全 文 ：半边旗（Pteris semiinnata L）是生长在我国南方
的传统中草药，民间用其来治疗感染性疾病。从半边
旗中分离提取到数种具有生物活性二萜类化合物，
其中以 5F （化学结构名为 Ent- 11α- hydrox-
文章编号： 1005- 8982（2010）24- 3687- 04
·论著·
半边旗提取物 5F对肝细胞癌 BEL- 7402 生长
抑制作用及增殖细胞核抗原表达的影响*
吴科锋 1，刘 义 1，吕应年 1，George G.Chen2，梁念慈 3
(1 .广东天然药物研究与开发实验室，广东 湛江 524023；2.香港中文大学 外科学系，香港 沙田；
3.广东医学院 生物化学与分子生物学研究所，广东 湛江 524023)
摘要：目的 研究半边旗提取物 5F对肝细胞癌 BEL- 7402细胞生长的抑制作用。方法 MTT 法检测 5F对
BEL- 7402细胞的生长抑制作用；用 Hoechst33258荧光染色法检测细胞凋亡；流式细胞仪检测 5F对细胞周期
的影响；免疫细胞化学法检测 5F对增殖细胞核抗原(PCNA)表达的影响。结果 5F抑制 BEL- 7402细胞的生长，
其效果与 5F的浓度和作用时间相关，24、48和 72h的 IC50分别为 60.33、21.32和 11.22 mg/ L；荧光双染色法
显示经 5F作用后细胞出现变形，染色质浓缩，产生凋亡小体；细胞被阻滞在 G2/M，PCNA阳性表达率降低。结
论 5F在体外能有效地抑制 BEL- 7402细胞的生长，其诱导凋亡作用可能与下调增殖细胞核抗原（PCNA）表达
有关。
关键词： 半边旗提取物 5F；BEL- 7402；生长抑制；增殖细胞核抗原
中图分类号：R285.5；R735.7 文献标识码：A
Inhibitory effect on proliferation and PCNA expression
of 5F from Pteris semiinnata L in hepatocellular
carcinoma BEL-7402 cells*
WU Ke-feng1, LIU Yi1, LV Ying-nian1, George G. Chen2, LIANG Nian-ci3
(1.Guangdong Key Lab for Research and Development of Natural Drugs, Zhanjiang, Guangdong
524023, P.R.China; 2.Department of Surgery, the Chinese University of Hongkong, Shatin, NT,
HK, P.R.China; 3.Institute of Biochemistry and Molecular Biology, Guangdong Medical
College, Zhanjiang, Guangdong 524023, P.R.China)
Abstract:【Objective】To investigate inhibitory effects of 5F from Pteris semiinnata L. on proliferation of hepato－
cellular carcinoma (HCC) BEL-7402 cells.【Methods】BEL-7402 cells growth inhibition mediated by 5F was de－
tected by MTT assay. Hoechst33258 staining was used to observe apoptosis. Flow cytometer was used to determine
the effect of 5F on the content of DNA in cells. PCNA expression was determined by immunocytochemical method.
【Results】5F displayed growth inhibitory activity against BEL-7402 cells with IC50 values of 60.33, 21.32 and
11.22 mg/L for 24, 48, and 72 hours respectively. 5F induced apoptosis. BEL-7402 cells treated by 5F were arrested
at G2/M. 5F could depress PCNA expression level in BEL-7402 cells. 【Conclusions】In vitro 5F inhibited signifi－
cantly the proliferation of BEL-7402 cells and the inducing apoptosis, the mechanism may be related with down-
regulation of PCNA expression.
