全 文 ：甲素诱导食管癌细胞凋亡过程中起拮抗作用。Sur-
vivin在调控食管癌细胞方面的重要作用为肿瘤治
疗提供了一个新的靶点。
参 考 文 献
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收稿日期:2012-12-09
基金项目:广东省教育部产学研结合项目(2010B090400511)
作者简介:曹维(1960-) ，男，硕士，教授，主要从事新药开发研究;E-mail:drugdc@ 126． com。
* 通讯作者:文洁，E-mail:drugdc @ 126． com。
河源引种互叶白千层精油抗菌实验研究
曹 维，朱建梅，俞励平，文 洁*
(中山大学药物开发中心，广东 广州 510080)
摘要 目的:对广东河源引种的互叶白千层精油成分进行分析及抗菌作用研究。方法:采用气相色谱法测定
河源互叶白千层精油成分;以微量稀释法测定互叶白千层精油对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、白色念珠
菌、烟曲霉的 MIC和 MBC值，以及对中和剂和影响因素研究，并采用家兔皮肤刺激性试验进行评价。结果:河源互
叶白千层精油主要化学成分含量符合国家标准;对试验菌的 MIC、MBC在 0. 39% ～ 1. 56%范围;对大肠杆菌、绿脓
杆菌、白色念珠菌、烟曲霉杀灭率均为 100%，对金黄色葡萄球菌作用 10 min 杀灭率为 100%;25%以上小牛血清、
pH值改变以及温度改变对互叶白千层精油杀灭试验菌均无影响;对家兔完整皮肤无刺激性。结论:河源互叶白千
层精油品质优良，对常见细菌有较好的抑制和杀灭作用，对皮肤无明显刺激性。
关键词 互叶白千层精油(TTO) ;最小抑菌浓度(MIC) ;杀菌作用(MBC)
中图分类号:Ｒ285. 5 文献标识码:A 文章编号:1001-4454(2013)06-0988-04
互叶白千层 Melaleuca alternifolia (Maiden et
Betche)Cheel为桃金娘科白千层属植物的小乔木，
原产于澳大利亚新南威尔士沿海一带，民间常用来
抗感染，消炎以及治疗腹泻和外伤。从互叶白千层
的新鲜枝叶中提取得到的互叶白千层精油(Tea
Tree Oil，TTO) ，属白千层萜品型香料油，主要成分
为松烯类碳氢化合物，溶于 85%乙醇，不溶于水。
互叶白千层精油(TTO)具有广谱抗菌、抗真菌、抗病
毒和抗炎活性，近年来广泛应用于皮肤外用制剂、
消毒剂及化妆品中香料、渗透促成剂和防腐剂的制
备。目前已实施 QB /T“互叶白千层(精)油，4-松油
烯醇型［茶树(精)油］”的行业标准、GB /T“互叶白
千层(精)油，4-松油烯醇型［茶树(精)油］”的国家
标准以及食品安全国家标准食品添加剂使用标准
GB 2760-2011。在世界各地多有引种，我国广西、广
东、海南等地也有大规模的栽培。本研究对广东河
源产的互叶白千层精油进行了化学成分分析及抗
菌活性研究，为深度开发互叶白千层精油系列产品
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DOI:10.13863/j.issn1001-4454.2013.06.007
提供科学依据。
1 材料和仪器
1. 1 菌株 金黄色葡萄球菌 Staphyloccocus aureus
(ATCC25903)、大肠杆菌 Escherichia coli(ATCC25922)、
绿脓杆菌 Pseudomonas aeruginosa(ATCC27853)、白
色念珠菌 Candida albicans(ATCC103231)、烟曲霉
Aspergillus funigatus(ATCC43504)取自中山大学附
属第一医院微生物室。
1. 2 药物与试剂 互叶白千层精油购自广东河源
