全 文 ：收稿日期:2015-07-28
基金项目:广东省中山市科技计划项目(2014A2FC245);广东省中山市科技计划项目(20132A162)
作者简介:苏丹(1977-)，男，博士，讲师，研究方向:中药开发与研究;E-mail:sdsky@ 163. com。
* 通讯作者:高玉桥，E-mail:aqiaosky@ 163. com。
高速逆流色谱法分离制备山芝麻中的三萜类成分
苏 丹1，高玉桥2* ，梁耀光3，张天佑3，梅全喜2
(1. 电子科技大学中山学院化学与生物工程学院，广东 中山 528402;2. 广州中医药大学附属中山医院，广
东 中山 5284013;3. 中山市优诺生物科技发展有限公司，广东 中山 528427)
摘要 目的:建立高速逆流色谱(HSCCC)法分离制备山芝麻中三萜类成分的方法。方法:山芝麻乙酸乙酯萃
取部位采用二步分离法进行 HSCCC分离;所得各组分用质谱与核磁共振波谱法进行结构鉴定，并用红外光谱法进
行表征分析。结果:从山芝麻乙酸乙酯萃取部位分离制备得到 6 个化合物，各化合物经鉴定为:山芝麻宁酸甲酯
(1)、山芝麻酸甲酯(2)、山芝麻宁酸(3)、山芝麻酸(4)、白桦脂酸(5)、齐墩果酸(6)。6 个化合物进行 HPLC分析，
质量分数均大于 95. 0%。结论:HSCCC适用于分离制备山芝麻中的三萜类成分，方法快速，可以实现产品高纯度
和高得率的制备。
关键词 高速逆流色谱;山芝麻;三萜
中图分类号:Ｒ284. 1 /Ｒ284. 2 文献标识码:A 文章编号:1001-4454(2016)05-1053-04
DOI:10. 13863 / j. issn1001-4454. 2016. 05. 025
Study on Triterpenoids from Helicteres angustifolia by High-Speed Countercurrent Chromatography
SU Dan1，GAO Yu-qiao2，LIANG Yao-guang3，ZHANG Tian-you3，MEI Quan-xi2
(1. College of Chemistry ＆ Biology，Zhongshan Institute，University of Electronic Science and Technology，Zhongshan 528402，China;
2. Zhongshan Hospital，Guangzhou University of Chinese Medicine，Zhongshan 528401，China;3. UNO Scientific Co. ，Ltd，Zhongshan
528427，China)
Abstract Objective:To develop a method for separation and purification of triterpenoids from Helicteres angustifolia by high-
speed countercurrent chromatography(HSCCC). Methods:The ethyl acetate extract of Helicteres angustifolia were separated by two-step
HSCCC. The structures of the target compounds were identified by ESI-MS and 1H-NMＲ and characterized by FTIＲ. Ｒesults:Six com-
pounds were isolated and prepared from ethyl acetate extract of Helicteres angustifolia，and identified as methyl helicterilate(1)，methyl
helicterate(2) ，helicterilic acid(3) ，helicteric acid(4) ，betulic acid(5) ，oleanolic acid(6). The purity of the chemical constituents
were determined by HPLC，and the mass fraction was more than 95. 0%，respectively. Conclusion:This method is suitable for the sepa-
ration and preparation of triterpenoids from Helicteres angustifolia，which is rapid，high purity and high yield.
