全 文 ：第 31卷　第 2期
2011年　3月
河北大学学报(自然科学版)
Journal of Hebei Univer sity (N atural Science Edi tion)
Vol.31 No.2
M ar.2011
华北大黄愈伤组织培养及土大黄苷含量研究
王俊丽1 ,陆远1 ,刘坤1 , 2 ,许东婷1 ,刘名飞1
(1.中央民族大学 生命与环境科学学院 , 北京　100081;2.河北经贸大学 生物科学与工程学院 , 河北 石家庄　050061)
　　摘　要:为有效保护和利用华北大黄野生资源 ,以野生华北大黄为材料 ,探讨了不同种类 、不同质量浓度
的植物生长调节剂对其愈伤组织诱导及增殖效应 ,并采用高效液相色谱对愈伤组织及野生植株中土大黄苷
含量进行了分析.结果表明:MS培养基中单独添加不同质量浓度的 6-BA ,不利于愈伤组织的增殖;培养基
中单独添加不同质量浓度的 NAA 和 2 ,4-D ,对愈伤组织的增殖有一定作用;6-BA 分别与低质量浓度 NAA
及 2 ,4-D配合使用时 ,对愈伤组织的增殖效应十分明显.3种不同类型的愈伤组织中均检出土大黄苷 ,其
中 2种愈伤组织土大黄苷的质量分数高达 1.45%～ 1.54%,为野生植株的 3.63 ～ 3.85倍.
关键词:华北大黄;愈伤组织;土大黄苷
中图分类号:Q 945　　　文献标志码:A　　　文章编号:1000-1565(2011)02-0195-05
Callus Proliferation and Rhaponticin Accumulation of
Rheum f ranzenbachii Munt.
WANGJun-li1 , LUYuan1 , LIU Kun1 , 2 , XUDong-t ing1 , LIU Ming-fei1
(1.College of Life and Environmental Sciences , Minzu University of China , Beijing 100081 ,China;2.College
of Biology Science and Engineering , Hebei University of Economics and Business , Shijiazhuang 050061 ,China)
Abstract:The effects of dif ferent plant grow th regulators on cal lus proliferat ion we re discussed , using
wild plant of Rheum f ranzenbachii as mate rials in this study , and contents of rhapont icin in samples o f cal-
lus and w ild plants w as analy zed by HPLC.The re sults show ed that the M S medium plus different mass
concentration of 6-BA lonely w as not conduciv e to the pro liferation of callus , and different mass concentra-
tion o f NAA and 2 , 4-D lonely play ed a ro le fo r the proliferat ion.6-BA in combina tion w ith lowe r mass
concentration of NAA or 2 ,4-D was very sui table for callus proliferation.Rhaponticin were detected in three types
of callus , and the mass fraction of tw o types of calluses w as as high as 1.45%～ 1.54%, 3.63 ～ 3.85 times
compared to that of w ild plants.
Key words:Rheum f ranzenbachi i;callus;rhaponticin
华北大黄(Rheum f ranzenbachi i Munt.)属蓼科(Polygonaceae)大黄属(Rheum Linn.)波叶组多年生草
本植物 ,产于山西 、河北 、内蒙古南部及河南北部 ,生于海拔 1 000 ～ 1 600 m 山坡石滩或林缘[ 1] .其根及根茎
入药 ,味苦 ,性寒 ,有泻热 、通便 、破积 、行瘀的功能 ,用于热结便秘 、湿热黄疸 、痈肿疔毒 、烫火伤等 ,并有抗菌 、
　收稿日期:2010-09-10
　基金项目:“ 973”计划资助项目(2009CB522300);植物化学与西部植物资源持续利用国家重点实验室开放课题资助项目
(09708211Z1);国家民委资助项目(09ZY09);“985”工程资助项目(M UC985);“高等学校学科创新引智计划”资
助项目(B08044);中央高校基本科研业务费专项资金资助项目(0910KYZY46)
　第一作者:王俊丽(1964-), 女 ,河北新乐人 , 中央民族大学教授 ,博士生导师 , 主要从事植物细胞工程和药用植物资源等方
面的研究.E-mail:wang junli2008@yahoo.com.cn
河北大学学报(自然科学版) 2011 年
消炎 、收敛 、止血等作用 [ 2] .
