全 文 ：少、 然z命 物研丫乙` : } l屯发
N八 1飞1飞更 A P l L之 ) t) t t{C l l之七S E 入 R C } 1 A ND I) \ L产E L〔 ) P M贬 N飞 丫 田 l 幼 入 u
亮叶杨桐黄酮提取物抗瘤活性
及其对小鼠 P5 3基因表达活性的影响
陈 粤 佘纲哲 陈鸿霖
(l ?力头大学生物学系 汕头 5 } 5 0 6 ) 3
摘 要 本文从亮叶杨铜中分离提取 出芳酮类月_ 物活性物质 , 并进行小鼠体内抗帅姗试
验和小鼠 s 一 1 8 O JI,! ,瘤细胞 ` ! , p 5 3 J.仁I天}表达抑制实验 。 研究结果表明 ,亮 {l ! 仁约桐 , 1`曾、 办丫内1」
含 员达 2 8 . `写 , 战酮提取物丫f 齐d f改 5 0 0 m g · k g一 ` 时 月 小以肉瘤 s 一 } 8 0 1’l勺抑 潇留率为
6 4
.
0%
, 对艾氏腹水癌 ( E A c ) l 小鼠的 ’ ! 命延民率为 5 1 . 2% , 有 显著的抗肿瘤作川 , 月 ! }
药效 与)门药址子j 关 。 同时发现 , 黄酮类提取物的抗 .jl1, 瘤活性优十化疗药物 1扫南氟尿嚓哎
( F r o r a f : , r ) R T
一
p C R 实验结果表明 ,在齐,!断卜5 0 o n l g · k g一 ’ }l寸, 黄酮类提取物 : l歹以明 {.达抑 , lj!』
小鼠 S 一 18 0 !J中亨衍细 J包中突变代坚p 5 3 )去I夫}{J 转录全舌性 , 其抑制程度和 11夫! I南乡反尿 l帐喧卞11同 。
关键词 亮 J于1·杨桐 , 黄酮类提取物 , 杭 J}, },乡南}l lf书I二 , J击阵}表达 , p 5 3 )丧l人}
亮 叶杨桐朗己; , , a耐 : a , ,: t` (l 。 M e r r . e X 日 . 1曰 . L i ) , 为茶乖I, ( T h e a e e a e ) , 杨桐属 ( 、飞己, , ,了, ,, (j : `, ) , 是一种
具有较高保健与药用价值的野生植物 。据民间传说 ,它具有 比较突出的消炎 、 解毒 、 止血 、 正痛 、
抑菌和杀菌等作用 。 经本文测定 ,其中总黄酮含童高达 28 . 刁% , 比一般茶叶高 ]一 2 倍 。 近年夹
的研究表明 , 多种黄酮类化合物具有抗致癌作用 ,例如 , 黄酮化合物榭皮素不仅对多种致痛物 、
促癌物和致突变剂有抵抗作用 ,而且对多种恶性肿瘤细胞有抑制作用仁`生。 本文以亮叶汤洞为实
验材料 ,从中分离提取出黄酮类化合物 ,并进行小鼠体内抗肿瘤试验 , 同时采用 R T 一 P c 尺 方法 ,
分析黄酮提取物对小 鼠 s 一 18 0肿瘤细胞中 5P 3 基因转录活性的影响 , 为开发利用这种野生药
用植物提供一定的理论依据 。 同时 ,在基因表达水平上为快速准确筛选抗肿瘤天然药物提供 一
定的实验和理论依据 。
材料与方法
1
.
] 材料
1
.
}
.
! 实验材料 亮叶杨桐 , 采自我国西南地区 。
1
.
1
.
2 实验 动物 正常昆明种小白鼠 , 体重 20 一咒 g , 雌雄兼用 , 由汕头大学医学院实验动物
中心提供 。
.l !
.
3 肿瘤 瘤株 s 一 { 8 0 肿瘤小鼠 , 为腹水型 ;艾氏腹水癌 ( E八 c )种小鼠 , 为腹水型 。均 由汕头
大学医学院肿瘤研究所提供 。
1
.
2 方法
1
.
2
.