Key words: Psl5F; BEL-7402; inhibition; PCNA
收稿日期：2009- 12- 18
*基金项目：国家自然科学基金资助项目（No：39870900）；香港创新科技署粤港合作项目（No：GHP/022/06）
第 20卷第 24期 中国现代医学杂志 Vol. 20 No.24
2010年 12月 China Journal of Modern Medicine Dec. 2010
3687· ·
组别 24 h 48 h 72 h
对照组 - - -
5 mg/L 3.77±4.52 7.70±6.961） 18.02±3.821）
10 mg/L 9.69±5.99 14.92±4.511） 33.53±3.932）
20 mg/L 14.53±2.70 49.82±4.462） 81.24±4.422）
40 mg/L 42.19±1.432） 74.66±4.172） 90.50±2.812）
80 mg/L
ADM（5 mg/L）
58.32±1. 232）
38.49±1.392）
92.80±3.422）
48.97±5.362）
98.69±1.772）
70.54±5.792）
注：1）与对照组相比，P <0.05；2）与对照组相比，P <0.01
表 1 5F对 BEL- 7402细胞增殖的抑制作用
（n =8，%，x±s）
中国现代医学杂志 第 20卷
y- 15- oxo- kaur 16- en- 19- oic acid）含量最高。我课
题组长期的研究表明，5F在体外能抑制多种癌细胞
的生长并诱导凋亡的发生；能明显缩小 EAC、S180
等瘤株在小鼠体内所形成肿瘤的大小，延长其存活
时间[1- 3]。
肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC，简称
肝癌）是世界范围内最常见的恶性肿瘤之一，据世界
卫生组织 2005年肿瘤统计分析表明，目前每年患肝
癌人数为 626 000，死亡 595 000人[4]。因此从天然植
物中提取具有抑制肝癌细胞生长的高效低毒的化合
物已经成为抗肿瘤研究的热点。本研究皆在探讨 5F
对肝细胞癌 BEL- 7402细胞生长的抑制作用及可能
的机制。
1 材料与方法
1.1 材料
5F（本实验制备，纯度为 95%）；MTT、Hoechst
33258为 Sigma公司产品；超级无支原体新生牛血
清购自杭州四季青生物材料有限公司；RPMI 1640
购自美国 Gibco公司；胰酶购自美国 Gibco公司；其
余试剂均为国产分析纯。
1.2 方法
1.2.1 细胞培养 BEL- 7402细胞培养于含 10%小
牛血清、100 ku/L青霉素和 100 mg/L链霉素的 RP-
MI 1640培养液中，37℃、5%二氧化碳饱和湿度细胞
培养箱培养。取对数生长期细胞用于实验。
1.2.2 5F 供试液制备 精密称取 105 mg 5F，以
100μL二甲基亚砜（DMSO）溶解，加蒸馏水定容至
100 mL，制成 0.1%的 DMSO的 5F供试液，标示量为
1 g/L，0.22μm无菌滤膜过滤除菌，4℃保存，临用前
稀释成 50、100、200、400和 800μg/L给药。
1.2.3 MTT 法检测 5F对 BEL- 7402细胞的生长抑
制作用[4] 取对数生长期的 BEL- 7402细胞，用0.25%
胰蛋白酶消化，RPMI- 1640 完全培养液调制成
2.0×104个 /mL细胞悬液，接种于 96孔板中，每孔
接种 100μL（含 2.0×103个细胞）。培养过夜后，吸
出培养液，加入新培养液 90μL及不同浓度的 5F
药液 10μL，使终浓度分别为 5、10、20、40 和
80μg/mL。同时设置空白及阿霉素（ADM）阳性对照
组，对照组加入相同体积的培养液，每一浓度设 8个
平行孔。继续培养 24、48和 72 h，每孔加入 MTT（5
g/L）20μL，继续培养 4~6 h。每孔加入 DMSO
100μL，在微型振荡器上摇匀 15 min，结晶溶解后，
立即比色，用 ELX800 型酶标仪在主波长为 570
nm、参比波长为 630 处测量 OD值，比色以空白孔
调零。实验重复 3次。
抑制率 =（1- 实验组 8孔 OD值平均值 /对照
组 8孔 OD值平均值）×100%。
Bliss方法计算半数抑制浓度 IC50。
1.2.4 荧光显微镜观察细胞形态 取对数生长期细
胞，调整细胞浓度为 2.0×105个 /mL，加 1 mL到预
先放置盖玻片的 6孔板中，24 h待细胞爬片后，加入
不同浓度的 5F 药液，使其终浓度为 10、20 和 40
mg/L，继续培养 24 h后，用预冷的 PBS洗涤 2次，加
入 0.5 mL Hoechst33258染色液，染色 5 min。用 PBS