波叶组大黄的根及根茎中富含茋类成分 ,茋类成分的药理作用十分广泛.王爱芹等[ 3]从华北大黄的根及
根茎的体积分数为 95%乙醇提取物中 ,分得 6个茋类化合物 ,经化学和谱学方法分别鉴定为去氧土大黄苷
元(desoxy rhapontigenin , Ⅰ), 土大黄苷元(rhapont igenin , Ⅱ), piceatannol(Ⅲ), 去氧土大黄苷(des-
oxy rhaponticin , Ⅳ),土大黄苷(rhaponticin , Ⅴ), piceatanno l-3′-O-β-D-g lucopy ranoside(Ⅵ ).郑俊华[ 2] 等应
用高效液相色谱法测定了华北大黄中茋类成分的含量 ,土大黄苷质量分数高达 0.537%.
近期研究表明 ,土大黄苷具有抗菌 、改善微循环 、降血脂 、降血糖 、抗肿瘤 、抑制过敏反应 、调节机体免疫
防御系统 、抗血栓及抗氧化等作用 ,是一种药用潜力巨大的化合物[ 4] .
随着人们对药用植物资源需求的日益增加 ,乱挖滥采现象严重 ,导致了野生资源的匮乏.生物技术在药
用植物资源可持续开发利用方面发挥着重要作用 ,并取得了一定的进展.植物细胞具有全能性 ,通过细胞培
养 ,可获取原植物体内的活性成分 ,通过培养条件的优化和代谢调控 ,可使活性成分的含量有可能超过原植
物 ,且有可能诱导出重要先导化合物.目前 ,人们已对很多药用植物开展了有关方面的研究 ,例如 ,杜仲 、新疆
雪莲 、长春花等[ 5-10] .然而 ,有关华北大黄组织培养方面的研究很少 ,仅见 1篇文献[ 11] .
本研究的目的在于探索华北大黄愈伤组织诱导 、增殖及土大黄苷合成积累的相关条件 ,为华北大黄的可
持续开发利用奠定基础.
1　材料与方法
1.1　植物材料
野生华北大黄植株于 2008年 7月采自北京灵山海拔 1 800 m 处.
1.2　方法
1.2.1　植物材料的消毒处理
取华北大黄的叶片 ,用流水冲洗 0.5 h ,于超净工作台上经体积分数为 75%的酒精处理 30 s ,置于质量
浓度为 1.0 g/L 的 HgCl2 溶液中浸泡 9 min ,用无菌水冲洗 5 ～ 6次.
1.2.2　培养基及培养条件
采用 MS 基本培养基 ,其中蔗糖质量浓度为 30.0 g/L ,琼脂质量浓度为 7.0 g/L ,灭菌前 pH 调至
5.8 左右 ,在 121 ℃高压蒸气灭菌 20 min.培养温度为(25±2)℃,光照 12 h/d ,光强 40 μmol·m-2 · s-1 .
1.2.3　愈伤组织的诱导与增殖
将消毒处理过的叶片切成小块接种到附加不同植物调节剂的 MS 培养基中进行诱导培养.将诱导出的
愈伤组织接种于不同 MS 培养基上进行增殖培养 ,每瓶接种量鲜重为 0.5 g(干重 0.04 g).收集生长 35 d的
愈伤组织 ,分别称量各瓶愈伤组织的鲜重和干重.每 9瓶为一个处理 ,每处理重复 3次 ,
1.2.4　土大黄苷的提取与含量测定
所用仪器为高效液相色谱仪 LC-10AVP Plus(日本岛津公司).色谱条件:色谱柱 Hypersil BDS C18 Col-
umns-Thermo Scientific(4.6 mm×260 mm ,5μm),流动相为V(乙腈)∶V(水)=25∶75 ,溶剂流速 1.0 mL/min ,
检测波长 320 nm ,柱温为室温.
