全 文 ：海南医学2016年2月第27卷第3期 Hainan Med J, Feb. 2016. Vol. 27, No. 3
香叶木素诱导人肝癌HepG2细胞凋亡及周期阻滞的机制研究
杨阳，林满洲，黄艺文，陈明
(广东医学院附属医院肝胆外科，广东 湛江 524001)
【摘要】 目的 研究香叶木素对人肝癌HepG2细胞的增殖、凋亡及周期阻滞的影响并揭示其分子机制。
方法 MTT方法检测不同浓度香叶木素对肝癌HepG2的细胞活力的影响；流式细胞术检测不同浓度香叶木素处
理对HepG2细胞周期阻滞及细胞凋亡的作用；Western blot检测香叶木素处理对细胞 p53、Bcl-2、Bax、Cleaved-cas-
pase3、Cleaved-caspase8、Cleaved-PARP、Bak、cdc2、cyclinB1、p21等细胞周期调节或细胞凋亡相关蛋白表达的调
节。结果 香叶木素能显著抑制人肝癌HepG2细胞的增殖并且诱导细胞凋亡(P<0.05)；流式细胞术对细胞周期检
测示：香叶木素处理HepG2细胞，使G0/G1期细胞比例显著降低，而G2/M期细胞比例显著升高(P<0.05)。香叶木
素可下调HepG2细胞中抗凋亡蛋白Bcl-2、cdc2、cyclinB1的蛋白表达，上调 p53、p21、Bax、Bak,Cleaved-caspase3、
Cleaved-caspase8、Cleaved-PARP等促凋亡蛋白。结论 香叶木素在体外实验能通过激活 p53/Bcl-2细胞凋亡通
路抑制人肝癌HepG2细胞的增殖及促进细胞凋亡，同时通过上调 p53、p21下调 cdc2、cyclinB1诱导细胞G2/M周
期阻滞。
【关键词】 香叶木素；细胞凋亡；细胞周期阻滞；肝癌
【中图分类号】 R735.7 【文献标识码】 A 【文章编号】 1003—6350（2016）03—0354—04
Promoting effect of Diosmetin on the cell cycle arrest and cell apoptosis in HepG2 cell and its mechanism. YANG
Yang, LIN Man-zhou, HUANG Yi-wen, CHEN Ming. Department of Hepatobiliary Surgery, the Affiliated Hospital of
Guangdong Medical College, Zhanjiang 524001, Guangdong, CHINA
【Abstract】 Objective To study the effect of Diosmetin on cell proliferation, cell apoptosis and cell cycle ar-
rest in human hepatocellular carcinoma HepG2 cells, and dissect the underlying mechanism. Methods MTT assay was
performed to detect the viability of HepG2 cells under different levels of Diosmetin. The cell apoptosis rate and cell cy-
cle arrest were analyzed by flow cytometry (FCM). Western blot was applied to measure the protein levels of P53,
Bcl-2, Bax, Cleaved-caspase3, Cleaved-caspase8, Cleaved-PARP, Bak, cdc2, cyclinB1, P21. Results Diosmetin treat-
ment on HepG2 cells significantly inhibited cell proliferation and induced cell apoptosis (P<0.05). FCM results showed
that Diosmetin treatment significantly promoted cell cycle arrest in G2/M phase in HepG2 cells (P<0.05), with the pro-
portion of cells in G0/G1 phase significantly reduced. Besides, Diosmetin significantly downregulates Bcl-2, cdc2, cy-
clinB1, and up-regulated Bax, Cleaved-caspase3, Cleaved-caspase8, Cleaved-PARP, Bak, P53, P21. Conclusion Dios-
metin inhibits HepG2 cell proliferation and induces cell apoptosis by activation of p53/Bcl-2 pathway. Meanwhile, Dios-
metin treatment induces G2/M cell cycle arrest in HepG2 cell by down-regulation of cell cycle related protein cdc2, cy-
clinB1 and up-regulation of P53, P21.