洗 2次，每次 3 min，吸尽液体。滴一滴抗荧光淬灭封
片液于载玻片上，盖上贴有细胞的盖玻片，尽量避免
气泡。在荧光显微镜下观察并照相，激发波长在 350
nm左右，发射波长在 460 nm左右，区分出凋亡细胞
和活细胞（呈弥散均匀的蓝色荧光者为活细胞，细胞
核或细胞质内见致密浓染的颗粒状荧光者为凋亡
细胞）。
1.2.5 流式细胞仪检测细胞周期的变化 参照文
献[5]介绍的方法略加改进，1 000 r/min，离心 5 min收
集药物处理组和对照组细胞，PBS洗涤 2次，体积分
数为 70%的乙醇 - 20℃固定 24 h以上，PBS离心洗
去乙醇后加 PI 染液 （含 50 mg/L PI，10 mg/L
RnaseA，0.1% TritonX- 100，0.1%柠檬酸钠和 0.5%
NaCl），室温下避光染色 30 min，400目筛网过滤，用
EPICSXL型（美国）流式细胞仪检测 DNA含量，实
验重复 3次。
2 结果
2.1 5F对 BEL- 7402 细胞的生长抑制作用
从表1和图 1的结果可以看出，5F能明显抑制
BEL- 7402细胞的生长，其效果与时间和浓度相关。
10、20和 40 mg/L的 5F在作用细胞 48 h后效果与阳
3688· ·
浓度（mg/L）
100
80
60
40
20
0
0 5 10 20 40 80
抑
制
率
/（
%）
5F 24 h
5F 48 h
5F 72 h
图 1 5F对 BEL- 7402细胞增殖的抑制作用
组别
对照组 76.4±3.04 7.7±1.34 15.8±2.04
5F
10 mg/L 76.5±4.27 8.8±1.01 14.7±3.01
G0/G1 G2/M S
20 mg/L
40 mg/L
70.5±3.68覮
69.1±4.54覮
16.9±2.57覮
5.2±0.58覮
12.6±2.13覮
25.7±2.37覮
注：覮与对照组相比，P <0.05
表 2 不同浓度的 5F作用于 BEL- 7402细胞 24 h后
细胞周期相分布 （n =3，%，x±s）
DNA Content
240
200
160
120
80
40
0
0 64 128 192 256 320 384 448 512
Ce
ll
Nu
m
be
r
SL CL S0
20014888、H03 WKF- 0 FL3 CELL CYCLE
DATA
Mean G1=164.3
CV G1=10.4
% G1=76.4
Mean G2=320.2
CV G2=10.0
% G2=7.7
% S=15.8
G2/G1=1.949
×B.A.D.=1.3
×Agg.=1.4
Chi Sq=1.3
A
CELL CYCLE
DATA
Mean G1=160.5
CV G1=8.9
% G1=76.5
Mean G2=326.9
CV G2=8.5
% G2=8.8
% S=14.7
G2/G1=1.940
×B.A.D.=1.4
×Agg.=1.0
Chi Sq=1.6
0 64 128 192 256 320 384 448 512
20014889、H03 WKF- 1 FL3
300
250
200
150
100
50
0
DNA Content
SL CL G21 S0
B
C
CELL CYCLE
DATA
Mean G1=160.1
CV G1=9.6
% G1=70.5
Mean G2=293.1
CV G2=9.7
% G2=16.9
% S=12.6
G2/G1=1.831
×B.A.D.=1.6
×Agg.=1.0
Chi Sq=1.2
20014891、H03 WKF- 2 FL3
240
200
200
160
120
80
40
0
0 64 128 192 256 320 384 448 512
DNA Content
SL CL S0
第 24期 吴科锋，等：半边旗提取物 5F对肝细胞癌 BEL- 7402生长抑制作用及增殖细胞核抗原表达的影响
性对照药 ADM 5mg/L相近。5F作用 BEL- 7402细胞
24、48 和 72 h 的 IC50 分别为 60.33、21.32 和 11.22
mg/L。
2 .2 荧光显微镜观察 5F 对 BEL- 7402 细胞的
影响
经 Hoechst 33258荧光染色的 BEL- 7402细胞，
对照组细胞核大小较均一，呈圆形或椭圆形，染色
质分布均匀，只有个别细胞出现凋亡（显蓝色荧光）
（图 2），而经 5F处理 24 h后的 BEL- 7402细胞的大
部分细胞形态出现不同程度皱缩，变形，染色质浓
缩，部分细胞核染色体碎裂，并有凋亡小体出现（图
2），且细胞凋亡（显蓝色荧光）形态出现的多少与 5F
的浓度相关。
2.3 流式细胞仪检测细胞周期的变化