1 亮叶杨桐黄酮提取物的制备 采用乙醇抽提法提取分离黄酮类化合物 ,工艺流程略 。
!1父稿 l ! Jg} ; 一9 9 7 ` l七刁 J」2 2 11
DOI : 10. 16333 /j . 1001 -6880. 1998. 03. 012
\’o 1. } 0N o . 3 陈 粤等 : 亮 1} 杨铜黄酮提取物抗瘤全而卜卜及共对小鼠 p 3 5推因表达 活性的影响 3 5
!
.
2
.
2 亮叶杨桐总黄酮含量的 刚定 位、黄酮含童是以芦丁做为标准品 ,三氯化铝比色法 ’ 竺 }进
行测定 。
l
·
2
.
3 亮叶杨桐黄酮提 取物对小 鼠肉瘤 S 一 ]80 的抑制作用 取正常昆明种小白鼠 ,体重 20
一 2 2 9 ,雌雄兼用 ,按《全国抗肿瘤药物体内筛选规程 》〔:` 1的方法进行 , 瘤源为 6一 d9 肿瘤生长良
好的 5 一 } 8 0 瘤细胞 , 接种 2化 后随机分组 ,每组 10 一 15 只 ,每天灌胃给药一次 , 连续 1 0d 。 实验
组分于组 , 剂星分别为 5 0 m g · k g ` 、 Z OOm g · k g ’和 ! 0 m g · gk ’ , 阳性对照组喂食吠喃奴尿
嚓咙 , 阴队对照组用生理盐水代替 。 停药后 ,小鼠拉椎处死 ,取出瘤块称重 ,计约抑瘤率 。
}
.
2
. 理 亮叶场桐黄酮提取物对 艾氏腹水癌 ( E八 C ) 小鼠 的生 命延长作用 取正 常昆明种小鼠 ,
体重 2 0一 2 29 , 雌雄兼用 ,按 《全国抗肿瘤药物体内筛选规程尸 ,的方法进行 , 瘤源为接种 7 d 月中
瘤生长 良好的 E八 C 小鼠腹水 ,接种 2化 后随机分组 , 每组 15 只 , 给药同上 , 停药后观察小鼠存
活时问 , 并计功生命延 长率 。
!
.
2
.
5 黄酮提 取物 对小鼠 S 一 } 8 0 月中瘤细胞中抑癌基因 p 5 3 转录活性的影响
戈 1 ) S 一 18 0 !}甲瘤邹{胞中 ,二 R N 八 的提取纯 化 : 。 I R N 八 分子的提取纯化采用 p h a r m a e i: 、 l` io t e e h
公司生产的 , , I R N 八 提取纯化试齐,}盒 ( Q L, i e k M i e r o 「。 R N 八 P u r s f se a t i o n K jr )进行 。
( 2 ) e O N 八 的合成 ( R e v e r s e T r a n s e r ip , io n ) : 在 0 . 5 , n z e p p e n d o r f 管中加入以下试齐{{ : 5 0 15火反
转录缓 ; ,! ,液 , 2 . 5 * 1 1O l n o l / L d N T p , 0 . 2 、 g 随机引物 ( R a n d o m p r im e r ) , 15 一11 已提纯的 n 1 R N \/ 溶
液 , 和 Z m l 反转录酶 ( 八M v R T ) , 枪 0 恒温反应 ! h . 反应试剂为 rP o m ge a 公司产品 。
( 3 、特异性引物 户C R 扩增 卜{一八 c t i n 和 p 5 3 基因 : D N 八 聚合酶链反应 ( P C R )过程为 : 9」C 变
侧三 ! ,: : 1;、 · 5 5 〔 退 火 ! 5、 , 7 2 c 延伸 Z r: 1 、 n , 进行 嘴。个循环 。
/
}
、 鼠 阵一八。 lt n 和 p 5 3 基因的特异性引物及扩增产物基因长度如下表 :
表 } 特异性引物 D N 八 序列及基因扩增产物长度 (b p )
早囚 引物 D N A 序列 l们 尸C R 产物
P r i rl l e r s , 八飞’ C通 G G C A C C A C A C C I、通 C l 、 A C A A飞 G A G C I、 G C G 3 ,
