全 文 :第27卷第2期
2 0 1 2年6月
河 北 林 果 研 究
HEBEI JOURNAL OF FORESTRY AND ORCHARD RESEARCH
Vol.27No.2
Jun.2 0 1 2
文章编号:1007-4961(2012)02-0147 -05
风箱树组织培养研究
马 妍1,朱建峰2,赵健如1,王进茂1
(1河北农业大学 林学院,河北 保定071000;2中国林业科学研究院 林业研究所,北京100091)
摘要:以风箱树(Cephalanthus occidentalis L.)带腋芽的茎段为外植体,探讨不同植物激素(6-BA、IBA、
NAA)对试管苗增殖以及植株再生的影响,建立了一套风箱树离体培养技术体系。试验结果表明:启动最适
培养基为 MS0;增殖最适培养基为 MS+6-BA 1.5mg/L+IBA 0.2mg/L;生根最适培养基为1/4MS0;诱导
率可达73.3%,增殖系数可达3.55,生根率89.47%,移栽成活率可达到100%。
关键词:风箱树;组织培养;快速繁殖
中图分类号:S 722.3+7 文献标志码:A
Tissue culture of Cephalanthus occidentalis L.
MA Yan1,ZHU Jian-feng2,ZHAO Jian-ru1,WANG Jin-mao1
(1 Forestry College,Agricultural University of Hebei,Baoding071000,China;
2 Research Institute of Forestry,Chinese Academy of Forestry,Beijing100091,China)
Abstract:Stems with axilaries bud of Cephalanthus occidentalis L.were used as explants
and the effects of different plant auxins(6-BA,NAA,IBA)on proliferation and regenera-
tion of Cephalanthus occidentalis L.were studied.The results showed that the suitable me-
dium for bud germination was MS0;the optimum multiplication culture medium was MS+6-BA
1.5mg/L+IBA 0.2mg/L;and the rooting culture medium was 1/4MS0.In this cultivation
system,the rate of induction was 73.3%,with the highest propagation coefficient of 3.55,
89.47%rooting rate and 100%survival rate of transplant.
Key words:Cephalanthus occidentalis L.;tissue culture;rapid propagation
风箱树(Cephalanthus occidentalis L.)隶属茜
草科风箱树属,落叶乔木或小灌木,高1~5m。产
于广东、海南、广西、湖南、福建、江西、浙江、台湾;喜
生于略隐蔽的水沟旁或溪畔。国外分布于印度锡金
孟加拉国缅甸泰国老挝和越南北部[1]。在园林应用
方面,风箱树可做护堤植物;此外其根、茎、叶、花均
可药用,性味微苦、凉,具有清热利湿,散瘀消肿的功
效,临床上用于感冒发热、腮腺炎、咽喉炎、肝炎、痢
疾、尿路感染、跌打损伤等[2-3]。国内关于风箱树的
组织培养快速繁殖尚未见报道。河北农业大学林学
院于2008年从中国林业科学研究院引进风箱树,并
栽植于苗圃中。本研究通过试验建立了风箱树的组
培快繁体系,对其快速繁殖、种质资源保存和改良以
及规模化生产具有一定的参考价值。
收稿日期:2012-02-02;修改稿收期:2012-02-28
基金项目:科技部“十一五”科技支撑计划(2006BAD03A0106)和国家林业局科技推广项目(200603)资助。
作者简介:马 妍(1985-),女,河北唐山人,在读硕士,主要从事林业生物技术研究。
通讯作者:王进茂(1969-),男,河北深州人,教授,主要从事林木组织培养与生物技术等方面的教学与研究工作。
148 河 北 林 果 研 究 第27卷
1 材料和方法
1.1 材料
试验材料为5月份采自河北农业大学标本园内
生长健壮、无病虫害的风箱树1年生枝条。
1.2 方法