分别用不同浓度的 5F作用于 BEL- 7402细胞
24 h，收集各组细胞，用流式细胞仪分析细胞周期相
分布（表 2，图 3），结果显示：药物处理细胞后，与对
照组比较，G0/G1期细胞先增加，S期和 G2/M期细胞
减少，当药物浓度增大到 40 mg/L时，G0/G1 期和
G2/M期细胞减少，S期细胞增加。当药物浓度达到
40 mg/L时，有指示细胞凋亡的亚 G1 期“凋亡峰”
出现。
2.4 免疫细胞化学法检测 5F 对细胞核细胞凋亡
的影响
用 5F 0（对照）、10、20和 40 mg/L处理细胞 24
h，PCNA表达结果见图 4。从图 4可见，不同浓度的
5F处理后，PCNA阳性表达的细胞明显减少（细胞呈
棕黄色的为阳性表达）。
A：对照组；B：10 mg/L 5F；C：20 mg/L 5F；D：40 mg/L 5F
图 2 5F处理后细胞的形态学改变（×400）
A B
C D
3689· ·
DCELL CYCLE
Mean G1=162.8
CV G1=9.5
% G1=69.1
Mean G2=315.8
CV G2=9.5
% G2=5.2
% S=25.7
G2/G1=1.948
% Tot=94.7
×B.A.D.=3.7
×Agg.=4.4
Chi Sq=3.1
20014891、H03 WKF- 3 FL3
480
400
320
240
160
80
0
0 64 128 192 256 320 384 448 512
DNA Content
SL CL CV G21 S0
APOPTOT. PEAX
Mean G2=315.8
CV G2=9.5
% G2=5.2
D.I.=0.255
A：对照组；B：10 mg/L 5F；C：20 mg/L 5F；D：40 mg/L 5F
图 3 5F作用 24 h对 BEL- 7402细胞周期的影响
3 讨论
目前应用化学药物治疗肝癌，对于改善和延长
肝癌患者的生存质量和时间具有其他治疗方法无可
替代的作用，但肝癌普遍对传统化疗有抗药性，全身
单药化疗有效率低（0~20%）。最常用的单药化疗药
物是阿霉素（doxorubicin）或以阿霉素为主的联合化
疗[5- 6]。一个关于阿霉素联合用药（cisplatinum，inter-
feron，doxorubicin，and 5- fluorouracil，PIAF） 的三期
临床发现与单用阿霉素相比能显著增加有效率，但
对增加中位生存期无明显改善[7]。由于传统化疗药物
的毒副作用及易产生耐药性等缺陷，从天然产物中
筛选新的高效低毒的抗肿瘤药也就成了当务之
急。
从本实验的免疫荧光染色和流式细胞仪的检测
结果来看，两种方法均显示 5F能诱导 BEL- 7402细
胞凋亡，但免疫荧光染色的方法更为敏感，在较低剂
量就能发现凋亡细胞。这与大多数抗癌药物是通过
诱导肿瘤细胞凋亡发挥其抗肿瘤作用相一致。通过
细胞周期检测，当 5F 的浓度达到 40 mg/L时，使
G0/G1期的细胞减少，并使细胞于 G2/M期细胞显著
减少，并有指示细胞凋亡的亚 G1期“凋亡峰”出现。
因此，推测 5F抑制 BEL- 7402细胞增殖，由于 5F使
肿瘤细胞的 DNA受到不可逆性损伤，从而导致细胞
周期停滞在 G2/M期。PCNA作为 DNA聚合酶的辅
助蛋白之一，是真核细胞 DNA合成必需的一种酸性
核蛋白。目前认为，PCNA高表达会使肿瘤细胞增殖
活跃且易于转移 [8- 9]。本研究显示 5F可明显下调
PCNA表达，这可能是 5F抑制肝细胞癌 BEL- 7402
细胞生长的机制之一。
参 考 文 献：
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stituents and antitumor action of Pteris semipinnata [J]. Chinese
Pharmaceutical Journal, 1997, 32(1): 37- 38. Chinese
[3] LI JH, LIANG NC, MO LE, et al. Comparison of the cytotoxicity
of five constituents f rom Pteris semipinnata L. in vitro and the
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（申海菊 编辑）
中国现代医学杂志 第 20卷
A B
A：对照组；B：10 mg/L 5F；C：20 mg/L 5F；D：40 mg/L 5F
图 4 5F对增殖细胞核抗原 PCNA的影响
C D
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