P r i l ll e r s , C (」 I C A r A C ` I C C I G C l l G C I’ G A `! ’ C C A C A ` I C I ’ C C 3`
P ir m e r 51 C C 〔 ;八G G C C G G C f C I ’ G 八〔犷 f入下入 C C八 C C A丫C C :3l
P r i t n e r sl C
`
I C八 T T C A C C T C C C G G 人八 C八 I C ` l、 C G A八 G C G 31
篇
扣 增后的基因产物在 ! . 5%琼脂糖凝胶 ( 含 lE 幼上水平电泳 , 电压 10 V ,时间为 } h , 以二
个 J人压{阳书{二扩增产物为对照 , 电泳 M a r k o r 为 口) X l 7 4 / 11 a 。 !11 D N A 。
以各组的 卜 八以 I n 基因 R T 一 P c R 产物的电泳结果为内参照 ,调整各组的 c 0 N 八 模板虽 , 使
各红i的 臼八以 ; n 基因的 R T 一 P c R 产物的数觉相同 , 同时来比较各组间 p53 基因 R T 一 尸c R 产物的
数觉 反应试剂为 rP o m o ga 公司产品 。
2 结 果
用乙醉抽提法提取分离亮叶杨铜中黄酮化合物 ,得到黄色粉末状晶体 。提取收率 、 纯度及
提取完全率分另l]为 j 2 . 19 步。 、 65 . 」9% 和 97 . 2 9% 。
2
.
2
2
.
3
2
.
3
经测定 , 亮叫杨桐中 曾、黄酮 含量为 2 8 . 4% 。
亮叶杨桐黄酮提取物小鼠体内抗瘤实验 :
对 小 袄肉后 s 一 180 的抑 瘤率 通过对实验数据进行 t检验统计处理 ,提取物对小鼠肉
54 j之然 J介 物研究 ` J 少t几发
瘤 s 一 ! 8 0 的抑瘤率 见表 2 。
表 2 亮叶杨桐黄酮提取物对小鼠肉瘤 S 一 } 8 0 的抑瘤率 (灌胃给药 )
夕11别 剂 时
(r丫19 / gk )
动物数
提 jl丈物
提J 4义物
提J仪物
l ,夫n南示!无}jJ泛,喃 l处
多
}蛋`!!去左水
5 0 0
2 0 0
】0 0
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l司下本科(
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X 土 、 拭
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.
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0
.
:弓2 生0 . 】日 (、 1. 0
0
. 吕9 士 t) . 日(少
注 抑瘤率一 ( ’ r 一 C ) / c l o o %
f 实验 !LJ 小鼠平均瘤 l双 , c : 对 1归 {{J/ 、 鼠 ’卜l]/ 九
2
.
3
.
2 对 E八 C 小 鼠的生 命延 长率 通过对实验数据进行 , 检验统计处理 ,提取物 又j l 厂 \(
鼠的生命延 民率 见表 3 。
表 3 亮叶杨桐黄酮提取物对 E \( ’ 小鼠的生命延长率 ( 灌胃给药 )
组别 药物 ,裂剂 「百七
同体积
动物数 ` } :(J 时 ljJ 川 ) ` l_ 命延 i; 一宁
X 土 卜 七
{ 3 ] 8
.
8 5士 7 . 9 1 5 } . 卫
飞5 15 . 5 3 士 3 . 飞j Z { . 肠
15 ]三 . 5 3士 3 . 2 0 0 . 18
15 14
.
73士 3 . 7 1 ] 8 . ]
! 5 12
.
