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中药毛果鱼藤藤茎HPLC指纹图谱及不同极性部位抑制癌细胞增殖活性研究



全 文 :* 广西教育厅科研项目(YB2014101) ;国家民委基金(12GXZ009) ;广西民族大学重点项目(2012MDZD041)
** 通讯作者 Tel:(0771)3265023;E - mail:mzxyjiang@ 163. com
第一作者 Tel:(0771)3260558;E - mail:yanglf1990@ 163. com
中药毛果鱼藤藤茎 HPLC指纹图谱及不同极性部位
抑制癌细胞增殖活性研究*
杨立芳1,刘洪存1,冯方权1,李丹妮1,姜明国2**
(1.广西民族大学化学化工学院,广西高校食品安全与药物分析化学重点实验室,南宁 530008;
2.广西民族大学海洋与生物技术学院,广西高校微生物与植物资源利用重点实验室,南宁 530008)
摘要 目的:以不同产地的毛果鱼藤藤茎为研究对象,建立中药毛果鱼藤藤茎 HPLC指纹图谱;检测不同极性部位抑制癌细胞
增殖活性,为科学评价和有效控制毛果鱼藤的质量及其抗肿瘤活性提供科学依据。方法:微波法提取毛果鱼藤藤茎中的有效
成分,采用高效液相色谱法建立毛果鱼藤藤茎的指纹图谱。色谱柱:WondaSilTM - C18(5 μm,4. 6 mm × 250 mm) ;流动相:乙腈
(A)- 0. 5%醋酸溶液(B) ,梯度洗脱(0 ~ 20 min,40%A→60% A;20 ~ 30 min,60% A;30 ~ 45 min,60% A→80% A;45 ~ 60 min,
80%A) ;流速:1. 0 mL·min -1;检测波长:296 nm;柱温:35 ℃;进样量:10 μL;采用 MTT法,考察毛果鱼藤不同极性部位对 NCI -
H460人肺癌细胞、SW480人结肠癌细胞、SGC7901人胃癌细胞、Hela人宫颈癌细胞的生长抑制作用。结果:建立了中药毛果鱼藤
藤茎 HPLC特征指纹图谱共有模式,标定了 16 个共有峰,10 个批次毛果鱼藤藤茎药材指纹图谱经国家药典规定的相似度计
算软件计算,整体相似度良好;抗癌试验结果表明,毛果鱼藤藤茎的石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇提取部位均能显示不同程
度的抑制癌细胞生长的作用,并呈量效关系,且石油醚、氯仿部位表现出较强的抗癌活性,氯仿部位对 Hela 人宫颈癌细胞的
IC50值为 0. 09 mg·mL
-1。结论:毛果鱼藤藤茎高效液相指纹图谱的相似度较高,其不同溶剂提取物抑制癌细胞生长作用的研
究表明,石油醚和氯仿提取部分活性较强。
关键词:毛果鱼藤;极性部位;抗癌活性;高效液相色谱;指纹图谱
中图分类号:R917 文献标识码:A 文章编号:0254 - 1793(2014)12 - 2112 - 07
HPLC fingerprint and antitumor activity of different polar parts
extracted from crude stems of Derris eriocarpa How*
YANG Li - fang1,LIU Hong - cun1,FENG Fang - quan1,LI Dan - ni1,JIANG Ming - guo2**
(1. Key Laboratory of Guangxi Colleges and Universities for Food Safety and Pharmaceutical Analytical Chemistry,
School of Chemistry and Chemical Engineering,Guangxi University for Nationalities,Nanning 530008,China;
2. Guangxi Key Laboratory of Utilization of Microbial and Botanical Resources,School of Marine
Sciences and Biotechnology,Guangxi University for Nationalities,Nanning 530008,China)
Abstract Objective:To study the HPLC fingerprint and antitumor activity of different polar parts extracted from
