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[ 收稿日期] 2009-10-27
[ 基金项目] 国家自然科学基金(编号:30760308)国家科技支撑计划资助项目(编号:2007BAI30B03)　[ 作者简介] 古力娜·达吾提 ,女 ,学士 ,
副主任药师 ,电话:0991-2563702 , E-mai l:gulnar426@163.com　[ 通讯作者] 李治建 ,男 ,硕士 ,助理研究员 ,电话:0991-2566559 , 15981799975 ,
E-mai l:lizhi ji an0220@sina.com
气-质联用研究地锦草提取物对红色毛癣菌麦角甾醇的影响
古力娜·达吾提1 ,斯拉甫·艾白1 , 2 ,李治建2 ,安惠霞3 ,周凡4 　(1.新疆维吾尔自治区维吾尔医医院 , 新疆 乌鲁木齐
830049;2.新疆维吾尔医药研究所 , 新疆 乌鲁木齐 830049;3.石河子大学药学院 ,新疆 石河子 832000;4.新疆医科大学药学
院 , 新疆 乌鲁木齐 830054)
[ 摘要] 　目的:研究地锦草提取物对真菌细胞膜中麦角甾醇生物合成的影响。 方法:红色毛癣菌经不同浓度的地锦草提取物
作用后收集菌丝 , 经过漂洗 、皂化 、提取和 N-甲基三甲基硅基三氟乙酰胺衍生化 ,采用气-质联用(GC-MS)法测定其麦角甾醇
的含量。结果:地锦草提取物能使红色毛癣菌中的麦角甾醇含量下降(P<0.01), 并有明显的剂量依赖性。结论:地锦草提取
物是通过抑制真菌的麦角甾醇生物合成而发挥其抗真菌活性的。
[ 关键词] 　地锦草提取物;气-质联用;红色毛癣菌;麦角甾醇
[ 中图分类号] R927.2　　[ 文献标识码] A　　[ 文章编号] 1001-5213(2010)12-0992-03
Effect of extracts from Euphorbia humi f usa on ergosterol in Trichophyton rubrum by GC-MS
DAWU TI Gulina
1 , AIBAI Silafu1 , 2 , LI Zhi-jian 2 ,AN Hui-xia3 ,Zhou Fan4(1.Uighur Medicine H ospital of Auton-
omous Region , Urumqi Xijiang 830049 , China;2.Xinjiang Institute of T r aditional Uighur Medicine, Urumqi Xijiang 830049 ,
China;3.Pharmaceutical Co lleg e of Shihezi Unive rsity , Shihezi Xijiang 832000 , China;4.Pharmaceutical Colleg e of Xinjiang
Medical Univ ersity , Urumqi Xijiang 830054 , China)
ABSTRACT:OBJECTIVE　To study the effect of Euphorbia humi f usa ex tract on er go ste rol bio synthe sis in fungus.METHODS
　Rinse , saponifica tion , ex traction and silanization(MSTFA)of the nonsaponifiable lipids (NS Ls)o f Trichophy ton rubrum
w ere trea ted with varied concentrations of Euphorbia humi f usa ex tract.Ergo stero l in the NSLs w as separ ated and its concen-
tra tion as determined by the me thod of GC-MS.RESULTS　Euphorbia humi f usa ex trac t inhibited er go ste rol bio synthesis(P<
0.01)w ith a dose-dependent manner in Trichophy ton rubrum.CONCLUSION　Euphorbia humi f usa ex tract owes remarkable
antifungal activity to its inhibito ry effect on erg ostero l bio synthe sis in fungus.
