用高效液相色谱-质谱串联(HPLC-MS /MS)获得分子
量信息，进而通过与标样保留时间对比，确定阴地蕨的
山奈酚及槲皮素成分，以峰面积对浓度的回归方程对
两种成分进行定量测定。研究结果可以为该民族药的
进一步开发及扩大资源利用提供科学依据。
1 仪器与试剂
1．1 仪器 Agilent 1200 LC高效液相色谱仪(美国安
捷伦仪器有限公司)及 API3200 QTＲAP MS /MS 质谱
仪(配 ESI 源、三重四级杆及线性离子阱，美国 AB
SCIEX 公司)，Ecilipse XDB-C18(150 mm × 4． 6 mm，
5 μm)色谱柱(上海笛柏实验设备有限公司);Agilent
1260 LC 高效液相色谱仪，Eclipse plus C18色谱柱
(100 mm×4．6 mm，5 μm)，G1314F 1260 VWD 可变波
长紫外检测器，数显恒温水浴锅(常州博远实验分析
仪器有限公司)，METTLEＲAE240电子分析天平(上海
天平仪器厂，感量:0．01 mg)。
1．2 试剂 山奈酚(批号:520-18-3)及槲皮素 (批
号:117-39-5)对照品均购自贵州迪大科技有限责任公
司。磷酸为优级纯，甲酸、无水甲醇均为色谱纯，浓盐
酸为分析纯，所有试剂用超纯水配制。阴地蕨样品购
自云南省云龙县，经贵州民族大学卢文芸教授鉴定为
阴地蕨(Botrychium ternatum)，标本保存于贵州民族大
学化学与环境科学学院药学教研室。
2 方法与结果
2．1 色谱和质谱条件
2． 1． 1 HPLC-MS /MS 色谱柱为 Ecilipse XDB-C18
(150 mm×4．6 mm，5 μm)，柱温:35 ℃，流动相:甲醇-
0．1%甲酸溶液(85∶15)，流速为 1．2 mL·min－1。电
喷雾离子源(electron spray ionization，ESI)，山奈酚采
用 MＲM模式进行正离子监测，喷雾电压为 5．5 kV、离
子源温度 600 ℃，去簇电压 62 V，扫描范围 m/z 50 ～
305。槲皮素采用 MＲM 模式进行负离子监测，喷雾电
压为－4．5 kV、离子源温度 600 ℃，去簇电压－55 V，扫
描范围 m/z 50～305。
2．1．2 定量测定色谱条件 Agilent 1260 LC高效液相色
收稿日期 2014－06－16 修回日期 2014－09－27
基金项目 * 国家社会科学基金资助项目(12XMZ033)
作者简介 何可群(1971－)，女，云南云龙人，副教授，硕士，主
要研究方向:分析化学、药用植物学。电话:(0)13984334546，E-
mail:hekequn2004@163．com。
谱仪，Eclipse plus C18色谱柱(100 mm×4．6 mm，5 μm)，流
动相为甲醇-0．4%磷酸溶液(45∶55)，流速0．8 mL·min－1，
检测波长 360 nm，柱温 30 ℃，进样量10 μL。
2．2 对照品储备液的配制 精密称取槲皮素、山奈酚
对照品各 20．00 mg，分别置于 50 mL量瓶中，加无水甲
醇适量使其溶解，以无水甲醇定容。摇匀，配制成质量
浓度均为 400 μg·mL－1的单一对照品储备液备用，临
用前稀释为山奈酚 0． 800 μg · mL－1 及槲皮素
1．00 μg·mL－1浓度供质谱分析。
2．3 供试品溶液制备 将自然晾干的阴地蕨全草在
电热鼓风干燥箱中于(60±1)℃烘干 3 h，精确称取干
燥、粉碎(过 40目筛)的阴地蕨粉末 0．250 g，用 80%甲
醇溶液 20 mL 浸泡、75 ℃水浴回流提取 2 次，每次
1 h，提取结束后，合并提取液、冷却、滤过。滤液用
80%甲醇水溶液补足至 40 mL，加盐酸 10 mL，85 ℃水
浴回流酸水解 1 h，迅速冷却，用无水甲醇定容至
50 mL，摇匀，临用前过孔径 0．45 μm滤膜［7-9］。
2．4 HPLC-MS /MS 实验 取对照品和供试品溶液
3 μL分别注入 HPLC-MS /MS，得到山奈酚对照品溶
液、槲皮素对照品溶液、供试品溶液中的山奈酚及槲皮