土大黄苷(rhaponticin)对照品购自中国药品生物制品检定所(批号 110794-200103),分别称取愈伤组
织 、野生植株粉末 0.1 g ,置具塞锥形瓶中 ,加入体积分数 80%的乙醇 25 mL ,称定重量 ,加热回流 2 h ,放冷 ,
再称定重量 ,用体积分数为 80%的乙醇补足减失的重量 ,摇匀 ,滤过 ,弃去初滤液 ,取续滤液 10 mL ,蒸干 ,残
渣加甲醇使溶解 ,转移至 10 mL 量瓶中 ,加甲醇至刻度 ,摇匀[ 12] ,用 0.45 μm 滤膜过滤 ,20 mL 进样.
1.2.5　数据分析
使用 Origin7.5分析软件 ,对所得数据进行分析.
2　结果与分析
2.1　愈伤组织的诱导与增殖
将华北大黄的叶片外植体接入添加不同质量浓度的 6-BA与 NAA 的 MS 培养基中 ,5 d后 ,可以观察到
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第 2 期 王俊丽等:华北大黄愈伤组织培养及土大黄苷含量研究
整个外植体变得膨大 ,2周后白色或浅绿色的愈伤组织形成.当6-BA质量浓度为 2.0 mg/L 、NAA 质量浓度
为 0.5 mg/L 时诱导效果最好 ,所诱导出的愈伤组织致密 ,浅绿色 ,诱导率为 58.3%.
取诱导出的愈伤组织进行增殖培养.培养基中单独添加不同质量浓度的 NAA和 2 ,4-D对愈伤组织的增殖
有明显作用(表 1).当 NAA质量浓度高于 0.5 mg/ L 时 ,培养 35 d后 ,愈伤组织鲜重和干重分别为 5.34 ～
5.63 g/瓶和 0.27 ～ 0.29 g/瓶 ,与对照相比差异显著(p <0.05).培养基中附加不同质量浓度的 2 ,4-D 时 ,
愈伤组织鲜重和干重分别为 4.65 ～ 4.76 g/瓶和 0.28 ～ 0.32 g/瓶 ,与对照相比差异显著(p <0.05).
表 1　NAA和 2 , 4-D对华北大黄愈伤组织的增殖效应
Tab.1　Effects of NAA and 2 , 4-D on callus proliferation
植物生长调节剂 质量浓度/(mg · L-1)鲜重/(g/瓶) 干重/(g/瓶) 愈伤组织状态
NAA
0　 3.23±0.33c 0.14±0.02b 黄褐色 , 疏松
0.5 3.72±0.29b 0.18±0.03b 黄绿色 , 疏松
1.0 5.34±0.35a 0.27±0.05a 黄绿色 , 疏松
2.0 5.63±0.37a 0.28±0.05a 黄绿色 , 疏松
4.0 5.59±0.28a 0.29±0.30a 黄绿色 , 疏松
2 , 4-D 0　 3.23±0.33b 0.14±0.02b 黄褐色 , 疏松
0.5 4.28±0.25a 0.28±0.06a 白色 , 致密　
1.0 4.65±0.46a 0.31±0.02a 白色 , 致密　
2.0 4.76±0.21a 0.32±0.04a 白色 , 致密　
4.0 4.70±0.19a 0.31±0.03a 白色 , 致密　
　　　　每瓶初始接种量为 0.5 g ,培养 35 d采收愈伤组织.
培养基中分别单独附加 0.5 ,1.0 ,2.0 ,4.0 mg/ L的 6-BA 时 ,愈伤组织生长缓慢 ,甚至褐化死亡.当不同
质量浓度的 6-BA 分别与低质量浓度的 NAA ,2 ,4-D配合使用时 ,对愈伤组织的增殖效应十分明显 , 其愈伤
组织鲜重和干重分别为 9.16 ～ 10.92 g/瓶和 0.54 ～ 0.60g/瓶.而 6-BA 与 IAA 配合使用时 ,增殖效应不明
显.愈伤组织的鲜重 、干重详见表 2.