KEY WORDS:E uphorbia humi f usa ex trac t;GC-MS;Trichophy ton rubrum;erg ostero l
　　红色毛癣菌(Trichophy ton rubrum)是临床常
见的皮肤癣菌 ,也是浅部真菌病的主要病原菌 ,主要
侵犯人的皮肤 、指(趾)甲 、毛发 ,所致癣菌病病程持
久 ,难治愈 ,易复发[ 1] ,69.5%的皮肤癣菌病是由此
菌所致[ 2] 。地锦草为大戟科植物地锦(Euphorbia
hum i f usa Willd.)或斑地锦(Euphorbia maculata
L.)的干燥全草 ,是维吾尔医常用药材 ,临床主要用
于治疗手癣 、体癣 、足癣 、花斑癣 、银屑病[ 3] 。地锦草
提取物具有显著的抗皮肤癣菌作用 ,尤其对红色毛
癣菌最敏感[ 4-6] 。本实验利用气-质联用技术 ,测定
地锦草提取物作用于红色毛癣菌后 ,对其细胞膜成
分麦角甾醇含量的影响 ,以研究其抗真菌作用的机
制 。
1　材料
BHC-1300ⅡA型生物安全柜 ,苏州安泰空气技
术有限公司;XL-Turbomass PerkinElmeer 型气质
联用仪(美国 PE 公司);地锦草于 2007年夏采自新
疆和田 ,由新疆维吾尔医医院制剂科艾尼瓦尔主任
·992· 中国医院药学杂志 2010年第 30卷第 12期 Chin H osp Pharm J , 2010 Jun , Vol 30 , No.12
药师鉴定为大戟科(Euphorbiaceae)植物地锦草;地
锦草提取物(EHE ,新疆维吾尔自治区维吾尔医药
研究所药剂室 , 批号 20080117);红色毛癣菌
(Trichophy ton rubrum , 菌 种 编号:XYZ T .r
40001)[新疆医科大学真菌与真菌病研究中心菌种
保藏库(XYZ)] ;RPMI-1640培养基(Gibco公司 ,批
号 307964);马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA ,北京
奥博星生物科技有限公司 ,批号 20080228);麦角甾
醇标准品(上海晶纯试剂有限公司 ,含量为 98%,批
号 12744);胆固醇对照品(含量为 95%,上海生工生
物工程有限公司 , 批号 080614);甲醇为色谱纯
(Fisher 公司);N-甲基三甲基硅基三氟乙酰胺
(MSTFA , Sigma 公司);0.1 mo l·L-1磷酸盐缓冲
液(pH 7.0);皂化剂为新鲜配制的 10%氢氧化钾
的甲醇溶液;其余试剂均为分析纯。
2　方法
2.1　色谱条件　PE-5MS 柱(30 mm ×0.25 mm ,
0.25μm),柱温:程序升温 125 ～ 300℃,起始温度:
125℃,保持 2 min ,以 3.8 ℃/min速度升至150℃,
以8 ℃/min速度升至300 ℃,保持 18 min;进样口温
度:310 ℃;载气:氦气(99.999%);进样量:0.5 μL;
分流比:60∶1;柱前压:16 psi;电离方式:EI 电离源;
电离电压:70 eV;源温:230℃。利用气-质联用仪的
Nist谱库自动检索组分的质谱数据 ,确定结构和计
算含量 。胆固醇为内标 。
2.2　药物干预[ 7] 　将受试的皮肤癣菌接种于马铃
薯培养基(PDA)上 ,26 ℃培养 7 d ,吸取 2 mL 无菌
的0.85 %氯化钠溶液 ,冲洗菌落表面的菌丝和孢
子 ,将含有菌丝和孢子的冲洗液用血细胞计数板记
数 ,浓度在 l×105 ～ 5×105 cfu·mL-1之间 ,用 RP-
M I-1640培养基稀释 50倍 ,至 2倍终浓度的菌接种