1.2.1 材料处理 室外采集的枝条用自来水冲洗
表面尘垢后切成3~4cm小段,并剪除叶片,留一部
分叶柄,用软毛笔蘸洗洁精溶液轻轻刷洗,再用自来
水冲洗干净。于超净工作台上用75%的酒精表面
消毒30s,无菌水冲洗3次,20%的84消毒液处理
20min,无菌水冲洗4次后接种于启动培养基上。
1.2.2 启动和增殖培养 启动培养以 MS为基本
培养基,添加不同浓度的6-BA、IBA和NAA组成4
种培养基,每种培养基接种50瓶,每瓶接2个外植
体,20d后统计萌发率及生长状况;增殖培养同样
以 MS为基本培养基,添加不同浓度的6-BA、IBA
和NAA组成17种培养基,每个处理接种10瓶,每
瓶接种3个茎段,20d后统计增殖系数、芽长,观察
材料生长状况。数据用DPS v3.01软件进行邓肯
氏新复极差显著性分析,显著水平0.05。
1.2.3 生根培养 切取高2~3cm的风箱树组培
苗茎段作为试材,选用 L9(34)正交表进行试验
设计,研究不同基本培养基和不同生长素浓度组
合对风箱树试管苗生根的影响。试验因素水平
分别为:基本培养基 (MS、1/2MS、1/4MS)、IBA
(0、0.1、0.3mg/L)和 NAA (0、0.1、0.3mg/L)。
每个处理接种6瓶,每瓶5株苗,进行生根培养,2
次重复,15d后统计生根情况。
1.2.4 移栽 炼苗5d后洗掉培养基移入壤土、泥
炭土(1:1)的育苗钵中,放在温室内进行培养,定期
浇水,以移栽苗长出2片以上新叶为成活标准,30d
后统计成活率。
1.2.5 培养条件 本试验以 MS、1/2MS和1/4MS
为基本培养基,均含3%蔗糖,0.64%琼脂,pH均为
5.8。培养室温度23℃~27℃,光照度1 400~1 600lx,
光照周期15h/9h。
2 结果与分析
2.1 启动培养
将风箱树带腋芽的嫩茎段经消毒后接种于启动
培养基,培养7d后腋芽开始萌发,20d后萌芽长至
1~2cm长,观察发现:培养基中是否添加激素对外
植体的萌发无显著影响。但2、3、4号培养基中外植
体有愈伤组织形成,萌生出的新芽出现伸长生长减
弱及玻璃化的现象,说明外源激素对风箱树外植体
萌发虽略有促进作用,但对新生芽的伸长生长不利
(见表1)。综合考虑,启动培养基以 MS0 为宜。
表1 不同浓度6-BA、IBA、NAA对风箱树茎段启动培养的影响
Table 1 The impact of different concentrations of 6-BA,IBA,NAA on the germination of stems
培养基编号
Medium
No.
6-BA/
(mg·L-1)
IBA/
(mg·L-1)
NAA/
(mg·L-1)
萌发率/%
Germination
rate
芽长/cm
Bud
length
生长状态
Growth state
1 73.3 2.0 新萌生出的芽子粗壮翠绿
2 1.0 76.7 1.0 茎段有愈伤出现,芽点粗壮
3 1.0 0.2 70.0 1.3 茎段有愈伤出现,新萌生出的芽子伸长
生长减弱
4 1.0 0.2 80.0 1.5 茎段有大量愈伤出现,新萌生出的芽子
有玻璃化现象出现
2.2 增殖培养
启动培养基中培养20d后,将萌芽分别剪下,
接种于表2所示培养基中,7d后开始有芽点分化,
20d后整个茎段长成一丛小芽,并伴有愈伤组织形
成。通过观察发现,外植体基部有愈伤和根的形成,
且随着6-BA浓度的增加,愈伤量逐渐增加,生根数
量逐渐减少。在不添加任何激素的 MS0 培养基中
苗高最高,但增值系数最低,在加有激素的其他16
种培养基中虽然高生长有所减弱,但分化系数均有
大幅度的提高。加有IBA的培养基与加有NAA的
培养基相比,前者的丛生芽增殖系数较大且芽长较
长;随着6-BA浓度增加,各种培养基中组培苗的增
殖系数逐渐增加,但高生长减弱并出现玻璃化及茎
尖干死的现象。由表2数据可知,6-BA的使用浓度
在1.5mg/L较为适宜,低于或超过这个浓度对风
箱树茎段的增殖和生长都不利(见图1)。数据统计
分析可知,不同培养基中外植体增殖系数和芽长存
在显著性差异,但以13号培养基增殖效果最好,增
殖系数达3.55,苗高5.27cm。因此增殖培养基以
MS+6-BA 1.5mg/L+IBA 0.2mg/L为宜。
第2期 马 妍等:风箱树组织培养研究 149
表2 MS培养基中添加不同浓度的激素组合对丛生芽诱导的影响
Table 2 The impact of MS medium supplemented with different concentrations of
auxin combinations on the induction of multiple shoots
培养基编号
Medium
No.