Key words High-speed countercurrent chromatography(HSCCC) ;Helicteres angustifolia L. ;Triterpenoids
山芝麻系梧桐科山芝麻属植物山芝麻 Helicteres
angustifolia L. 的干燥根，是民间常用的中草药。其
具有解表清热、解毒消肿的作用，可用于治疗感冒发
热、痄腮、乳娥、麻疹、咳嗽、泄泻痢疾、痈肿等〔1〕。
山芝麻是广东凉茶(原王老吉凉茶)的主要药料，也
是多种中成药制剂如莲芝消炎片的主要原料。研究
表明，山芝麻的三萜类成分具有抗炎镇痛、抗菌、抗
病毒、抗肿瘤等活性〔1-3〕。因此，分离和制备山芝麻
药材中的有效成分，可以为对其开展进一步的深入
研究提供物质基础。
高速逆流色谱(High-Speed Countercurrent Chro-
matography，HSCCC)是 Yoichiro Ito 博士于二十世纪
八十年代首先研发、应用并发展起来的一种新型液-
液分配色谱技术;HSCCC运用同步多层螺旋管进行
行星式离心运动，使得在互不相溶的两相溶剂系统
中可以实现样品在短时间内的高效分离，从而制备
样品〔4，5〕。高速逆流色谱技术不需要固体支撑物，
主要根据样品在两相中所具有的不同分配系数进而
对样品进行分离，相对于其他色谱技术如高效液相
色谱、柱色谱等来说，具有高回收率、无吸附损耗、无
峰拖尾等优点。本研究首次采用 HSCCC 方法从山
芝麻中分离制备出山芝麻酸、山芝麻酸甲酯、山芝麻
宁酸、山芝麻宁酸甲酯、白桦酯酸和齐墩果酸 6 个三
萜类化合物。
1 仪器与材料
HSCCC EMC-500A逆流色谱仪(北京艾美林科
技有限公司);HD-3000 型紫外检测器(上海嘉鹏科
技有限公司);N2000 型色谱工作站(浙江大学);
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LC-10A高压输液泵(日本岛津公司);X-4 数字显示
显微熔点测定仪(温试计未校正，北京泰克仪器有
限公司);LC-20 型高效液相色谱仪(日本岛津公
司);ESI-MS 质谱仪(美国 Finnigan 公司);Bruker
AV-300 MHz 核磁共振仪(德国 Bruker公司);Avatar
330 红外光谱仪(FTIＲ)(美国 Thermo公司)。
白桦脂酸(批号:111802-201402)、齐墩果酸(批
号:110709-201206)均购自中国食品药品检定研究
院。实验用山芝麻采自广东省中山市，经中山市中
医院曾聪彦主任中药师鉴定为梧桐科山芝麻属植物
山芝麻 Heliicters angustifolia L. 的干燥根。
2 方法与结果
2. 1 山芝麻三萜类粗提物的制备 取山芝麻干燥
根 5 kg，粉碎后，过 40 目筛。将粉碎后的干燥山芝
麻粗粉用 95%乙醇在 70 ～ 80 ℃水浴中进行回流提
取 3 次，每次 2 h，合并 3 次提取滤液，减压回收溶
剂，得提取物浸膏。将提取物浸膏用水混悬，以乙酸
乙酯萃取，共萃取 3 次，合并 3 次萃取液，减压回收
溶剂，得乙酸乙酯部位浸膏。取乙酸乙酯部位浸膏
使用 Sephadex LH-20 凝胶柱，以齐墩果酸为对照，
富集得到山芝麻三萜类成分粗提物。
2. 2 HSCCC溶剂体系 依据文献〔6，7〕研究，根据目
标化合物的性质，确定试验的溶剂体系。按表 1 中
各试验溶剂体系比例分别往分液漏斗中加入溶剂共
20 mL，上下充分振摇，静置后分液，称取山芝麻三
萜类粗提物约 2 mg置于具塞试管中，分别精确取上
相、下相溶液各 2 mL溶解样品，充分震荡溶解，待两
相平衡后，分别精确量取上相、下两相溶液各 1 mL，
挥干，再用 0. 6 mL 甲醇溶解，进行 HPLC 分析。计
算不同溶剂系统中，目标化合物的分配系数 K 值(K
=目标化合物在上相溶液中的浓度 /目标化合物在
下相溶液中的浓度)，见表 1。
表 1 山芝麻三萜类化合物在不同溶剂系统中的分配系数
溶剂系统
K值
化合物 1 化合物 2 化合物 3 化合物 4 化合物 5 化合物 6
正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(9∶ 1∶ 5∶ 5) 0. 44 0. 32 1. 11 1. 07 1. 67 1. 15
正己烷-甲醇-水(10∶ 5∶ 5) 0. 65 0. 72 2. 33 2. 02 3. 22 2. 21
正己烷-乙酸乙酯-甲醇(9∶ 1∶ 8) 1. 22 1. 06 4. 55 3. 82 5. 04 4. 92
正己烷-乙酸乙酯-乙腈(9∶ 1∶ 8) 1. 41 1. 36 2. 33 1. 48 2. 10 1. 96