富阳生物科技有限公司，批号:20110306，规格:
1 000 mL /瓶。取互叶白千层精油与吐温-80 混匀，
加入乙醇配制成 2. 5%互叶白千层精油溶液。4-松
油烯醇(terpinen-4-ol) ，含量≥98. 5%，美国 Sigma-
Aldich Fluka公司(Lot:86477) ;PBS 缓冲液;无水乙
醇、95%乙醇、甘氨酸均为分析纯;小牛血清、大豆卵
磷脂、沙氏琼脂、MH2-D琼脂均为生化试剂。
1. 3 主要仪器 7694E 顶空进样器、7890A 气相色
谱仪(美国安捷伦公司) ;CO2 培养箱 (Thermo Elec-
tron Corporation) ;SPX智能生化培养箱(常州翔天实
验仪器厂) ;PL303型电子天平(Mettler Toledo公司) ;
普通培养箱高压蒸气灭菌锅(上海安亭科学仪器厂)。
2 方法
2. 1 互叶白千层精油组分含量测定〔1，2〕
2. 1. 1 气相色谱测试条件:Agilent HP-5MS 石英毛
细管色谱柱，30 m × 0. 25 mm × 0. 25 μm;柱温:40 ～
240 ℃。50 ℃恒温 1 min，然后线性程序升温从 50 ℃
升至 250 ℃，速率 10 ℃ /min，升至 250 ℃恒温 9 min。
进样口温度 200 ℃;氢焰离子化检测器(FID)温度
300 ℃;载气为高纯度 N2，分流比 50 ∶ 1;进样量 1 μL。
2. 1. 2 互叶白千层精油含量测定:取互叶白千层
精油配制成 1%乙醇溶液，直接进样，面积归一法测
定特征组分含量。
2. 2 互叶白千层精油的杀菌试验〔3-5〕
2. 2. 1 菌液的制备:取培养 18 ～ 24 h 的金黄色葡
萄球菌(ATCC25903)、大肠杆菌(ATCC25922)、绿
脓杆菌(ATCC27853)、白色念珠菌(ATCC103231)、
烟曲霉(ATCC43504)菌落，采用直接菌落悬液配制
法，制备成符合实验要求的菌悬液。
2. 2. 2 最小抑菌浓度(MIC)测定:采用微量稀释
法，用 EP管对比稀释，将互叶白千层精油稀释 8 个
浓度，各管浓度依次为 50%、25%、12. 5%、6. 25%、
3. 13%、1. 56%、0. 78%、0. 39%、0. 20%、0. 10%，加
入 96 孔板中，每孔 50 μL。将稀释好的菌液(106
CFU /mL)加入已有互叶白千层精油的孔中，每孔 50
μL，盖好，置 35 ℃中培养 24 h。以肉眼观察，药物
最低浓度管无细菌生长者，即为受试菌的 MIC。
2. 2. 3 杀菌作用(MBC)测定:从已观察 MIC 结果
的微孔板上吸取 0. 1 mL 培养液，金葡球菌、大肠杆
菌、绿脓杆菌接种于 MH 琼脂 35 ℃培养 48 h;白色
念珠菌、烟曲霉接种于沙氏琼脂 35 ℃培养 72 h;结
果以无菌生长的最低浓度为受试菌的 MBC。
2. 2. 4 中和剂选择试验:中和剂 2% 吐温-80 +
0. 5%卵磷脂 + 1%甘氨酸 + PBS(0. 03 mol /L) ，抗
菌作用时间 5 min，中和作用时间 10 min，试验温度
19 ～ 21 ℃。实验重复 3 次。以金黄色葡萄球菌、白
色念珠菌作为试验菌株，按悬液定量杀菌试验设 4
组，分别为① 中和剂 +菌悬液→培养②(消毒剂 +
中和剂)+菌液→培养③稀释液 +菌悬液→培养④
稀释液 +中和剂 +培养基→培养。判定标准:第 1、
2 和 3 组有相似量试验菌生长;悬液试验作用体系
中菌量在 50 ～ 300 cfu /mL之间;其组间菌落数误差
率应不超过 15%;第 4 组无菌生长;表明所选中和
剂及其浓度适宜。
2. 2. 5 悬液定量杀菌试验:在无菌试管内加入 1
mL试验菌悬液与 4 mL 互叶白千层精油溶液，混