【Key words】 Diosmetin; Cell apoptosis; Cell cycle arrest; Hepatocellular carcinoma
·论 著·doi:10.3969/j.issn.1003-6350.2016.03.004
通讯作者：陈明。E-mail：fykjk@163.com
肝细胞癌是常见的恶性肿瘤之一，我国肝癌患者多
有肝炎肝硬化背景，手术切除率低，为延长肝癌患者生存
期，化学药物治疗仍是一个重要措施，临床上化疗药物主
要是通过诱导细胞凋亡来消除肿瘤细胞，其疗效过程中
如何与抑制细胞增殖，诱导细胞凋亡的水平有关。
临床上合成的化疗药物副作用大，选择性差，开发
新的及强大功效的天然药物显得十分重要，本研究中香
叶木素(DIOS)是我国南方药用植物的有效成分，其主要
活性成分为黄酮类化合物，此类物质具有抗氧化、抗感
染、抗休克等多种作用，目前，有关研究报道关于香叶木
素在诱导细胞凋亡方面的抗肿瘤作用机制的文章甚
少。本实验以此为切入点，选择HepG2细胞作为实验
研究对象，通过细胞实验研究香叶木素对人肝癌HepG2
细胞活力、细胞凋亡率及细胞周期阻滞的影响。
1 材料与方法
1.1 细胞 人肝癌细胞系HepG2由广东医学院
附属医院临床医学研究中心肝胆外科提供。用含有
10%胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 mg/L链霉素的
RPMI-1640培养基在 5%CO2 37℃恒温培养箱中培
养。2~3 d传代1次，取对数生长期细胞进行实验。
1.2 试剂 香叶木素(Sigma，美国)，AnnexinV-
FITC/PI细胞调亡检测试剂盒 (BD，美国)，人 p53、
Bcl-2、Bax、Cleaved-caspase3、Cleaved-caspase8、Cleav
ed-PARP、Bak、cdc2、cyclinB1、p21抗体(CST，美国)，八
甲基偶氮唑蓝(MTT)及碘化丙啶(PI)染液(Sigma，美
国)，细胞蛋白提取试剂盒(碧云天，中国)，PRMI1640
培养基(Gibco，美国)。
1.3 方法
1.3.1 细胞增殖检测(MTT法) 取对数生长期
的HepG2细胞，消化，计数，用 10%胎牛血清(FBS)培
养液配制成 7.5×103个/孔接种于 96孔培养板，孵育
24 h待细胞贴壁后加入香叶木素(终药物浓度分别为
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0 μg/ml、1 μg/ml、2 μg/ml、5 μg/ml、10 μg/ml、15 μg/ml、
20 μg/ml、25 μg/ml、30 μg/ml)，每组设5个复孔，设置对
照组及实验组，分别培养 6 h、12 h、24 h、48 h，弃上清
液，每孔加入100 μl DMSO，振荡10 min待结晶充分溶
解后在酶标仪490 nm波长处测定每孔吸光度(A)。计
算细胞增殖抑制率，实验重复 3次。抑制率=(对照组
A-试验组A)/(对照组A-空白组A)×100%
1.3.2 流式细胞术检测细胞凋亡变化 收集对照
组和实验组不同浓度香叶木素处理 24 h后的HepG2
细胞制成细胞悬液，加入预冷的磷酸盐缓冲液(PBS)
离心 5 min，洗涤细胞，重复一次。取 100 μl细胞悬
液，分别加入 5 μl AnnexinV-FITC和 PI混匀，避光放
置 20 min，上机前加入 400 μl 缓冲液，混匀后用流式
细胞术检测细胞凋亡率。
1.3.3 检测细胞周期的变化 取对数生长期的
HepG细胞(4.5×103个/ml的浓度，3 ml/孔接种于6孔培养
板内，培养24 h后)，对照组进行换液，实验组给予香叶木
素(终浓度分别为0 μg/ml、5 μg/ml、10 μg/ml、20 μg/ml)
作用24 h后收集细胞，离心1 000 r/min×5 min，用预冷
PBS洗涤后用70%乙醇固定过夜，离心除去乙醇，再用预
冷PBS洗涤，PI染色，4℃避光孵育染色30 min后，用流式
细胞仪检测细胞周期时相的分布，此实验重复3次。
1.3.4 细胞周期蛋白 p21、cdc2、cyclinB1及凋亡
蛋白Bcl-2及Bax、Cleaved-caspase3、Cleaved-caspase8、
Cleaved-PARP、Bak蛋白表达变化的检测 收集对数
生长期的HepG2细胞，按照细胞蛋白质提取试剂盒的
步骤提取细胞总蛋白，收集细胞，用BCA法测定蛋白含
量，95℃变性10 min，上20 μg蛋白样品进行聚丙烯酰胺
凝胶电泳，将凝胶中分离的蛋白转印 PVDF膜。5%
脱脂牛奶封闭 2 h后，一抗 4℃孵育 24 h，二抗 37℃孵
育 2 h，用TBST洗膜后进行化学发光检测目的条带的
表达，实验独立重复3次。
1.4 统计学方法 应用SPSS17.0统计软件进行
实验数据分析。计量资料以均数±标准差(x-±s)表示，
多组间均数比较采用方差分析，其中两两比较采用 t
检验，以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结 果
2.1 DIOS对HepG2细胞形态学的影响 倒置相
差显微镜下观察到：对照组细胞触角纤细，生长旺盛，