17士 5 . 08
叨的o尸几9]] -提取物
提取 物
提取物
l决喃氟尿咤咙
,上正l!!劣允水
之1三: 生命延 长率 = ( r、 一 e ) / e K 10 0%
T : 实验组 小鼠 ’ l六均 生存时问 , c : 对照组小鼠平均 { 存时问
亮叶杨桐黄酮提取物对小鼠肉瘤 S 一 } 8 0 肿瘤细胞中 p 5 3 基因转录活性的影响
各实验组中 p 5 3 基因转录成 m R N 八 的活性的结果见图 l 。
由图 」可以看出 , 抑癌基因 p 53 转录活性在
用药前后有明显改变 , 即剂量为 5 0 0 1飞 · k g ’ 的
黄酮提取物组和剂量为 I OOm g · kg ’ 的 lk 喃抓尿
啼咙组中的 p 5 3 基因转录活性低于对照组 。 这一
结果和此两组较高的抑瘤率相对应 。 而其它两个
黄酮提取物实验组 (剂量分别为 2 0 1飞 · kg l和
I OOm g
·
kg
’
)中 p 5 3 基因转录活性基本 上和对照
组一致 。 这说明用药剂童与 p 5 3 基因转录活性受
抑制程度有相关性 。
3 讨 论
3
.
1 小鼠体内抗瘤试验结果表明 ,亮叶杨桐黄酮 图 . p 5 3基因扩增产物琼脂糖凝胶 ( } . 。 ;水平
提取物在 50 m g · kg `和 2 0 1飞 · kg `两个剂童 电泳图谱 (E B 显色 )
下灌 胃给药 ,对小 鼠肉瘤 S 一 18 0 有较强的抑制作 二 。 才11 50 0 , 11。 . k g 一 ! , * M 全{1 : 0 0 1 1飞: . 、 、 一 , 、 L 少}l
用 , 对艾氏腹水癌 ( E八 ( : ) 小鼠的生存期有明显的 10 0 , , , g · “ g 一 ` , * 厂 全11 `,夫 ,,南舀氏J’ 进晾 ’ ,之( `。 , ,、 , · 队g ”
延长作用 , 且存在一定的量效关系 。 另外 , 试验结 C 到L 阴性对然组 !(l 理盐水 )
果还揭示 ,此提取物对宿主毒性小 ,动物状态 良好 ,未见消瘦松毛等中毒表现 。 哄喃 i汉尿喃咤
物 l 印 N o 3 陈 粤等 :亮叶杨桐黄酮提取物抗瘤活性及其对小鼠 p 5 3基因表达活性的影响 弱
( l刀魄 , 畴 ’ )对 S 一 咚 Q的抑瘤率和黄酮提取物仍叻毗 · 胶g一 ` )相同 ,但由于它对宿主毒性很
大 、 用药后小鼠中毒死亡数量大 。 因而从统计学意义上来看 , 它的扰瘤作用不显著钾> 。 , 1沁
据文献 侧报道 , 茶叶中总黄酮 口服半数致死量为 L氏〕一 12 呱 o m驴 比 一 `小白鼠 ,即茶科植物中
的岔黄酮属子食品无毒级 。
冬 . 2 R T P饮 结果表 明 ,黄酮提取物对小鼠肿澎田胞中抑癌基因 p ” 的转录活性有明显的抑制作用 。 据文献 石服道 ,野生型心诚 l d一如砂 ) p邪 基因在细胞的增殖和分化的调控上起着关键性
作用 。 野生型夕邪 基因是一种隐性的肿瘤抑制基 因 , 同时又是一个主要的癌基因上“一 叼 。 在大多
数肿瘤细胞中 , 由于彩响父系和母系等位基因的遗传因素的结合、 野生型 p 5 3 基因的表达丢
失 . 这种丢失常常在实体瘤中发生 。 因此 ,在实体肿瘤中 ,常常是突变型的 夕邪 基因在表达 ,而
野生型 两 3基因特定位点的点突变可能引起一种很高的致癌活性 匕`叼 。 本文实验结果揭示 ,亮
叶杨桐黄酮提取物之5 0 mg · k息一 `〕和吠喃氛尿嗒咤 ( 工仓呱 , k 、 一 , )治疗的结果可能是通过抑制
了小鼠肿瘤细胞中突变型两 3 基因的转录活性 ,使突变型 乒5 3蛋白合成的数量减小 ,从而抑制
了 s 一 !髻。肿瘤细胞的增殖 ,达到抑制肿瘤生长的目的 。
3
.
