全 文 ：中 国农 营通报 , 一
花曲柳愈伤组织悬浮培养及秦皮甲素积累研究
刘孚睛 , 詹亚光 ,
东北林业大学生命科学学院 , 哈尔滨 巧
东北林业大学林学院林木遗传育种与生物技术国家重点实验室 , 哈尔滨 巧
摘 要 为建立花曲柳的愈伤组织诱导 、 增殖与悬浮培养体系 , 采用 为基本培养基 , 选取休眠 芽刚
萌发的叶片及叶柄为外植体 , 采用均 匀试验设计研究不 同浓度及配 比的生长调节剂对花曲柳愈伤组织
的形成和增殖的影响 。 留 和 几 的生长调节剂组合适合形成绿色 、松散的愈伤组
织 , 几 和 几 的组合适合形成增殖迅速的悬浮愈伤组织团 。 花 曲柳愈伤组织诱
导 的 最佳培养基为 一 几 一 几 增 殖 的最佳培养基为 几
几 愈伤组织悬浮培养基为 几 几 ,秦皮 甲素最
大积 累量 出现在悬浮培养的第 天 , 最高可达 德。
关键词 花曲柳 愈伤组织 悬浮培养 生长特性 秦皮甲素
中图分类号 文献标志码 论文编号 一
乃 介 ” ,抉奋
, ,
哪 诱 , 理 妙 ,
凡妙 理 肠 力叼 郡 , 理 妙 ,
, 心 石月
动 ” 五叩与从理 心及石月 动 ” 五叩与从理
·
心 动” 动哪泊尸肠
引言
花曲柳 均阴 ` 劝少 又名大叶白
蜡 、 大叶秽 、 苦杨白蜡树等 。 为木犀科秽属落叶大乔
木 , 羽状复叶 , 小叶 一 枚 , 雌雄两性花 , 线形翅果 , 花
期 一 月 , 果期 一 月 〕。 由于其干皮和枝皮中药
用次生代谢产物含量丰富 , 被 版药典规定为秦皮
的 种药源植物之一 〕。 秦皮具有清热燥湿 、 清肝明
目、 收涩止痢 、 止带等功效 , 用于热毒泻痢 、 带下 阴痒 、
基金项目 国家科技支撑计划项 目“ 白桦水曲柳新品种选育技术研究 ” 。
第一作者简介 刘孚蜻 , 女 , 年出生 , 黑龙江哈尔滨人 , 在读硕士 , 研究方向 植物细胞工程 。 通信地址 黑龙江省哈尔滨市和兴路 号 东
北林业大学生命科学学院 , 一 ·
通讯作者 詹亚光 , 女 , 年出生 , 黑龙江哈尔滨人 , 教授 , 博士生导师 , 博士 , 研究方向 植物生物技术 。 通信地址 黑龙江省哈尔滨市和兴
路 号 东北林业大学生命科学 , 孔 以 一 , 一 ￡ ·
收稿 日期 一 一 ,修回 日期 一 一抖 。
刘孚蜻等 喜树水培体系中喜树碱 、 轻基喜树碱及其他组分的初步鉴定
肝热 目赤肿痛 、 目生豁障等疾病 。 现代药理学研究表
明 , 秦皮中含有丰富的秦皮甲素 、 秦皮乙素 、 秦皮昔 、 秦
皮素等成分 , 有抗病原微生物 、 抗病毒 , 抗炎镇痛 , 抗肿
瘤 , 血管保护 , 抗氧化等多种作用 〕。 此外 , 等 〕的
研 究 也表 明适量秦 皮 乙 素作 为脂氧 合酶
抑制剂可以显著降低由 一种胞内
钙离子鳌合剂 所致的小鼠神经毒性 。 近年来 , 秦皮的
抗癌活性在人类癌症细胞中也得以验证 , 等 〕证
实了秦皮对人类结肠癌细胞的抗氧化活性及抑制效
应 。 在对不同品种秦皮药材中香豆素类成分进行的测
定中 , 陈琳等 〕发现 , 花曲柳中上述香豆素类化合物含
量最高 , 其中秦皮甲素不仅含量高且含量最为稳定 。
花曲柳虽在东北和黄河流域各省都有分布 , 但各
省分布范围小 , 更新速度及生长缓慢 , 资源较为 匿乏 ,
且乱砍乱阀也导致了该物种近年来数量严重减少 , 药
用秦皮货源随之紧张 , 伪品层 出不穷 。 因此 , 研究和建
立花曲柳的悬浮培养体系以替代天然花曲柳树皮原材
料 , 完善花曲柳药用次生代谢产物工厂化生产 , 势在必
行 。
目前对花曲柳组培研究工作尚处于初级阶段 , 研
究成果更是凤毛麟角 一 〕。 花曲柳叶诱导愈伤及悬浮培
养体系建立均未见报道 。 但秽属其他物种的组织培养
研究已经初见规模 一 〕。 本试验以花曲柳体眠芽萌发
的叶为外植体 , 在 培养基中添加不同浓度的生