素的 MS谱图(图 1，2)。在正离子监测模式下，山奈
酚对照品溶液和供试品溶液对应峰 MS 谱图产生 5 个
主要的特征碎片离子 m/z287，185，161，153，121(图
1)，m/s287为山奈酚的［M+H］+峰，证明样品中含有
山奈酚［10-11］;在负离子监测模式下，槲皮素对照品溶
液和供试品溶液对应峰 MS谱图产生 5 个主要的特征
碎片离子 m/s273，257，239，229，211(图 2)，m/z301．0
为槲皮素的［M+H］+峰，证明样品中含有槲皮素［10-11］。
由于采用负离子监测模式，槲皮素的 MS 图谱中没有
出现 m/z285峰。
2．5 保留时间的确定 将 20．00 μg·mL－1山奈酚、槲
皮素混合对照品溶液按“2．1．2”项色谱条件进样分析，
得到对照品及样品色谱图(图 3)。结果阴地蕨供试品
出现与混合对照品中山奈酚(18． 66 min)、槲皮素
(10．11 min)保留时间一致的两个峰。
2．6 线性关系考察 分别精密吸取质量浓度为
400 μg·mL－1的山奈酚、槲皮素标准溶液适量，配制成
含山奈酚、槲皮素均为 2．50，5．00，10．00，15．00，20．00，
25．00 μg·mL－1的混标溶液。以孔径 0．45 μm 滤膜滤
过，分别进样 10 μL。在“2．1．2”项色谱条件测定峰面
积，以对照品溶液浓度(X，μg·mL－1)为横坐标，峰面
积(Y)为纵坐标，绘制标准曲线并进行回归分析，山奈
酚:Y= 29．85X－13．24，r = 0．999 9;槲皮素:Y = 43．86X－
24．02，r= 0．999 8。结果表明:山奈酚及槲皮素均在
·1631·医药导报 2015年 10月第 34卷第 10期
2．500～25．000 μg·mL－1范围内呈现良好的线性关系。
图 1 山奈酚对照品溶液(A)和阴地蕨供试品溶液(B)
质谱图
Fig． 1 ESI + MS spectrum of kaempferol standard
solution (A)and Botrychium ternatum solution (B)
图 2 槲皮素对照品溶液(A)和阴地蕨供试品溶液(B)质
谱图
Fig．2 ESI-MS spectrum of quercetin standard solution
(A)and Botrychium ternatum solution (B)
2．7 精密度实验 将质量浓度均为 20．00 μg·mL－1
山奈酚、槲皮素混合对照品溶液按“2．1．2”项项色谱条
件连续进样 5次进行分析，以峰面积计算山奈酚及槲
皮素的 ＲSD分别为 0．98%，0．79%，表明方法精密度良
好。
2．8 重复性实验 取同一批样品(批号:20140116)5
份，按“2．3”项方法制备溶液，按“2．1．2”项色谱条件进
样分析，测定峰面积，计算山奈酚及槲皮素的平均质量
分数，其 ＲSD分别为 1．53%和 1．82%，表明方法重复性
良好。
2．9 稳定性实验 分别在 0，2，4，8 h将一供试品溶液
按“2．1．2”项下色谱条件进行分析，测定色谱峰面积，
计算山奈酚及槲皮素的 ＲSD分别为 2．36%，2．19%，表
明供试品溶液在 8 h内稳定性良好。
2．10 加样回收率实验 ①精密称取 5 份已知含量的
样品(批号:20140116)各 0．250 g，分别精密加入山奈
酚标准溶液适量;②精密称取 5 份已知含量的样品
(批号:20140116)各 0．125 g，分别精密加入槲皮素标
准溶液适量。分别按“2． 3”项下方法制备溶液，按
“2．1．2”项下色谱条件进样分析，测定峰面积，计算各
成分的量及加样回收率，结果山奈酚平均加样回收率
98． 34%，ＲSD = 1． 89%;槲皮素平均加样回收率
98．68%，ＲSD= 2．70%，见表 1。
1．槲皮素; 2．山奈酚
图 3 混合对照品(A)和阴地蕨(B)的高效液相色谱图
1．quercetin;2．kaempferol
Fig． 3 HPLC chromatograms of mixed reference