6-BA/
(mg·L-1)
IBA/
(mg·L-1)
NAA/
(mg·L-1)
增殖系数/倍
Multiplication
coefficient
芽长/cm
Bud
length
生长状态
Growth state
1 1.53j 6.50a
组培苗高生长量大,叶片大、伸展、
翠绿
2 0.5 0.1 2.03h 4.97def
有气生根现象出现,组培苗翠绿、
粗壮
3 0.2 1.80i 5.23bcdef 组培苗翠绿、粗壮
4 0.1 3.16b 6.13ab 新分化出的芽子粗壮翠绿
5 0.2 2.66e 5.97abc
组培苗翠绿粗壮,有轻微玻璃化现
象出现
6 1.0 0.1 2.23g 5.03cdef 组培苗翠绿、粗壮
7 0.2 2.42fg 6.10abc 组培苗翠绿、粗壮
8 0.1 3.06bc 5.93abcd 组培苗粗壮翠绿,有干死现象出现
9 0.2 3.03bc 5.47bcdef
组培苗粗壮翠绿,个别芽子出现玻
璃化现象
10 1.5 0.1 2.76de 4.67f 组培苗翠绿、粗壮
11 0.2 2.03h 4.93ef 有玻璃化现象出现
12 0.1 2.89cd 5.73abcde
新分化出的芽子粗壮翠绿,有干死
现象出现
13 0.2 3.55a 5.27bcdef
新分化出的芽子粗壮翠绿,个别芽
子尖端出现干死现象
14 2.0 0.1 2.97bc 5.43bcdef
有玻璃化现象出现,新分化出的芽
子略显细弱
15 0.2 2.46f 3.73g 玻璃化及茎尖干死现象严重
16 0.1 2.34fg 5.20bcdef 新分化出的芽子干死现象严重
17 0.2 3.65a 4.87ef
新分化出的芽子细弱,玻璃化和干
死现象严重
注:增殖系数为腋芽萌生数和基部丛生芽数之和与接种外植体数之比;同一列不同字母表示在P<0.05水平上与对照差异显著。
左:6-BA(0.5~1.5mg·L-1) 右:6-BA(2.0mg·L-1)
图1 风箱树在增殖培养基中生长情况
Fig.1 Cephalanthus occidentals growed in multiplication culture medium
150 河 北 林 果 研 究 第27卷
2.3 生根培养
将风箱树无根试管苗转入生根培养基中,第5
天时便可见根原基出现,一般先在激素(NAA 或
IBA)浓度较大的培养基中出现,同时伴有愈伤组织
形成。15d时观察生根情况并将相关数据进行统
计(见表3)。结果表明,无论在何种生根培养基中
风箱树茎段均可达到较高的生根率,但生根质量有
较大差异。在加有激素的生根培养基中,茎段基部
及所形成的根均有愈伤化现象发生,且随着激素浓
度的增加,愈伤化现象急剧加重。同时,随着激素浓
度的增加,生根率及生根条数均有较大幅度的增加,
但根长随着激素浓度的增加受到了明显的抑制(如
图2所示)。
左:1/4MS0基本培养基 右:过高的生长素浓度
图2 风箱树在生根培养基中的生根情况
Fig.2 The rooting result in rooting medium
在后期移栽时也可发现,生根短粗且愈伤化的
组培苗,根易于脱落且不易成活。因此,根长及愈伤
化的状况(愈伤化状况与根长呈负相关)能体现生根
质量。对生根指标进行的直观分析,结果见表3。
表3 不同基本培养基及激素配比对风箱树生根的影响
Table 3 The rooting result of Cephalanthus occidentals in different basic medium
with different concentrations of auxin combination
编号No.