crude stem of Derris eriocarpa How from Guangxi,and establish the scientific system to evaluate the quality of the
medicinal materials.Methods:The fingerprints were built by HPLC,the WondaSilTM - C18(5 μm,4. 6 mm × 250
mm)column were used with the mobile phase under a linear gradient(0 - 20 min,40% A→60% A;20 - 30 min,
60%A;30 - 45 min,60% A→80% A;45 - 60 min,80% A)which consisted of acetonitrile(A)and 0. 5% acetic
acid solution(B)at the flow rate of 1. 0 mL·min -1 . The 296 nm UV detection wavelength and the 35 ℃ column
temperature was used. The viability inhibition effect of different extracts from stem of Derris eriocarpa How on tumor
cells(lung cancer cell NCI - H460,colon cancer cell SW480,gastric cancer cell SGC7901 and cervical cancer cell
Hela)was measured by the MTT assay. Results:The common fingerprints were founded with sixteen HPLC peaks
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from ten batches of samples of Derris eriocarpa How by the overall similarity software specified in the national phar-
macopeia. The overall similarity was good. The antitumor test showed that ligarine,chloroform,acetidin,and n - bu-
tyl alcohol from different polar parts extracted from the crude stem inhibited the growth of cancer cells in a dose -
dependent manner. It was notable that the parts of ligarine and chloroform extracts exhibited strong antitumor activity
and the IC50value of chloroform extracts on Hela cell was 0. 09 mg·mL
-1 . Conclusion:The specific fingerprint was
established with high similarity of Derris eriocarpa samples. The experiment of the inhibitory effect of the different
solvent extracts on cancer cell growth showed that the stronger activity part was petroleum ether and chloroform ex-
tracts.
Key words:Derris eriocarpa How;polar fractions;antitumor activity;HPLC;fingerprint
毛果鱼藤为豆科植物毛果鱼藤(Derris eriocar-
pa How)的干燥藤茎,又名土甘草,主要分布在广
东、广西等地区[1],具有利尿除湿、镇咳化痰的功
效。作为广西壮族民间验方的组成之一[2],毛果
鱼藤常被用于治疗膀胱炎、肾炎、尿道炎、咳嗽等
症状[3]。中药及其制剂均为多组分复杂体,且受