表 2　6-BA与 NAA , 2 , 4-D, IAA 配合对愈伤组织的增殖影响
Tab.2　Ef fects of 6-BA in combination with NAA , 2 , 4-D and IAA on callus proliferation
培养基种类 鲜重/(g/瓶) 干重/(g/瓶) 愈伤组织状态
MS+6-BA 2.0 +NAA 0.2 10.46±1.19 0.62±0.06 绿色 , 致密　
MS+6-BA 2.0 +2 , 4-D 0.2 10.33±0.97 0.50±0.03 黄绿色 , 疏松
MS+6-BA 2.0 +IAA 0.2 2.27±0.34 0.21±0.03 褐色 , 疏松　
MS(不加生长调节剂) 3.23±0.33 0.14±0.02 黄褐色 , 疏松
　　　　　每瓶初始接种量为 0.5 g , 培养 35 d 采收愈伤组织.生长调节剂质量浓度单位为 mg/ L.
2.2　土大黄苷含量测定
2.2.1　标准曲线的绘制
将质量浓度为 0.08 mg/L 的对照品溶液进样 1.0 ,3.0 ,6.0 , 9.0 ,12.0 , 15.0 ,18.0 μL .土大黄苷的保留
时间为 5.22 ～ 5.28 min(图 1);以土大黄苷峰面积为纵坐标 ,进样量(μg)为横坐标 ,得到标准曲线(图 2).回
归方程为Y =160 101X +8 412.9 ,R 2 =0.999 7.实验结果表明 ,土大黄苷进样量在0.08 ～ 1.44 μg 内与峰面
积呈良好的线性关系 ,满足含量测定的要求.
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河北大学学报(自然科学版) 2011 年
　　　　　箭头所指峰为土大黄苷　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　图 1　土大黄苷对照品 HPLC图　　　　　　　　　　　　　　　　图 2　土大黄苷的标准曲线
Fig.1　HPLC chromatogram of rhaponticin reference substance　　　　　　　Fig.2　Standard curve of rhaponticin　　
2.2.2　土大黄苷含量的测定
选取 MS+6-BA 2.0 mg/L +NAA 0.2 mg/ L ,MS+6-BA 2.0 mg/L +2 ,4-D 0.2 mg/ L 和 MS+6-BA
2.0 mg/L +IAA 0.2 mg/ L 3种培养基中增殖的愈伤组织 Ⅰ(绿色 ,致密)、愈伤组织 Ⅱ(黄绿色 ,疏松)、愈伤
组织 Ⅲ(褐色 ,疏松)和野生植株进行土大黄苷含量分析.通过液相色谱检测 ,野生植株和愈伤组织中均检测
到土大黄苷 ,4个样品的 HPLC谱图在 5.22 ～ 5.28 min均有峰出现 ,其检测谱图见图 3.
A.野生植株;B.愈伤组织Ⅰ ;箭头所指峰为土大黄苷.
图 3　野生植株和愈伤组织中土大黄苷的 HPLC图谱
Fig.3　HPLC chromatogram of rhaponticin in wild plant and callus
图 4　野生植株和不同愈伤组织中土大黄苷含量
Fig.4　Rhaponticin contents in wild plant and different callus
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第 2 期 王俊丽等:华北大黄愈伤组织培养及土大黄苷含量研究
分析得知 ,野生植株中的土大黄苷的质量分数为 0.40%.附加不同植物生长调节剂的 MS 培养基所获
得的愈伤组织均含有土大黄苷 ,愈伤组织Ⅰ和 Ⅱ中土大黄苷的质量分数为 1.45%～ 1.54%,为野生植株的
3.63 ～ 3.85倍.愈伤组织Ⅰ和Ⅱ与野生植株土大黄苷的含量差异显著(p<0.05).愈伤组织 Ⅲ中土大黄苷的
质量分数为 0.10%,含量低于野生植株(图 4).