基本培养基
Minimal
medium
NAA/
(mg·L-1)
IBA/
(mg·L-1)
生根率/%
Rooting rate
根条数/条
Root number
根长/cm
Root length
生根状况
Rooting state
1 1/4MS 0 0 89.47 3.53 1.34 无愈伤生成,根较细
2 1/4MS 0.1 0.1 100.00 5.53 0.96 生成的根有明显愈伤化
现象,根较粗
3 1/4MS 0.3 0.3 82.35 7.36 0.40 组培苗生长受到抑制,生根
条数较多,但根较短、粗,
愈伤化严重
4 1/2MS 0 0.1 94.74 4.06 0.88 生根状态基本正常,稍有愈
伤化现象发生
5 1/2MS 0.1 0.3 89.47 8.65 0.58 生根条数较多,但根较短、
粗,愈伤化严重
6 1/2MS 0.3 0 100.00 5.56 0.88 组培苗生长受到抑制,所形
成的根较短、粗,有愈伤化
现象
7 MS 0 0.3 85.00 5.24 0.65 生成的根较短、粗,愈伤化
严重
8 MS 0.1 0 100.00 5.32 1.27 生根条数较多,部分较粗,
有愈伤化现象
9 MS 0.3 0.1 85.00 5.00 0.78 生根条数较多,根较短、粗,
愈伤化严重
第2期 马 妍等:风箱树组织培养研究 151
3种植物激素对风箱树生根长度的影响见表4。
在试验范围内,根长度随各因素含量不同而发生明
显变动。对于风箱树生根的最优组合应为1/4MS0
或 MS0。根据因素内水平级差大小可见参试的3
个因素对风箱树生根长度影响的主次关系为IBA>
NAA>基本培养基,即IBA对风箱树生根长度的
促进有更为重要的作用。
表4 不同基本培养基及激素配比对风箱树根长影响的
指数分析
Table 4 Index analysis about the impact of different basic
medium with different concentrations of auxin
combinations on rooting
各因素水平
Level per factor
基本培养基
Minimal medium
NAA IBA
T1 0.90 0.96 1.16
T2 0.78 0.94 0.87
T3 0.90 0.69 0.54
极差 0.12 0.27 0.62
注:T1、T2、T3分别为各因素逐步递增的3个水平。
采用直观分析法分析不同培养基所得的生根长
度,可见IBA水平为1、NAA水平为1、基本培养基
水平为1或3的时候植株生根长度达到最大,但
IBA水平为1、NAA水平为1时,所加的激素浓度
均为0,因此对于风箱树生根培养,生长素的存在对
根的伸长生长是不利的,综合各方面的因素,最佳的
生根培养基为1/4MS0。
2.4 移栽
生根培养15d后,选取生根质量好生长健壮的
组培苗去掉瓶盖,在瓶内倒少许水,于组培室内锻炼
5d,然后洗掉培养基移入壤土、泥炭土(1∶1)的育
苗钵中,并用薄膜覆盖保湿,放在温室内进行培养,
逐渐将薄膜揭开并定期浇水,以移栽苗长出2片以
上新叶为成活标准,30d后统计成活率,达100%。
3 结论与讨论
本试验建立了适宜风箱树的组培快繁体系,即
启动培养基为 MS0,增殖培养基为 MS+6-BA 1.5
mg/L+IBA 0.2mg/L,生根培养为1/4MS0。此体
系的建立,为这一品种的快速繁殖、种质资源保存和
改良及规模化生产利用奠定了技术基础。
在风箱树启动培养过程中,虽然加有激素的培
养基腋芽的萌发率有所提高,但腋芽萌发后,激素对
其生长也存在不利影响,如芽的伸长生长减弱,并有
玻璃化现象发生;未加激素的 MS0 培养基虽然对腋
芽萌发率稍有影响,但芽子萌发后,生长正常、粗壮,
因此综合考虑,风箱树最适的启动培养基为 MS0,这
与马红媛等[4]对山羊草所做的研究及所得结果相似。
在影响植物组织培养的各因素中,激素是关键
因子,尤其对组织培养的增殖阶段起着决定性的作
用[5-6],在增殖培养的过程中可以发现,随着细胞分
裂素浓度的增加,增殖系数也随着增加,但玻璃化及
茎尖的干死现象也愈加严重,这与黄冬华、任东岁
等[7-8]的研究是一致的,通过添加适宜种类和浓度的
激素可以在一定程度上控制风箱树玻璃化及茎尖干
死现象的发生,其他一些方法,如通气、调节pH
值[9]、改变光照强度等对风箱树玻璃化和芽尖干死
的影响,有待进一步研究。
在生根培养过程中发现,风箱树茎段在各种生
根培养基中均可达到较高的生根率,但就生根质量
而言,在不加激素的1/4MS0 中最好,同时也可看
出,激素的添加对生根率尤其是对生根条数有显著
的促进作用,但当根源基形成后,培养基内外源激素
的存在可使根发生明显的愈伤化现象,根变得粗而
短,并且容易脱落,移栽成活率低,李云等所做的四
倍体刺槐生根实验中也得出相似结论[10]。
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(编辑 杨建肖)