匀，恒温至(20 ± 1)℃，作用 5、10、20 min，取 0. 5
mL样液加入到 4. 5 mL 中和剂试管内混匀，中和作
用 10 min。分别吸取 1. 0 mL样液，按活菌培养计数
方法测定存活菌数。如平板上生长的菌落数较多
时，可进行系列 10 倍稀释后，再进行活菌培养计数。
同时用稀释液代替消毒液，进行平行试验，作为阳
性对照。计算杀灭率。
2. 2. 6 影响因素试验:以金黄色葡萄球菌、大肠杆
菌、白色念珠菌作为试验菌株，采用悬液定量杀菌
试验方法，考察有机物、温度和 pH 值对互叶白千层
精油溶液杀菌效果的影响。见表 1。
表 1 影响因素试验设计表
影响因素 有机物 /% 温度 / ℃ pH值
1 25 10 ± 1 4. 8
2 50 20 ± 1 6. 8
3 － 30 ± 1 8. 8
2. 2. 7 皮肤刺激试验:家兔 8 只，给药前 24 h将家
兔背部脊柱两侧毛剪去，不得损伤皮肤。面积约
3 cm ×3 cm。随机分为 2 组，每组 4 只。试验时将
其去毛区的皮肤以消毒针头划成小“井”形至渗血
作为破损皮肤组，另一组为完好皮肤组。破损皮肤
组在左侧给互叶白千层精油溶液 1. 0 mL /只，右侧
给空白辅形剂 1. 0 mL /只对照，用无刺激的胶布固
定，保持药物与皮肤接触 4 h，然后以温水洗去残留
药物。给药 1 次 /d。连续给药 7 d。完好皮肤组以
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同样方法给药。最后一次去除药物后 1、24、48、72 h
观察并记录被贴位有无红斑和水肿，对红斑与水肿
程度评分(评分标准见表 2、3)。评价互叶白千层精
油溶液多次给药对完整与破损皮肤的刺激强度、刺
激反应的恢复情况和时间，并与对照组进行比较。
表 2 皮肤刺激性反应评分标准
刺激反应 分值
红斑:无红斑 0
勉强可见 1
明显可见 2
中度到严重红斑 3
紫红色红斑并有焦痂形成 4
水肿:无水肿 0
勉强可见 1
可见(边缘高出周围皮肤) 2
皮肤隆起约 1mm，轮廓清楚 3
水肿隆起 1mm以上并范围扩大 4
总分 8
表 3 皮肤刺激性反应强度评价
强度 分值
无刺激性 0. 0 ～ 0. 49
轻度刺激性 0. 5 ～ 2. 99
中度刺激性 3. 0 ～ 5. 99
强度刺激性 6. 0 ～ 8. 0
3 结果
3. 1 互叶白千层精油特征组分含量 互叶白千层
精油特征组分含量符合国家标准，茶树(精)油典型
气相色谱图(面积归一化法)结果见图 1、表 4。
表 4 互叶白千层精油特征性组分含量
特征组分 含量 /%
1，8-桉叶素 3. 61
4-松油烯醇 35. 33
3. 2 互叶白千层精油对 5 种细菌 MIC和 MBC值
互叶白千层精油对 5 种菌均有较好的作用，MIC 和
MBC均在 0. 39% ～1. 56%。见表 5。
表 5 互叶白千层精油对 5 种细菌MIC和
MBC值(x ± s，n =3，20 ℃)
细菌 MIC /% MBC /%
大肠杆菌(ATCC25922) 0. 39 0. 39
绿脓杆菌(ATCC27853) 0. 78 1. 56
金黄色葡萄球菌(ATCC25903) 1. 56 1. 56
白色念珠菌(ATCC103231) 0. 39 0. 39
烟曲霉(ATCC43504) 0. 39 0. 78
3. 3 中和剂试验结果 该中和剂能有效中和互叶
白千层精油溶液对试验菌残留作用。见表 6。
表 6 中和剂鉴定试验结果(x ± s，n =3，20 ℃)
组别
不同试验菌菌数(cfu /mL)
金黄色
葡萄球菌
白色
念珠菌
中和剂 +菌悬液 130 17
消毒剂 +中和剂 +菌液 145 21
稀释液 +菌悬液 195 18
稀释液 +中和剂 +培养基 0 0
图 1 互叶白千层精油典型气相色谱图