气候、生态环境等方面的影响,各化学成分稳定性
存在一定的差异,造成不同批次药材的质量优劣
不同,而中药指纹图谱能较为全面地反映中药及
其制剂中所含化学成分的种类与数量,进而对药
品质量进行整体描述和评价[4]。目前国内外对毛
果鱼藤的质量标准、化学成分、生物活性等方面的
研究比较少[5 - 9],曾有研究者采用薄层色谱和紫外
光谱对毛果鱼藤进行鉴别研究[10],笔者实验室对
毛果鱼藤的化学成分进行了初步的研究,发现其
含有大量有活性的化合物,对其化学成分的活性
追踪试验显示,不同极性部位具有一定的抑制癌
细胞生长的作用。本文应用 HPLC 方法对不同产
地的毛果鱼藤藤茎进行指纹图谱研究,并针对不
同极性部位进行抗癌活性实验,以期为进一步深
入了解毛果鱼藤的化学成分、生物活性及制定毛
果鱼藤的质量控制标准提供科学依据,为壮药毛
果鱼藤的进一步开发、利用提供实验依据。
1 仪器、材料与试剂
SHIMADZU LC - 15C 高效液相色谱仪;XH -
100A微波催化合成 /萃取仪(北京祥鹄科技发展有限
公司) ;SHIMADZU Uvmini -1240 紫外可见分光光度
仪;3111细胞培养箱(Thermo Fisher Scientific)。
甲醇、乙腈均为色谱纯(Fisher公司) ,水为超纯
水,其余试剂均为分析纯。
10 批毛果鱼藤藤茎分别于 2012 ~ 2013 年购于
广西靖西(1 ~ 6 批)、德宝(7 ~ 10 批) ,由广西中医
药大学田慧教授鉴定为豆科鱼藤属植物毛果鱼藤
(Derris eriocarpa How)的干燥藤茎。对照品 Robustic
acid为本实验制备,已经核磁共振仪检测为 Robust-
ic acid(纯度:96. 3%)。癌细胞株:NCI - H460 人肺
癌细、SW480 人结肠癌细胞、SGC7901 人胃癌细胞、
Hela 人宫颈癌细胞均由广西医科大学附属肿瘤医
院基础免疫室提供。
2 方法与结果
2. 1 色谱条件
色谱柱:WondaSilTM - C18(5 μm,4. 6 mm × 250
mm) ;流动相:乙腈(A)- 0. 5%醋酸溶液(B) ,梯度
洗脱(0 ~ 20 min,40% A→60% A;20 ~ 30 min,60%
A;30 ~ 45 min,60% A→80% A;45 ~ 60 min,80%
A) ;流速:1. 0 mL·min -1;检测波长:296 nm;柱温:
30 ℃;进样量:10 μL。
2. 2 供试品溶液制备
将毛果鱼藤藤茎粉碎成粗粉(24 目) ,称取粗粉
5 g,加入 95%乙醇 50 mL,采用微波萃取仪进行回
流提取,提供功率 400 W,提取温度 70 ℃,提取 2
次,每次 20 min,合并提取液,离心 15 min,转速
3000 r·min -1,取上清液,95%乙醇定容至 100 mL,
作为 HPLC指纹图谱检测的供试品溶液。另称取毛
果鱼藤藤茎粗粉 50 g,加入 95%乙醇,提取方法同
上,提取液浓缩,依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正
丁醇萃取;分别合并、浓缩萃取液。取上述萃取液浸
膏各 2 mg,分别用吐温 80 助溶(终浓度小于千分之
一) ,分别加 1640 细胞培养液稀释,使配成不同浓度
的[石油醚部位(3. 35、1. 675、0. 837、0. 419、0. 209
mg·mL -1)、氯仿部位(6. 7、3. 35、1. 675、0. 837、
0. 419 mg·mL -1)、乙酸乙酯部位(2、1、0. 5、0. 25、
0. 125 mg·mL -1)、正丁醇部位(6. 7、3. 35、1. 675、
0. 837、0. 419 mg·mL -1) ]的各供试品溶液。
2. 3 对照品溶液的制备
精密称取 Robustic acid 对照品 10. 0 mg,置 10
mL量瓶中,加甲醇稀释至刻度,摇匀,作为对照品
溶液。
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2. 4 方法学考察[11]
2. 4. 1 精密度试验 取 1 号药材粗粉 5 g(24
目) ,按“2. 2”项下方法制备供试品溶液,按照
“2. 1”项下色谱条件连续进样 5 次,记录色谱图,
考察仪器的精密度。结果表明,色谱峰的相似度
在 0. 996 ~ 0. 999 之间,各色谱峰相对保留时间的
RSD在 0. 007% ~ 0. 027%之间,各色谱峰相对峰
面积的 RSD在 0. 574% ~ 4. 351%之间,表明仪器