3 流的化学预防就是用化学药物抑制肿瘤的发生 、或使肿瘤分化逆转 , 从而达到预防恶性
肿瘤的目的 。黄酮类化合物在癌的防治方面具有较好的活性 、 其中带有酚怨基的黄酮类化合物
能够石一效抑制黄曲霉素 13 致突代谢物与鼠伤寒沙门氏菌 。 N 八反应 , 芹黄素对 2一氨基意和 公
乙酚氰基苟致突有 }昆高的抑制作用、 并对苯并蓖致突也有抑制作用巳`」。 又据研究表明 ,从亮叶
杨桐提取物中分离纯化出芹菜素及其两种糖试汇, ’ 〕 ,它们都属于黄酮类化合物 。 因此亮叶杨桐
提取物不仪具有杭癌活性而且在预防肿瘤发生 一上也具有重要价值 *
综 .仁所述 ,亮 1一卜杨桐富含黄酮类化合物 , 其黄酮提取物具有筑肿瘤作用强 ,对宿主毒性小 、
对小鼠 肉瘤 s 一 ,别 肿瘤细胞中突变型 仁邪 基因转录活性有较强抑制作用 ,以及易分离提取等
特点卜 是一种很有研究开发价值的天然防疲抗癌药用植物资源 、 同时 ,本文的实验对利用分子
生物学方法在基因表达水平上决速准确地筛选到天然抗肿瘤药物进行了初步的探讨 ,在这方
而进 一少深 入的研究和探讨将具有十分重要的理论和实际意义 。
致谢 本又实验工作得到了汕头大学医学穆肿珍研究所沈容英教授和汕头大学生物系余杰副教授的热
情芍幼、 士此表示亥心感谢 。
参 考 文 献
! 毛七石 , 徐:l 平. 1羚酮类化合物钓扰肿瘤活甲L . 国外医学药学分册 , !仑邹 , 2念招 ) ;卯、 弱
j {几 成 , }毛春利等 从山价`卜提取黄酮类物质技其鉴定方法 . 食品科学 , I的通,乱作 片 ;砧一比
典 徐淑 : 象等一 药理实验方法学~ }七京 、人民 f互生出版飞L· 附韶川 T份~ 士17
} 岑颖洲 ,伍秋明等 天然黄酮类化合物的扰城化作用友开发应用前泉 . 广州食品工业科技 , 1朋 2 , 2 : 2。
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汤 C h和具 F . 匆全声 n 州 氢 晓 r r而 、加 戈 即 r不川 e l〕 凡 ` r o m 。盯息朗粥污 a乌易以巧;政司 W hft ht e 娜 3 u 山勺。 r su p p r吃s $ e r
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缪能 巾 湘刀二堪。姗尔 阶 活 C沁邵七二 。 1物 工,朋 ; 魂朋 沪~ 4比
g L尽郎公 P 。 。 t旋 你 l珍贬准滋。 。 诚 士啼 p 肠3 声时时介 i八 h 牡m洲 仁魏 n c e卜 」叼胡 . 石奴 人亡岁, 四洲 、〕g ,黔~ 四
, 场们、 。 \J , M 树功 1训 d `工, 即。地y c 八 . T h。 仙 3 扭~ 、 即 : ~ r 桃、
, 入铀跳均 g 一 l , 名引 : 4郭一朽 6
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丈R扑 i以叼 ()l 解司 加 )/, 吩洲 , 〕 :名 01 ~ 黝 7
56 天然产物研究 与J「发 V O ! , 10 N o . 3
日 金静兰 , 文水新等 . 亮叶杨铜 (石芽茶川 ,黄酮类成分的研究 . 广 hlJ 杭物 , ! 9 8 5 , 5 ( 3 ) : 3 0 {一 3 0 2
A N T IT U M O R A C T I V I T I E S O F F L A V O N O ID S E X T R A C T E D F R O M
人 D I N 人N l 〕I之人 N I T l l ) 八 A N D T H E I R E F F E C T S O N T H E
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m a e o u t i e a l w il d P l a n t
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e e x P r e s s j o n o于 r h e r n L一t日 n l P 5 3 g c Jl o j月
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e d t o t h e i n t e r 故 e t l o rl o n
C e r t a l n o n c o g
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