液 。接种时将 100 mL 的 2倍终浓度的药液分别由
高浓度到低浓度加入无菌的三角烧瓶中。生长对照
瓶 ,仅加 100 mL 菌接种液和 100 mL RPMI-1640
培养基 ,不加药物 。空白对照瓶 ,真菌 、药物都不加 ,
只有 200 mL RPMI-1640培养基 。将调好的菌接种
液 100 mL 分别加入含有药液的三角烧瓶中 ,这将
使每一梯度的抗真菌药物和菌接种液(2倍终浓度)
分别被 1∶1稀释到终浓度(64 , 128 , 256 mg·L-1)。
26℃孵育 7 d后 ,离心分离菌丝 ,再迅速进行样品制
备 。
2.3　样品的制备[ 8] 　收集的菌丝用 pH 7.0磷酸缓
冲溶液洗涤 3次至上清液无色 ,离心 10 min(10 000
r·min-1),去上清 ,称各菌湿重。精密称取各组湿菌
1.0 g ,加新鲜配制的皂化剂 15 mL ,混匀 , 80 ℃水
浴皂化 90 min。加石油醚(沸程 30 ～ 60 ℃)15 mL
提取 3 次 ,合并提取液置于 60 mL 分液漏斗中 ,加
水 15 mL 洗涤 ,醚层于60 ℃水浴挥干 ,得未皂化脂
(nonsaponifiable lipids ,NSLs),加环己烷溶解使溶
液体积为 1 mL·g-1湿菌 。
2.4　衍生化条件[ 8-9] 　取 200 μL 试液于1.5 mL 离
心管中 ,在氮气下吹干后 ,加入 50 μL 硅烷化试剂
MSTFA 和 10 μL 吡啶 。混匀后置于60 ℃的保温
箱中反应 30 min ,用氮气吹去残余硅烷化试剂 ,再
精密加入氯仿 100 μL ,充分混匀溶解 ,进样0.5 μL ,
GC-MS分析。
2.5　样品测定　利用内标法对空白菌和不同浓度
EHE处理后的样本中的麦角甾醇进行定量分析 ,选
用胆固醇做内标 ,分别吸取样本 200μL ,加入 50μL
浓度为59.2 mg·L-1的胆固醇混匀后 ,按照上述色
谱条件和衍生条件进行样品的硅烷化和 GC-MS分
析 。
3　结果
3.1　红色毛癣菌未皂化脂气相色谱图　真菌细胞
膜中的麦角甾醇经过硅烷化后进行 GC-MS 分析 ,
各组分可以得到理想的分离效果 ,且峰形和柱效良
好(见图 1)。
图 1　麦角甾醇吸收图谱
A.生长对照菌样品色谱图;B.地锦草提取物作用后菌丝样品色谱
图;1-麦角甾醇吸收峰
Fig 1　ch rom atogram of ergosterol
A.Chromatogram of grow th con t rol fun gus;B.chromatog ram of
fungu s t reated w ith EH E;1-Peak absorp tion of ergosterol
3.2　麦角甾醇的含量 　利用气-质联用仪的 Nist
谱库检索麦角甾醇的质谱数据 ,利用面积归一化法
计算麦角甾醇所占百分比 ,结果见表 1。
表 1　红色毛癣菌中麦角甾醇的含量( x±s , n=5)
Tab 1 　Ergostero l content in trichophy ton rubrum( x±s ,
n=5)
组别 药物浓度/mg·L -1 麦角甾醇相对含量/mg·L-1
生长对照菌 0 7.38±0.07
低剂量组 64 5.91±0.01a
中剂量组 128 5.13±0.08ab
高剂量组 256 2.84±0.14abc
注:与生长对照菌比较 , aP<0.01;与低剂量组比较 , bP<0.01;与中
剂量组比较 , cP<0.01
4　讨论
麦角甾醇是真菌类的特征甾醇 ,是一种重要的
·993·中国医院药学杂志 2010年第 30卷第 12期 C hin Hosp Pharm J , 2010 Jun , Vol 30 , No.12