正己烷-乙酸乙酯-乙腈(9∶ 1∶ 6) 0. 93 0. 67 1. 93 1. 44 2. 16 2. 05
正己烷-乙酸乙酯-乙腈(9∶ 1∶ 4) 0. 80 0. 70 1. 12 0. 99 1. 98 1. 28
本研究在文献〔6，7〕的基础上，参考了多个溶剂
体系，在单一体系中，运用 HSCCC 方法同时实现山
芝麻多个三萜类成分的分离非常困难。因此，本实
验采用了二步分离的方法，并最终筛选出正己烷-乙
酸乙酯-甲醇-水(9∶ 1 ∶ 5 ∶ 5)、正己烷-乙酸乙酯-乙腈
(9∶ 1∶ 8)和正己烷-乙酸乙酯-乙腈(9∶ 1∶ 6)作为第 1
步和第 2 步(组分Ⅱ、Ⅲ)分离的溶剂系统，各组分
均可以实现基线分离。
2. 3 HSCCC分离制备过程
2. 3. 1 第 1 步分离:将选定的溶剂体系正己烷-乙
酸乙酯-甲醇-水(9∶ 1∶ 5∶ 5)在分液漏斗中充分摇匀，
静置分层，分别将上下两相超声脱气 15 min，上相为
固定相，下相为流动相。将山芝麻三萜类粗提物
104. 0 mg用 20 mL流动相溶解，用 0. 45 μm微孔滤
膜过滤。先将固定相泵入 HSCCC，流速 10 mL /min，
聚四氟乙烯线圈内充满固定相后，开动旋转，调转速
至 800 r /min;再将流动相泵入 HSCCC，流速为 4. 0
mL /min，至流出流动相，上下相达到平衡后，将 20
mL样品溶液注入 HSCCC，柱体积为 125 mL。色谱
条件为:转速:800 r /min，流速:1. 0 mL /min，波长:
220 nm，固定相保留值:0. 72。分别得到组分Ⅰ(化
合物 5)4. 6 mg、组分Ⅱ(混合物，化合物 3、4、6)
38. 7 mg、组分Ⅲ(混合物，化合物 1、2)50. 3 mg，见
图 1-A。
2. 3. 2 第 2 步分离:将选定的溶剂体系正己烷-乙
酸乙酯-乙腈(9∶ 1∶ 8)和正己烷-乙酸乙酯-乙腈(9∶ 1
∶ 6)在分液漏斗中充分摇匀，静置分层，分别将上下
两相超声脱气 15 min，上相为固定相，下相为流动
相。分别将组分Ⅱ30. 0 mg 用 20 mL 流动相溶解，
组分Ⅲ 50. 3 mg 用 40 mL 流动相溶解，以 0. 45 μm
微孔滤膜过滤。参照“2. 3. 1”项下步骤进行 HSCCC
分离制备。色谱条件分别为:组分Ⅱ:转速:820 ～
830 r /min;流速:1. 0 mL /min;波长:220 nm;固定相
保留值:0. 75。组分Ⅲ:转速:850 r /min;流速:1. 4
mL /min;波长:220 nm;固定相保留值:0. 86。得到
组分Ⅰ(化合物 1)26. 8 mg、Ⅱ(化合物 2)25. 1
mg、Ⅰ″(化合物 3)12. 1 mg、Ⅱ″(化合物 6)3. 3 mg、
Ⅲ″(化合物 4)12. 3 mg，见图 1-B、C。
2. 4 HPLC 检测分析 所得各组分经 HPLC 检测
后，减压回收溶剂后，真空干燥得到粉末。取各组分
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粉末分别加流动相溶解后进行 HPLC 分析，并采用
峰面积归一化法计算其质量分数，质量分数均达到
95. 0%以上。分离制备的各化合物 HPLC 色谱见图
2。色谱条件:Waters Symmetry-C18柱(250 mm × 4. 6
mm，5 μm);流动相为乙腈-水(82∶ 18);流速为 1. 5
mL /min;检测波长为 230 nm;柱温为 35 ℃;进样量
为 25 μL。
图 1 山芝麻三萜类粗提物的 HSCCC分离色谱图
A. 为第一步分离色谱图 B、C. 为第二步分离色谱图
注:罗马数字标记为 HSCCC各分离组分;阿拉伯数字标记为各化合物
图 2 山芝麻三萜类粗提物与 6 个化合物的 HPLC色谱图
3 结构鉴定
化合物 1:无色针晶。ESI-MS m/z:632［M +
H］+。1H-NMＲ(300 MHz，CDCl3)δ:7. 98(2H，d，J =
7. 5 Hz，H-2，6)，7. 57(1H，td，J = 7. 2 Hz，H-4) ，
7. 45(2H，m，J = 7. 6 Hz，H-3，5) ，5. 66、4. 45(1H，
t，d，J = 3. 1 Hz，H-12) ，4. 24(1H，d，J = 12. 9 Hz，H-
27) ，4. 38(1H，br s，J = 8. 4 Hz，H-3α) ，3. 65(3H，s，
17-COOCH3)，2. 94(1H，dd，J = 4. 1，4. 5 Hz，H-18) ，
2. 01(3H，s，3-OCOCH3)，0. 94(3H，s，H-25) ，0. 88
(3H，s，H-30) ，0. 83(3H，s，H-24) ，0. 83(3H，s，H-