的精密度较好。
2. 4. 2 重复性试验 取 1 号药材粗粉 5 份(24
目) ,每份 5 g,按“2. 2”项下方法制备供试品溶液,
按照“2. 1”项下色谱条件进样,记录色谱图,考察方
法的重复性。结果表明,各色谱峰相似度在0. 999 ~
1. 000 之间,相对保留时间的 RSD 在 0. 009% ~
0. 214% 之间,各色谱峰相对峰面积的 RSD 在
0. 543% ~3. 973%之间,表明实验的重复性良好。
2. 4. 3 稳定性试验 取“2. 4. 2”项下供试品溶液,
按照“2. 1”项下色谱条件,分别在 0、4、8、12、24 h 进
行分析,记录色谱图,考察供试品溶液的稳定性。结
果表明,各色谱峰相似度在 0. 992 ~ 0. 998 之间,各
色谱峰与内参比峰(S 峰)的相对保留时间的 RSD
在 0. 008% ~0. 482%之间,各色谱峰相对峰面积的
RSD在 0. 710% ~ 3. 493%之间,表明供试品溶液在
24 h内稳定,符合指纹图谱要求。
2. 5 毛果鱼藤藤茎指纹图谱的建立
2. 5. 1 各产地毛果鱼藤藤茎的指纹图谱采集 以
经形态学鉴定的 10 批毛果鱼藤藤茎为研究对象,
按“2. 2”项下方法制备供试品溶液,按照“2. 1”项
下色谱条件进行 HPLC 指纹图谱研究,记录并比较
10 批毛果鱼藤藤茎的 HPLC 色谱图,确定了 16 个
共有特征峰,并通过 HPLC 分析以及供试品溶液和
对照品溶液 HPLC 保留时间的比对,确定 S 峰为
Robustic acid。根据结果,采用国家药典委员会颁
布的《中药色谱指纹图谱相似度评价系统 A版》计
算机软件进行数据分析处理,建立毛果鱼藤藤茎
的指纹图谱,通过软件计算,共有峰占总峰面积的
80. 76%,毛果鱼藤藤茎的 HPLC 指纹图谱见图 1、
图 2。
图 1 毛果鱼藤藤茎指纹图谱
Fig 1 The typical fingerprint of stems of Derris eriocarpa How
S. Robustic acid
2. 5. 2 参照色谱峰的确定 Robustic acid 为毛果
鱼藤中的已知成分,含量比较大,峰面积明显,而且
保留时间适中,故选用 Robustic acid(S 号峰)作为
参照峰。
2. 5. 3 指纹图谱共有峰的确定[12 - 14] 运用《中药
色谱指纹图谱相似度评价系统 A版》计算机软件进
行指纹图谱数据分析,10 批次图谱都匹配的色谱峰
标定为共有指纹图谱峰。
2. 5. 4 指纹图谱相似度分析[15 - 16] 利用国家药典
委员会“中药色谱指纹图谱相似度评价系统 A版”,
以 1 号样品的指纹图谱作为参照图谱,采用多点校
正后进行自动匹配。10 批药材的相似度分析结果
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图 2 10 批不同产地毛果鱼藤藤茎 HPLC色谱叠加图
Fig 2 HPLC overlapping chromatograms for ten batches of stems of Derris eriocarpa How
如表 1 所示,10 批毛果鱼藤藤茎与对照指纹图谱的
相似度值均大于 0. 9,显示了其与对照指纹图谱有
良好的相似性,10 批不同产地毛果鱼藤藤茎与对照
图谱叠加图谱如图 2 所示,叠加效果较好。
表 1 毛果鱼藤 HPLC指纹图谱相似度计算结果
Tab 1 Results of similarity analysis on fingerprints for ten batches of stems of Derris eriocarpa How
编号
(serial number)
S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8 S9 S10
对照指纹图谱
(reference fingerprint)
S1 1. 000 0. 940 0. 975 0. 875 0. 948 0. 963 0. 912 0. 910 0. 945 0. 960 0. 971
S2 0. 940 1. 000 0. 944 0. 973 0. 998 0. 950 0. 948 0. 949 0. 997 0. 961 0. 987
S3 0. 975 0. 944 1. 000 0. 853 0. 952 0. 996 0. 923 0. 921 0. 949 0. 990 0. 979
S4 0. 875 0. 973 0. 853 1. 000 0. 968 0. 861 0. 905 0. 908 0. 970 0. 880 0. 935