维生素 D2原[ 10] 。目前报道麦角甾醇的分析方法主
要为薄层色谱法[ 11] 和气相色谱法[ 12] 。薄层色谱虽
然能够分离 ,但结果不直观 ,分离效果不理想 ,定量
不准确 。我们采用 GC-MS 法定量测定了地锦草提
取物作用于红色毛癣菌后 ,对其细胞膜成分麦角甾
醇含量的影响 。该方法简便 、快速 、重复性好 ,为研
究抗真菌药物的作用机制提供了简便 、可靠的方法。
麦角甾醇是真菌细胞膜的重要组成成分 ,可以
通过与磷脂结合 ,稳定膜结构 ,具有调节真菌细胞膜
流动性的功能 ,在确保膜结构的完整性 、与膜结合酶
的活性 、细胞活力 、物质运输等方面起着重要作用。
一旦麦角甾醇缺乏 ,必将引起真菌细胞膜功能异常 ,
甚至发生细胞破裂。因此 ,抑制麦角甾醇的生物合
成必将破坏真菌的细胞膜结构 ,而起到抗真菌作用 ,
麦角甾醇生物代谢途径已成为研究新型抗真菌药物
的重要靶位。本研究采用 GC-MS 法测定了地锦草
提取物作用后红色毛癣菌细胞膜麦角甾醇的含量变
化 。结果表明 ,64 mg·L-1的地锦草提取物作用红
色毛癣菌后 ,即可致红色毛癣菌细胞膜麦角甾醇含
量明显减少(P <0.01),说明地锦草提取物可以显
著抑制红色毛癣菌中麦角甾醇的生物合成。目前 ,
研究较多的咪唑类 、三唑类和丙烯胺类抗真菌药都
是作用在细胞膜麦角甾醇合成通路的不同环节 ,引
起细胞膜麦角甾醇合成减少 ,使细胞膜通透性改变 ,
导致细胞内重要物质丢失而使真菌死亡[ 13-14] 。地锦
草提取物也能抑制红色毛癣菌细胞膜麦角甾醇的生
物合成 ,提示地锦草提取物可能与它们具有类似的
作用靶点 ,或者类似结构的有效成分 ,这些均为今后
研究的方向 。
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[ 收稿日期] 2009-05-24
[ 基金项目] 国家科技支撑计划(编号:2007BAI38B02);国家自然科学基金项目(编号:30873371)　[ 作者简介] 李红艳 , 女 ,博士研究生 ,电
话:0431-86172331 , E-mail:lhyw aiw@163.com　[ 通讯作者] 赵雨 ,男 ,博士 ,教授 ,电话:0431-86172300 , E-mail:cnzhaoyu@yahoo.com.cn
不同产地 、不同生长年限人参 SOD的比较
李红艳 ,赵雨 ,张鑫 ,杨士慧 ,牛放 ,赵大庆　(长春中医药大学 中医药与生物工程研发中心 ,吉林 长春 130117)
[摘要] 　目的:比较不同产地 、不同生长年限人参 SOD活力 , 为人参药材的质量评价和临床应用提供依据。方法:采用改良的
邻苯三酚自氧化法测定各样品 SOD活力 , 采用考马斯亮蓝法测定各样品蛋白含量 , 采用聚丙烯酰胺凝胶电泳及 NBT 显色法
进行各样品酶活显示。结果:不同产地的人参 SOD活力存在很大差别 ,最高为72.20 U·mg -1 ,最低为12.16 U·mg-1 ;4 年和 5
年生人参 SOD活力差别较小。结论:应用 SOD 活性分析方法可以对不同产地人参的质量进行快速 、有效的评价。
[ 关键词] 　不同产地;不同年限;人参;SOD
[ 中图分类号] R93　　[ 文献标识码] A　　[ 文章编号] 1001-5213(2010)12-0994-03
Comparaison on the SOD activity of Panax ginseng from different ages and sources
·994· 中国医院药学杂志 2010年第 30卷第 12期 Chin H osp Pharm J , 2010 Jun , Vol 30 , No.12