长调节剂 , 进行花曲柳组织培养研究 , 以建立花曲柳愈
伤组织诱导及悬浮培养体系 , 并进行生长特性和秦皮
甲素积累的初步研究 。
材料与方法
试验材料与设备
花曲柳外植体材料为 年 月取 自帽 山林场
的野生成年花曲柳体眠芽萌发叶 。 植物生长调节剂蔡
乙酸 、 曝二 哩苯基脉 均为 分析纯 , 购 自
公司 。 秦皮甲素 、 秦皮乙素标准品均购 自中国
药品生物制 品检定所 。
一 型高压灭菌器 三洋科研 电子有限公
司 洁净工作 台 苏州泰安空气技术有 限公 司
一 鼓风干燥箱 上海博讯公司医疗设备
厂 高效液相色谱仪 自 公司 。
花曲柳愈伤组织诱导培养基筛选
外植体处理方法 年 月 , 将采回的花曲柳
体眠枝水培 , 待芽萌发 , 取下小叶用吐温进行表面清洗
后 , 流水冲洗 , 吸干表面水分 , 用 酒精预消毒
, 放入超净工作台中 , 用清水冲洗 次 , 之后用
消毒 一 , 再用清水彻底冲洗 一 次 ,
切成 一 耐的小块后 , 放入培养基中 。 在 封 ℃ ,
光照强度 巧 , 光 照时间 的条件下培养
天 。
花 曲柳愈伤组织诱导培养基选择 以 为基
本培养基 , 进行植物生长调节剂 和 单独和
组合诱导愈伤组织效果的研究 , 考察 一 几
与 几 组合 和 一 几 与 几
组合 对花 曲柳愈伤组织诱导率的影响 ,
每 个外植体为 个重复 , 每个处理组合 次重复 。
其他添加物为 几 蔗糖及 留 琼脂
℃灭菌 。
花曲柳愈伤组织增殖培养基筛选
以 为基本培养基 , 分 别考察 一 几
与 几 组合 和 一 几 与
几 组合 对花 曲柳愈伤组织形态和增殖倍
数的影响 表 其他添加物为 几 蔗糖及 几
琼脂 ℃灭菌 。 将 节中诱导得到
的愈伤组织切成质量为 士 的小块 , 分别接入
增殖培养基中培养 , 用 以筛选花曲柳愈伤组织
适合的继代培养基 。 每 块愈伤组织为 个重复 , 每
个处理组合 次重复 。
培养基编号
继代培养生长调节剂组合 乍
浓度 浓度 培养基编号 浓度 浓度
一︸
花曲柳悬浮培养体系建立及参数测定
悬浮培养体系建立过程 以 为基本培
养基 , 添加 几 和 几 并加入
蔗糖 一 ℃灭菌 。 将 节
中增殖数代得到的愈伤组织切成 一 的小块 , 接
入上述液体培养基中 , 一巧天继代 次 , 一 代后得到
均匀稳定生长的愈伤组织团块 。 在获得均匀生长的悬
浮培养体系后 , 分别在继代培养的 、 、 天 、
天 、 天 、 天时取样 , 分别 测量鲜物质重量
、 干物质重量 、 细胞活力 口 值及秦皮甲素
含量的变化 。
、 的测定 在每一时间点取样后 , 用定性
滤纸吸干表面水分 , 称取的重量即为 之后 ℃烘
干样品至恒重 , 称定重量为 。
中国农 学通报 堪
细胞 活 力的测 定 在每一时 间点取样前 , 取
离心管分别加入 的磷酸缓冲液 ,
然后立即精密称取 鲜物质放入离心管中 , 分别
加入 溶液 , 避光处理 巧 后 , 在 波长
下测 定吸光度 口 值 , 绘制 口 值 一时间曲线
。
法测定秦皮甲素含量
条件 。 采用反相 硅烷键合硅胶色
谱柱 以乙睛 一 磷酸溶液 作为流动相 检测
波长为 。
对照品溶液的制备 。 取秦皮甲素标准品适量 ,
精密称定 , 加甲醇制成每毫升含秦皮甲素 的溶
液 , 即得 。
供试品溶液的制备 。 在每一时间点取样并烘
干至恒重后 , 用研钵将样品磨成粉末 , 过 号筛
目 , 精密称定 粉末 , 放入具塞圆底烧瓶中 按料
液 匕 竹精密加入 甲醇 , 密塞 , 称定重
量 , 加热回流 , 放冷 , 再称定重量 , 用 甲醇补足减失
的重量 , 摇匀 , 滤过 , 续取滤液 , 将滤液蒸干 , 放冷 , 用
甲醇重新溶解 , 即得 。
结果与分析
花曲柳愈伤组织的诱导
在不 同浓度的 和 组合的固体培养基
上 , 花曲柳愈伤组织的诱导率及愈伤组织大小均表现