形态规则，细胞轮廓清晰，大小均一，折光度强，贴壁
良好。经香叶木素处理后的实验组可见HepG2细胞
形态不规则，细胞形态变圆，细胞间隙增大，部分细胞
呈漂浮状态或贴壁不牢，细胞碎片随浓度的增大而增
多，且随药物浓度增加，细胞数明显减少，见图1。
2.2 DIOS对HepG2细胞活力的影响 香叶木素
能够抑制HepG2细胞的活力，且具有时间浓度依赖性
(P<0.05)，见图2。
2.3 DIOS对HepG2细胞凋亡的影响 香叶木素
可促使HepG2细胞凋亡，且随香叶木素药物浓度的增
加，早期凋亡及晚期凋亡的细胞数逐渐增加且具有一
定的浓度依赖性(P<0.05)，见图3。
图 1 不同浓度香叶木素(0 μg/ml、5 μg/ml、10 μg/ml、15 μg/ml)处理
肝癌HepG2细胞24 h后光学显微镜观察
图2 香叶木素作用HepG2细胞不同时间的细胞活力
图3 不同浓度香叶木素作用HepG2细胞24 h后诱导肝癌HepG2细胞的凋亡率
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2.4 DIOS对HepG2细胞周期的影响 香叶木素
可促使HepG2细胞凋亡，且随香叶木素药物浓度的增
加，早期凋亡及晚期凋亡的细胞数逐渐增加(P<0.05)，
细胞周期结果显示导致G0/G1期细胞数比例降低，
G2/M期细胞数比例升高，且具有一定的浓度依赖性
(P<0.05)，见图4。
2.5 DIOS对HepG2细胞Bcl-2、Bax、Bad、cdc2、
p21、p53、cyclinB1、Cleaved-caspase3、Cleaved-cas-
pase8、Cleaved-PARP蛋白的影响 随着香叶木素药物
浓度的增加，Bax、Bak、Cleved-capase3、Cleaved-cas-
pase8、Cleaved-PARP、p21、p53蛋白表达增高，Bcl-2、
cyclinB1、cdc2蛋白表达下调，见图5。
图5 不同浓度香叶木素作用HepG2细胞24 h后周期蛋白及凋亡蛋白的表达
图4 不同浓度香叶木素对HepG2细胞周期的影响
3 讨 论
我国肝癌发病率高，大多数患者有肝硬化基础，
约70%的患者失去手术切除机会，故在肝癌综合治疗
中化疗占据着重要的地位，目前常用的化疗药物对肝
细胞肝癌疗效欠佳，副作用大，寻求疗效好、副作用低
的天然药物具有很重要的科学与应用价值[1]。
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香叶木素存在自然界的草本药物中，它是我国南
方药用植物 [Striga asiatica (L.) O. Kuntze (玄香科，
Scrophulariaceae)]的有效成分，含有香叶木素的Dian-
thus versicolor Fisch曾作为传统蒙古药材用于治疗肝
细胞恶性肿瘤等疾病。其主要的药物活性成分为黄
酮类化合物，此类物质具有抗活性氧自由基、抗感染、
抗肿瘤等多种奇特功效；而香叶木素是较为特殊的一
种黄酮类化合物，它含有一种抑制人类肝细胞CYP1A
酶活力的天然黄酮类化合物，具有抗诱变和抗变应特
性[2]。香叶木素对于抑制肿瘤细胞的生长及侵袭的细
胞实验研究甚少，因此深入研究香叶木素对肿瘤细胞
的周期阻滞及细胞凋亡作用机制为研发新型抗癌药
物更具有科研意义。
Cdc2 (Cyclin-dependent kinases1，CDK1)生物学上
称为细胞周期蛋白依赖性激酶 1，是一个高度保守的
丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。Cdc2能促使真核细胞周期
G2/M期检测点起正性调节作用，它与细胞色素B1(cy-
clinB1)相互作用形成有丝分裂促进因子复合物，促进
细胞进入M期。有研究表明，cyclinA和Cdc2的表达
能抑制 cyclinB/Cdc2复合体的形成，而 cyclinB/Cdc2
复合体在细胞进入有丝分裂过程中发挥了重要的作
用。而该研究表明香叶木素能下调Cdc2及 cyclinB1
的蛋白表达，从而促使肝癌HepG2细胞的细胞周期阻
滞于G2/M期。香叶木素同样能够通过激活 p53通路
调控 p21周期蛋白的高表达，而 p21周期蛋白能抑制
cdc2表达，从而促使细胞周期阻滞于G2/M期[3]。
本实验中通过倒置相差显微镜观察到香叶木素
能够明显诱导人肝癌HepG2细胞的凋亡，且通过MTT
实验进一步说明香叶木素对人肝癌HepG2细胞的活
力有明显的抑制作用。而其后的流式细胞术检测香
叶木素处理后的肝癌细胞将进一步证明随着香叶木
素药物浓度的增加与人肝癌HepG2细胞的凋亡数呈
正相关 [4]。而实验最后的Western blot的结果发现
p53、Bcl-2、Bax、Bak、Cleaved-PARP、Cleavd-caspase8、
Cleaved-caspase3高表达进一步证明了香叶能通过
p53/线粒体通路诱导细胞凋亡。
Bcl-2蛋白是Bcl-2原癌基因的编码产物，是细胞
存活促进因子，Bcl-2为细胞凋亡过程中的原癌基因
之一。Bcl-2蛋白家族参与细胞线粒体途径凋亡调
控，Bcl-2蛋白家族可分为凋亡抑制蛋白和促细胞凋