S5 0. 948 0. 998 0. 952 0. 968 1. 000 0. 957 0. 950 0. 950 0. 998 0. 964 0. 991
S6 0. 963 0. 950 0. 996 0. 861 0. 957 1. 000 0. 927 0. 925 0. 954 0. 993 0. 980
S7 0. 912 0. 948 0. 923 0. 905 0. 950 0. 927 1. 000 0. 999 0. 952 0. 932 0. 967
S8 0. 910 0. 949 0. 921 0. 908 0. 950 0. 925 0. 999 1. 000 0. 952 0. 933 0. 967
S9 0. 945 0. 997 0. 949 0. 970 0. 998 0. 954 0. 952 0. 952 1. 000 0. 963 0. 990
S10 0. 960 0. 961 0. 990 0. 880 0. 964 0. 993 0. 932 0. 933 0. 963 1. 000 0. 984
S对 0. 971 0. 987 0. 979 0. 935 0. 991 0. 980 0. 967 0. 967 0. 990 0. 984 1. 000
2. 6 各极性部位指纹图谱对比及对癌细胞生长抑
制作用的研究
2. 6. 1 各极性部位 HPLC图谱 取 1 号毛果鱼藤藤
茎样品粗粉 50 g(24 目) ,按“2. 2”项下方法进行提
取,提取液浓缩至浸膏,将浸膏依次用石油醚、氯仿、
乙酸乙酯、正丁醇进行萃取,浓缩萃取液,得 4 个部位
的浸膏,称取上述 4个部位的浸膏各 40 mg,分别用 5
mL甲醇溶解,溶液过滤,备用。按照“2. 1”项下方法
进行 HPLC 检测。各部位 HPLC 图谱如图 3 所示。
由于溶剂极性的不同,各部位的 HPLC图谱有明显的
差异,化合物的种类及含量均有区别,且大部分成分
集中在石油醚、氯仿部位;乙酸乙酯部位则显示了 2
个极性相对比较大的峰,而正丁醇部位在此液相条件
下基本没有明显的色谱峰出现。
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图 3 不同部位提取液指纹图谱对比图
Fig 3 Fingerprints of different extraction parts
S1.石油醚(petroleum ether) S2.氯仿(chloroform extracts) S3.乙酸乙酯(ethyl acetate) S4.正丁醇(n - butyl alcohol)
2. 6. 2 各提取部位对肿瘤细胞的生长抑制作
用[17 - 19] 取对数生长期的 NCI - H460 人肺癌细
胞、SW480 人结肠癌细胞、SGC7901 人胃癌细胞、
Hela 人宫颈癌细胞,分别接种在 96 孔板中,于
37 ℃,5%CO2恒温培养箱中培养 12 h,分别加入不
同浓度的毛果鱼藤的石油醚部位(3. 35、1. 675、
0. 837、0. 419、0. 209 mg·mL -1)、氯仿部位(6. 7、
3. 35、1. 675、0. 837、0. 419 mg·mL -1)的供试品溶
液、乙酸乙酯部位(2、1、0. 5、0. 25、0. 125 mg·
mL -1)、正丁醇部位(6. 7、3. 35、1. 675、0. 837、
0. 419 mg·mL -1) ,孵育 44 h后,每孔加 MTT溶液
(5 mg·mL -1)20 μL,继续培养 4 h,弃去上清,每
孔加入 DMSO 150 μL,振摇 5 min,于 630 nm 波长
校准,570 nm 波长处测定吸光度(A,n = 3) ,根据
吸光度计算药物对各种细胞的生长抑制率,计算
公式如下:
抑制率 =[(对照组 -用药组)/对照组]× 100%
利用孙氏综合法(改进寇氏法)计算半数抑制
浓度(IC50)。各部位对不同癌细胞的生长抑制结果
如图 4 所示,毛果鱼藤的石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正
丁醇部位对 NCI - H460 人肺癌细胞、SW480 人结肠
癌细胞、SGC7901 人胃癌细胞、Hela 人宫颈癌细胞
均具有一定的细胞生长抑制作用,并随着药物浓度
的提高,抑制率越高,呈现明显的量效关系,且石油
醚、氯仿部位表现出较强的抗癌活性;各部位对 He-
la人宫颈癌细胞的生长均显示较好的抑制作用,药