不同 表 一 及 图 。 当 留 时 , 随着
浓度的提高 , 愈伤组织诱导率呈先上升 后下 降的趋
势 。 一 号培养基均可诱导愈伤组织的形成 , 但低浓
度 一 号 对愈伤组织诱导率较低
, 高浓度 一 号 又会抑制 愈伤组织的
形成 一 , 几 较为适宜 , 诱导率达
到 号培养基 。 在提供 几 条件下 ,
随着 浓度的提高 , 愈伤组织诱导率变化趋势与
试验组相同 , 几 处达到峰值 号培
养基 。 号培养基无愈伤组织形成 , 但 号培养基有
少量愈伤组织形成 , 表明愈伤组织可 以在无 的
培养基中被诱导 , 但不能无 , 说明 在愈伤
组织诱导中起决定作用 。 其中 或 号培养基愈
伤组织诱导率最高 , 达到 , 愈伤组织块
数也最多 , 质密翠绿 , 生长旺盛 。 因此 , 花曲柳愈伤组
织诱导的最适培养基为 几 几
表 不同浓度 对愈伤组织诱导率的影响 乍
愈伤组织块数培养基编号 吧几 几 外植体数 块 诱导率毛
伪,
门伪,︸ 民小
表 不同浓度 对愈伤组织诱导率的影响 乍
愈伤组织块数培养基编号 几 外植体数 块 诱导率毛 叮
伪,
刘孚靖等 喜树水培体系中喜树碱 、 经基喜树碱及其他组分的初步鉴定
图中编号对应表 一 中的培养基编号
图 不同培养基中诱导的愈伤组织形态
。
花曲柳愈伤组织的增殖
由图 可知 , 浓度较低 几 不利于愈
伤组织增殖 , 过高 也会抑制其增殖 , 根据增殖
倍 数 对 浓 度 变 化 的 响 应 做 出 回 归 方 程
护 一 丫 , 方程拟合效果很好 二
。 根据图 也可得出与 浓度对增殖倍数
影响 , 回归方程为护一 扩 , 方程
拟合效果也很好 。 从图 中可以看出 , 与
号培养基相比较 , 号培养基的愈伤组织翠绿质密 , 利
于愈伤组织继代培养 。 分别由回归方程一阶导数求极
值得到花 曲柳愈伤组织继代培养基最佳激素组合为
几 几 , 增殖倍数
为
,
氧华翻聊戴华翎缨
,
浓度找曹 浓度戏口曹
图 生长调节剂对花曲柳愈伤组织增殖倍数的影响
花曲柳悬浮培养体系生长特性
根据愈伤组织诱导及继代培养结果 , 选择继代
巧 天一致性强的致密愈伤组织进行悬浮培养 , 培
养基为 几 。
根据图 所示 , 花曲柳悬浮体系基本程度现出
型生长 , 一 天为延滞期 , 一 天为对数生长期 , 一 天
为稳定期 , 天之后进入衰亡期 。 干重的变化 图
与鲜重变化情况基本一致 , 天后 , 悬浮细胞进入稳定
图 号愈伤组织 左 与 号 右 对比 期 , 干物质含量较鲜重减少趋势更快 。 在图 中 , 细
中国农 学通报 堪
巧八
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时间 时间
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时间 时间
图 花曲柳悬浮培养体系生长特性随时间变化
胞活力随时间也有明显的变化 , 延滞期时 , 细胞活
力最大 , 表明此阶段细胞生长旺盛 , 而后降低 , 天后
又逐渐升高 , 天达到第 个最高点 , 进入 天后 , 由于
培养基内营养物质匿乏 , 导致悬浮体系进入稳定期 , 细
胞活力迅速降低 。 图 反映出悬浮体系生长阶段秦
皮甲素随时间的变化 , 可 以看出 , 秦皮甲素的合成与细
胞生长关系也 比较密切 , 在继代培养前期 一 天 , 秦
皮甲素的含量都保持在一个基本稳定的较低水平 , 而
后随着细胞进入对数期 , 细胞的代谢也 日趋旺盛 , 秦皮
甲素含量也随之增加 , 基本与细胞生长情况呈正相关
在 天时达峰值 , 随后秦皮甲素含量开始下降 。 考虑
到细胞 、 、 细胞活力 、 次生代谢产物秦皮甲素含
量的变化 个因素 , 愈伤组织团块悬浮培养的最佳继
代时间在 天左右 。 在整个培养周期中 , 秦皮甲素产