29) ，0. 76(3H，s，H-23) ，0. 75(3H，s，H-26)。以上
数据与文献〔8〕报道对照基本一致，故鉴定该化合物
为山芝麻宁酸甲酯。
化合物 2:无色针晶。ESI-MS m/z:632［M +
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H］+。1H-NMＲ(300 MHz，CDCl3)δ:8. 02(2H，d，J =
7. 5 Hz，H-2，6)，7. 57(1H，td，J = 7. 5，1. 8 Hz，H-
4) ，7. 47(2H，m，J = 7. 5 Hz，H-3，5) ，4. 76、4. 63
(each 1H，J = 7. 4，5. 6 Hz，H-29) ，4. 76 ～ 4. 54(2H，
dd，J = 12. 9，7. 4 Hz，H-27) ，4. 45(1H，dd，J = 10. 6，
5. 0 Hz，H-3α) ，3. 67(3H，s，17-COOCH3)，2. 90 ～
3. 08(1H，m，H-19) ，2. 02(3H，s，3-OCOCH3)，1. 71
(3H，s，H-30) ，1. 01(3H，s，H-24) ，0. 90(3H，s，H-
25) ，0. 79(3H，s，H-26) ，0. 79(3H，s，H-23)。以上
数据与文献〔9〕报道对照基本一致，故鉴定该化合物
为山芝麻酸甲酯。
化合物 3:无色针晶。ESI-MS m/z:618［M +
H］+。1H-NMＲ(300 MHz，CDCl3)δ:7. 99(2H，d，J =
7. 6 Hz，H-2，6)，7. 59(1H，td，J = 7. 5 Hz，H-4) ，
7. 46(2H，m，J = 7. 2 Hz，H-3，5) ，5. 67、4. 46(1H，
t，d，J = 3. 0 Hz，H-12) ，4. 40(1H，br s，J = 8. 6 Hz，H-
3α) ，4. 26(1H，d，J = 12. 8 Hz，H-27) ，2. 95(1H，dd，
J = 4. 0，4. 6 Hz，H-18) ，2. 03(3H，s，3-OCOCH3)，
0. 95(3H，s，H-25) ，0. 89(3H，s，H-30) ，0. 85(3H，s，
H-24) ，0. 85(3H，s，H-29) ，0. 77(3H，s，H-23) ，0. 76
(3H，s，H-26)。以上数据与文献〔10〕报道对照基本
一致，故鉴定该化合物为山芝麻宁酸。
化合物 4:无色针晶。ESI-MS m/z:618［M +
H］+。1H-NMＲ(300 MHz，CDCl3)δ:8. 02(2H，d，J =
7. 5 Hz，H-2，6)，7. 47(3H，m，H-3 ～ 5) ，4. 77、
4. 64(each 1H，s，H-29) ，4. 78 ～ 4. 56(2H，m，H-
27) ，4. 44(1H，dd，J = 10. 8，5. 2 Hz，H-3α) ，3. 00 ～
3. 10(1H，m，H-19) ，2. 00(3H，s，3-OCOCH3)，1. 72
(3H，s，H-30) ，1. 03(3H，s，H-24) ，0. 91(3H，s，H-
25) ，0. 83(3H，s，H-26) ，0. 78(3H，s，H-23)。以上
数据与文献〔9〕报道对照基本一致，故鉴定该化合物
为山芝麻酸。
化合物 5、6 分别与白桦脂酸、齐墩果酸对照品
进行红外光谱比对，相似度在 99. 8%以上，故鉴定
化合物 5、6 分别为白桦脂酸和齐墩果酸。
4 讨论
因目标化合物为三萜类化合物，根据文献，本实
验分别对溶剂系统:正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水、正己
烷-甲醇-水、正己烷-乙酸乙酯-甲醇、正己烷-乙酸乙
酯-乙腈等多个体系进行了筛选。HSCCC 两相溶剂
系统选择应符合以下原则:溶剂不应造成样品的分
解和变性;逆流色谱的最合适 K 值范围是 0. 5 ～
2. 5;上下两相体积比例在 1∶ 1 ～ 1. 5;采用挥发性溶
剂系统，易于化合物纯化。在主要参考的不同溶剂
系统中，两相溶液的平衡时间以及目标化合物在上
相、下相中的分配系数情况可见表 1 所示。正己烷-
乙酸乙酯-甲醇-水四元体系中的化合物 1(山芝麻宁
酸甲酯)和化合物 2(山芝麻酸甲酯)K 值十分接近，
在此体系中进行了多次溶剂比例的改变都不能达到
理想的分离效果。因此，本实验采用了二步分离的
方法，并选用了极性较低的正己烷-乙酸乙酯-乙腈
三元体系作为第二步分离的溶剂体系，得到了较好
地分离效果
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