物作用 48 h后 IC50值如表 4 所示,氯仿部位对 Hela
人宫颈癌细胞的 IC50值最小,为 0. 09 mg·mL
-1;石
油醚、氯仿、乙酸乙酯提取部位对 SGC7901 人胃癌
细胞、Hela人宫颈癌细胞的抑制作用较好,IC50值均
小于 1. 00 mg·mL -1。
结合图 3、4 及表 2 的结果可知,毛果鱼藤中的
抗癌活性物质大部分集中于石油醚和氯仿部位,且
活性物质极性均较小;而乙酸乙酯和正丁醇部位在
此液相条件下检测出的化合物种类比较少,且含量
也比较低,对癌细胞的生长抑制作用亦不如石油醚
和氯仿部位明显。综上表明,毛果鱼藤藤茎中具有
细胞增殖抑制作用的活性成分多集中在石油醚和氯
仿部位,且抑癌活性比较强。
3 讨论
3. 1 检测波长的确定
按“2. 2”项下方法制备供试品溶液,运用紫外
全波长扫描,证明样品在 250 ~ 350 nm处吸收较强。
HPLC中选用双波长扫描,分别用 254、296 nm 2 个
波长进行扫描,发现样品在 296 nm 处基线平稳,色
谱峰较多,而且分离度较好,本着指纹图谱的确认必
须遵循信息量最大化的原则[11],选用296 nm作为
检测波长。
—6112— 药物分析杂志 Chin J Pharm Anal 2014,34(12)
图 4 MTT法测定毛果鱼藤不同极性部位对癌细胞的生长抑制作用
Fig 4 Growth inhibition activities of different polar parts on the cancer cells
A.石油醚部位(petroleum ether extracts) B.氯仿部位(chloroform extracts) C.乙酸乙酯部位(ethyl acetate extracts) D.正丁醇部位(n - butyl
alcohol extracts)
表 2 毛果鱼藤不同极性部位作用不同癌细胞的 IC50值
Tab 2 IC50 of different polar parts on the cancer cells
提取部位
(extraction parts)
IC50 /(mg·mL -1)
NCI - H460 SW480 SGC 7901 Hela
石油醚
(petroleum ether)
1. 44 1. 14 0. 89 0. 27
氯仿
(chloroform)
1. 75 2. 87 0. 57 0. 09
乙酸乙酯
(ethyl acetate)
1. 61 1. 41 0. 76 0. 46
正丁醇
(n - butyl alcohol)
4. 22 3. 55 2. 34 1. 35
3. 2 流动相条件的确定
在色谱分离过程中考察了甲醇 -水、乙腈 -水、
甲醇 - 0. 5%醋酸水溶液、乙腈 - 0. 5%醋酸水溶液
等系统作为流动相,结果显示乙腈 - 0. 5%醋酸水溶
液作为流动相,分离效果较好,峰形对称,基线稳定,
而其他 3 个流动相系统分离效果不理想,有几个关
键峰不能很好地分开,最终选择流动相为乙腈(A)
- 0. 5%醋酸溶液(B) ,梯度洗脱(0 ~ 20 min,40%
A→60% A;20 ~ 30 min,60% A;30 ~ 45 min,60%
A→80%A;45 ~ 60 min,80%A)。
4 结论
本实验建立了壮药毛果鱼藤药材的高效液相色
谱指纹图谱,为毛果鱼藤药材的质量控制提供参考;
通过对 10 批毛果鱼藤药材进行高效液相色谱指纹
图谱检测可以看出:不同产地毛果鱼藤药材各色谱
峰的相对保留时间基本一致,所含成分基本相同,符
合指纹图谱的要求;天然产物因产地、生长环境和生
长年限不同,各成分含量有一定的差异,在本图谱中
也可看出各色谱峰相对峰面积有较大差异,说明有
效成分的含量有较大差别;在此基础上,如果进一步
开展谱效学研究,可使中药质量与其药效真正结合
起来,有助于阐明中药作用机理。目前,毛果鱼藤尚
—7112—药物分析杂志 Chin J Pharm Anal 2014,34(12)
处在民间壮医用药阶段,对壮药毛果鱼藤的生物活
性的研究比较少,而对毛果鱼藤抗癌作用的研究目
前国内外尚未见报道。本文对毛果鱼藤的抗癌活性
进行了研究,结果表明,毛果鱼藤石油醚、氯仿、乙酸
乙酯部位具有较好的抗癌活性,提示该部位具有抗
癌活性的成分。
参考文献
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(本文于 2014 年 3 月 13 日收到)
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