量最高点为最低点含量的约 倍 , 初始含量最低 , 最
大积累量出现在第 天 , 秦皮甲素达到 ·
。
结论
以叶片和叶柄作为外植体诱导花 曲柳愈伤组
织可行 , 且诱导率较高 , 诱导培养基为 几
几 , 此条件下的花曲柳愈伤组织翠
绿致密 , 适宜进行继代培养 。
对花 曲柳愈伤组织进行继代 的培养基 为
一 一 几 , 高浓度及低
浓度的植物生长调节剂都会对愈伤组织的增殖产生抑
制作用 。
通过对鲜重 、 干重 、 细胞活力 、 及秦皮甲素含量
变化的考察 , 绘制了花曲柳悬浮培养的生长曲线 , 确定
了花曲柳继代培养的最佳周期为 天 。 若未来应用花
曲柳悬浮培养体系建立生物反应器 , 对秦皮甲素进行
工厂化生产 , 也可 以用 天作为一个继代培养周期的
参考 。
讨论
不同的植物生长调节剂及不同组合可以对外植体
产生不 同的预期影响 , 愈伤组织的诱导和增殖中植物
生长调节剂应用十分普遍 。 近凡年 , 植物生长调节剂
对半夏 〕、 雷公藤 〕、 甘蓝型油菜 〕及黄精 〕等植物的
愈伤组织诱导和增殖的影响均有报道 , 不同的植物生
长调节剂和调节剂组合可 以改变愈伤组织的诱导率 、
愈伤组织的形态和颜色等生理特性 。 本研究选用花曲
刘孚蜻等 喜树水培体系中喜树碱 、 轻基喜树碱及其他组分的初步鉴定
柳体眠芽萌发叶 , 分别选用不同的植物生长调节剂组
合 , 筛选出了适合花曲柳愈伤组织诱导和增殖的培养
基 。 并且愈伤组织翠绿致密 , 适宜用于液体悬浮培养 。
花 曲柳愈伤组织悬浮培养生长特性显示 , 花曲柳
生长曲线成 型 , 分为延迟期 一 天 、 对数期 一
天 和稳定期 一 天 , 最佳的继代周期为 天 。 在其
他物种的悬浮培养研究中 , 沙枣生长曲线成 型 日 〕 ,
天为延迟期 , 天为对数期 , 天以后进入稳定
期 。 黄波罗的生长 曲线大致为 型 〕 , 一 天为延迟
期 , 一 天为对数期 , 天以后进入稳定期 。 不同材
料的生长曲线形态类似 , 但到达各时期所需的时间不
同 , 细胞生长的规律也不尽相同 。 在细胞的生长过程
中 , 延迟期和对数期时细胞活力水平较高 , 进入稳定期
前 , 细胞活力降低 , 稳定期时达到第 个高峰 , 稳定期
后 细胞开始衰亡 , 细胞活力也随之降低 。 在花曲柳愈
伤组织在悬浮培养过程中 , 可 以获得秦皮甲素含量为
的干愈伤组织 , 在稳定期以前 , 由于培养基内营
养成分充足 , 细胞的秦皮甲素含量稳定在一个较低水
平 , 而进入稳定期后 , 秦皮甲素含量迅速增高 , 达到细
胞生长过程的最高值 , 之后细胞进入衰亡期 , 体系产生
次生代谢能力降低 , 秦皮甲素含量也随之减少 。
在对花曲柳悬浮培养体系的初步研究中 , 笔者发
现 , 秦皮甲素能够在悬浮培养体系中合成 , 并且合成量
与苦杨白蜡树所制秦皮中含量 〕相差仅
为 余倍 , 按花曲柳悬浮培养体系每次继代 天 增
殖 倍计算 , 考虑到可观的年增殖倍数 , 则花曲柳悬浮
培养每年产量有超过 自然生长状态下野生花曲柳 自身
干皮与枝皮生产量的潜力 。 如建立花曲柳悬浮培养体
系生物反应器 , 进行工厂化生产 , 将对花曲柳物种保护
及秦皮药用成分生产产生积极地推动作用 。
等 研究发现 , 花生幼苗被 照射后 , 白黎芦醇的
积累量有显著提高 。 一 等 〕则将茉莉酸
添加到苍术苗 勺了。砒 “ 中 , 其挥发油的
积 累量也有明显增加 。 因此 , 若将花曲柳悬浮培养体
系引入其他促进香豆素类合成的因素 , 如温度胁迫 、 光
照 、 信号诱导等 , 将有望大幅度提高秦皮甲素的产量 。
这样既可以保证秦皮的药学作用最大化利用 , 又解决
了传统取材对树木的破坏 , 对维持可持续发展也有积
极推动作用 。
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