3　讨论
3.1　不同生长调节剂对华北大黄愈伤组织的增殖效应
培养基中单独添加不同质量浓度的 NAA和 2 ,4-D对愈伤组织的增殖有明显作用.培养基中分别单独附加
6-BA时 ,愈伤组织生长缓慢 ,甚至褐化死亡 ,但当 6-BA 分别与低质量浓度 NAA ,2 , 4-D配合使用时 ,对愈伤组
织的增殖效应十分明显 ,并且增殖效果明显强于单独添加不同质量浓度的 NAA和 2 ,4-D ,说明 6-BA与 NAA ,
2 ,4-D对愈伤组织的增殖有协同作用.6-BA与 IAA配合使用时 ,愈伤组织的增殖效应则不显著.
3.2　不同生长调节剂对华北大黄愈伤组织中土大黄苷积累的影响
本研究测得野生华北大黄植株中土大黄苷的质量分数为 0.40%,与郑俊华等[ 2] 测得的数据(0.537%)
接近.与野生华北大黄植株相比 ,3种愈伤组织中有 2种土大黄苷的含量显著高于野生植株 ,表明 6-BA 和
NAA配合或与 2 ,4-D配合使用时 ,均有利于土大黄苷的合成和积累.
对比野生华北大黄植株和愈伤组织的谱图 ,发现两者在保留时间 1.98 ～ 4.00 min 内均出现多个峰.这
些峰可能是其他茋类化合物(如去氧土大黄苷元 、土大黄苷元 、去氧土大黄苷等),有待进一步研究.
参　考　文　献:
[ 1] 中国科学院中国植物志编辑委员会.中国植物志:第 25 卷[ M] .北京:科学出版社 , 2004:171.
[ 2] 郑俊华 , 西泽信 , 山岸乔 , 等.三种非正品大黄中 34 种化学成分的高效液相色谱法定量分析[ J] .北京医科大学学报 ,
1989 , 21(4):315-316.
[ 3] 王爱芹 , 李军林 , 吴祖泽.华北大黄中茋类成分的研究[ J] .中草药 , 2001 , 32(10):878-880.
[ 4] 徐颖 , 郭增军 , 谭林.土大黄苷研究进展[ J] .中国现代应用药学杂志 , 2009 , 26(7):549-552.
[ 5] KANG S M , MIN J Y , KIM Y D.e t al.Effects of methyl jasmonate and salicylic acid on the production of biloba lide and
g inkgo lides in ce ll cultur es o f Ginkgo bi loba [ J] .I n V itro Cell Dev Bio l-P lant , 2006 , 42:44-49.
[ 6] JAYAPAUL K , KAVI KISHOR P B , JANARDHAN REDDY K.Production of pyr ro loquinazoline alkaloid from leaf and
petio le-deriv ed callus cultures o f A dhatoda zey lanica [ J] .In Vitro Cell Dev Biol-Plant , 2005 , 41:682-685.
[ 7] WANG Junli , LIAO Xiang ru , ZHANG Hongmei.et a l.Accumulation of chlor ogenic acid in cell suspension cultures o f
Eucommia ulmoides Oliv [ J] .P lant Cell , Tissue and O rgan Culture , 2003 , 74(2):193-195.
[ 8] M AKUNGA N P , VAN STADEN J.An efficient sy stem fo r the production o f clonal plantle ts of the medicinally impo r-
tant aromatic plant:Salvia a f ricana-lutea L [ J] .P lant Cell , Tissue O rgan Culture , 2008 , 92:63-72.
[ 9] DHANDAPANI M , KIM D H , HONG S B.Efficient plant reg ener ation via somatic embryogenesis and o rg anogenesis
f rom the explants o f Catharanthus roseus [ J] .In V itr o Cell Dev Biol-Plant , 2008 , 44:18-25.
[ 10] GUO Bin , GAO Min , LIU Chunzhao.In vitro propagation o f an endangered medicinal plant S aussurea involucrata Kar.
et Kir [ J] .Plant Cell Rep , 2007 , 26:261-265.
[ 11] 胡人伦 , 朱宝成.药用植物河北大黄叶片的组织培养研究[ J] .河北大学学报:自然科学版 , 1989 , 11(4):55-58.
[ 12] 逯海龙 ,韩义欣 ,董文静.HPLC 法测定栽培河套大黄中土大黄苷的含量[ J] .药物分析杂志 , 2007 , 27(11):1809-1811.
(责任编辑:赵藏赏)
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