substances (A)and Botrychium ternatum (B)
表 1 山奈酚和槲皮素加样回收测定结果
Tab．1 Ｒesults of recovery tests on on kaempferol and
quercetin n= 5
成分
原有量 加样量 测得量
μg
加样回收
率 /%
山奈酚 157．37 110 269．05 101．53
157．37 110 264．17 97．09
157．37 130 284．20 97．56
157．37 130 285．28 98．39
157．37 170 322．45 97．11
槲皮素 240．19 180 413．87 96．49
240．19 180 414．74 96．97
240．19 250 494．16 101．59
240．19 250 494．20 101．60
240．19 290 520．82 96．77
·2631· Herald of Medicine Vol. 34 No. 10 October 2015
2．11 样品测定 精密称取 3 批阴地蕨样品各 3 份，
每份 0．250 g，按“2．3”项下方法制备溶液，按“2．1．2”项
色谱条件分别进行分析，测定峰面积，计算各成分的
量，结果见表 2。
表 2 阴地蕨中山奈酚、槲皮素的测定结果
Tab． 2 Ｒesults of content determination on kaempferol
and quercetin in Botrychium ternatum n= 3
样品
山奈酚
平均质量分数 /
(mg·g－1)
ＲSD /
%
槲皮素
平均质量分数 /
(mg·g－1)
ＲSD /
%
20130217 1．33 1．47 3．02 1．28
20140116 1．26 1．75 3．84 1．37
20140213 1．12 1．38 3．16 1．56
3 讨论
研究证实，阴地蕨有显著的抑制癌细胞增殖及转移
的作用［12］，但迄今为止，其资源还未得到有效的开发利
用，对其化学成分的研究报道也很稀少。笔者在本实验
中用 HPLC-MS /MS法对阴地蕨中山奈酚及槲皮素进行
鉴定并测定二者的含量，首次报道阴地蕨中的山奈酚成
分，实验结果进一步证实阴地蕨抗菌、抗炎、止咳等功效
的物质基础，可以为该民族药的药用价值开发及扩大资
源利用提供一定的科学依据。
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DOI:10．3870 / j．issn．1004-0781．2015．10．026
不同产地及不同药用部位
马蓝中靛蓝和靛玉红的含量测定
程佩佩，夏叶，方玉，答国政，黄静，张秀桥
(湖北中医药大学药学院，武汉 430065)
摘 要 目的 建立反相高效液相色谱( ＲP-HPLC) 法同时测定不同产地、不同药用部位马蓝中靛蓝、靛玉红的含
量。方法 选用 Agilent TC-C18色谱柱 ( 4． 6 mm × 250 mm，5 μm ) ，流动相为甲醇-水 ( 75 ∶ 25 ) ，柱温 25 ℃，流速
1．0 mL·min－1，检测波长 290 nm。结果 靛蓝在 0．051 3～0．820 8 μg范围内与峰面积呈良好的线性关系( r = 0．999 3) ，
平均回收率为 99．00%，ＲSD为 1．30%( n = 6) 。靛玉红在 0．049 5 ～ 0．792 0 μg 范围内与峰面积呈良好的线性关系( r =
0．999 9) ，平均回收率为 98．88%，ＲSD为 1．51%( n = 6) 。结论 马蓝中靛蓝、靛玉红因产地和药用部位的不同，含量差
异较大。该方法操作简便、快速、可靠，可为马蓝药材的质量控制提供实验依据。
关键词 马蓝;靛蓝;靛玉红;含量测定;色谱法，高效液相
中图分类号 Ｒ281．1; Ｒ927．2 文献标识码 B 文章编号 1004－0781( 2015) 10－1363－04
·3631·医药导报 2015年 10月第 34卷第 10期