A. 1，8-桉叶素 B. 4-松油烯醇
3. 4 互叶白千层精油溶液的杀菌效果 互叶白千
层精油溶液对 5 种试验菌的平均杀灭率基本上达到
90%以上。见表 7。
3. 5 影响因素结果 有机物、温度、pH 值对于互
叶白千层精油杀菌效果无明显影响。菌悬液加入
25%、50%小牛血清，对大肠杆菌、白色念珠菌的杀
灭率均为 100%;试验温度 1(0 ± 1)、(20 ± 1)、
(30 ± 1)℃或 pH值范围在 4. 8 ～ 8. 8，对大肠杆菌、
白色念珠菌杀灭率均达到 99. 9%以上。
3. 6 刺激试验结果 结果如表 8、9 所示，与对照
组比较，互叶白千层精油组家兔完整皮肤多次给药
刺激指数无明显刺激，破损皮肤多次给药 1 ～ 72 h
累积均值 0. 75，刺激指数有轻度刺激。
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表 7 互叶白千层精油溶液杀菌试验结果(x ± s，n =3，20 ℃)
菌种名
阳性对照菌数 /
(cfu /mL)
杀灭率 /%
5 min 10 min 20 min
大肠杆菌 1120000 100 100 100
金黄色葡萄球菌 1500000 87. 5 100 100
白色念珠菌 107000 100 100 100
绿脓杆菌 1320000 100 100 100
烟曲霉 1780000 100 100 100
表 8 互叶白千层精油溶液多次用药对新西兰兔完整皮肤刺激性反应(n =4)
时间
完整皮肤
1h 24h 48h 72h
完整皮肤组对照
1h 24h 48h 72h
红斑 0 0 0 0 0 0 0 0
水肿 0 0 0 0 0 0 0 0
平均分 0 0 0 0 0 0 0 0
表 9 互叶白千层精油溶液多次用药对新西兰兔破损皮肤刺激性反应(n =4)
时间
破损皮肤
1h 24h 48h 72h
完整皮肤组对照
1h 24h 48h 72h
红斑 0. 5 0. 25 0 0 0 0 0 0
水肿 0 0 0 0 0 0 0 0
平均分 0. 5 0. 25 0 0 0 0 0 0
4 讨论
互叶白千层精油(TTO)抵抗微生物的能力及其
明显的渗透能力和相对较低的皮肤过敏性，使其成
为一种安全、有效的天然广谱杀菌剂。TTO 对常见
的皮肤感染金黄色葡萄球菌、微球菌、粪肠球菌和
铜绿假单胞菌的 MIC都不超过 2%〔6〕。本研究亦证
实河源互叶白千层精油对试验中细菌真菌有很强的
抗菌活性，对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、
白色念珠菌、烟曲霉 MIC 和 MBC 均≤2%，互叶白千
层精油的杀灭率达到 100%，而且有机物、温度和 PH
值对其无影响，这与国外文献报道的结论相似〔7〕。
GB /T国家标准规定产互叶白千层互叶白千层
精油中 4-松油醇含量应在≥30%，1. 8 桉叶油素≤
5%，本试验所用互叶白千层精油是从广东河源地区
引种的澳大利亚茶树中蒸馏得的，其中 4-松油醇含
量约为 35%，1. 8 桉叶油素为 3. 5%，达到了国家标
准要求。目前认为，4-松油醇是 TTO 的主要刺激成
分，而 TTO的多种成分对过敏也具有协同作用，但
局部应用 TTO安全且副作用轻微。对 100%的互叶
白千层精油，被试验者中出现皮肤刺激过敏的比例
在 3. 4%以下，而对低于 2. 5%的互叶白千层精油几
乎无人过敏〔8〕。1. 1%的人群对 5% TTO 呈阳性反
应〔9〕。本研究皮肤刺激性试验亦显示，互叶白千层
精油溶液对家兔完整皮肤多次给药无明显刺激，仅
对家兔破损皮肤多次给药有轻度刺激，可作为一种
安全性较好的外用制剂开发。
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