亡蛋白两大类。其中Bcl-2是抑制细胞凋亡蛋白，Bax
是典型的促细胞凋亡蛋白，而Bax与Bcl-2相结合发
挥调控这细胞凋亡这一过程，而本实验中发现香叶木
素对HepG2细胞的Bcl-2家族蛋白的检测发现香叶木
素能够通过线粒体通路诱导Bcl-2蛋白的低表达，增
强Bax凋亡促进蛋白的高表达，且Bax/Bcl-2比值逐渐
增大，这一现象进一步阐明香叶木素能够通过线粒体
途径的Bcl-2蛋白家族诱导细胞凋亡[5]。
在维持DNA的稳定性和完整性的过程中，PARP
(聚二磷酸腺苷核糖聚合酶)是DNA损伤的一个重要敏
感感受器。Caspase-3在正常细胞内以无活性酶原形式
存在于胞浆中，当细胞凋亡程序被激活，形成两个小亚
基和大亚基，随之导致细胞的凋亡。而PARP是细胞凋
亡的最终执行者，通过外源性及内源性线粒体途径启动
细胞凋亡，细胞的最终凋亡也反馈性的激活Caspase-3
的表达。因此，在生物学上一致认为Caspase-3的活化
是细胞凋亡发生的重要标志。若DNA损伤严重且无法
修复时，以底物形式参与凋亡从而诱发细胞生物学的改
变[6]。而PARP是通过Caspase-3的活化来诱导细胞的
最终凋亡，也是凋亡进程中的最后一阶段。该研究中发
现香叶木素能随着浓度的增加促使Cleaved-PARP表达
显著上升，且在这一过程中Cleaved-caspase3表达显著
上升，与Cleaved-PARP的变化一致[7]。
综上所述，香叶木素通过 p53及线粒体凋亡通路
调控 Bcl-2表达的下调，上调 Bax、Cleaved-caspase3、
Cleaved-caspase8、Cleaved-PARP、Bak，在上述体外实
验证明香叶木素能以时间-浓度效应抑制人肝癌
HepG2细胞的活力、促进细胞凋亡，影响细胞周期蛋
白的表达从而促使细胞周期阻滞于G2/M期，促使肝
癌细胞HepG2细胞的生长阻滞。因此，香叶木素是一
种潜在的肝癌化疗候选药物，且未来实验对香叶木素
如何影响细胞周期蛋白的表达将作进一步探讨。
参考文献
[1] Darvesh AS, Aggarwal B, Bishayee A. Curcumin and liver cancer: a
review [J]. Current Pharmaceutical Biotechnology, 2012, 13(1):
218-228.
[2] Kanaze FI, Bounartzi MI, Niopas I. A validated HPLC determination
of the flavone aglycone diosmetin in human plasma [J]. Biomedical
Chromatography, 2004, 18(10): 800-804.
[3] Obmann A, Werner I, Presser A, et al. Flavonoid C-and O-glycosides
from the Mongolian medicinal plant Dianthus versicolor Fisch [J].
Carbohydrate Research, 2011, 346(13): 1868-1875.
[4] 刘溪.吴茱萸碱诱导人肝癌细胞HepG-2细胞周期阻滞机制研究
[D].哈尔滨:哈尔滨商业大学, 2012.
[5] Liu B, Zhou Z, Zhou W, et al. Resveratrol inhibits proliferation in hu-
man colorectal carcinoma cells by inducing G1/S phase cell cycle ar-
rest and apoptosis through caspase/cyclin CDK pathways [J]. Molec-
ular Medicine Reports, 2014, 10(4): 1697-1702.
[6] Eleawa SM, Alkhateeb MA, Alhashem FH, et al. Resveratrol reverses
cadmium chloride-induced testicular damage and subfertility by
downregulating p53 and Bax and upregulating gonadotropins and
Bcl-2 gene expression [J]. The Journal of Reproduction and Develop-
ment, 2014, 60(2): 115.
[7] Lin B, Tan X, Liang J, et al. A reduction in reactive oxygen species
contributes to dihydromyricetin-induced apoptosis in human hepato-
cellular carcinoma cells [J]. Scientific Reports, 2014, 4: 7041.
(收稿日期：2015-09-05)
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