全 文 ：中国兽药杂志 2010, 44(11):12 ～ 16/高迎春 ,等　
地锦草等中药提取物对
大肠杆菌耐药消除作用的初步研究
高迎春 1 ,魏秀丽1 ,张传津1 ,苏 梅 1 ,杨修镇 1 ,肖永霞 2 ,都业良 2
(1.山东省兽药质量检验所 ,济南　 250022;2.青岛农业大学 ,山东青岛　 266109)
[收稿日期 ] 2010-05 -28　[文献标识码 ] A　[文章编号 ] 1002-1280(2010)11 -0012-05　[中图分类号 ] S853.72
[摘　要 ] 　对动物源大肠杆菌采用二倍稀释法对氨基糖苷类药物及其他药物进行了 MIC的测
定 ,结果显示对十种西药全部耐药。应用 1 /2MIC的中药提取物对耐药菌株进行了耐药性消除的
初步探索研究 ,结果表明临床多重耐药大肠杆菌用中药提取物作用 24代以后 ,地锦草提取物耐药
消除最强 ,三黄汤提取物次之 ,对某些氨基糖苷类药物的 MIC明显下降。另外 ,对消除前后的细
菌提取质粒 ,扩增氨基糖苷类的耐药基因 ,发现随着 MIC的降低 ,耐药基因的数量也不同程度地
减少和消失 。由此可见地锦草等中药提取物对可移动的耐药基因元件有一定的消除作用 ,对耐
药基因的扩散有抑制作用 。
[关键词 ] 　耐药性;地锦草提取物;消除作用;大肠杆菌
基金项目:十一五国家科技支撑计划重大项目 “抗耐药菌中兽药的研制与开发 ”(2008BADB4B04)的子项目 “中药耐药抑
制剂地锦草提取物及其制剂的研制与开发”(2008BADB4B04-5)
作者简介:高迎春(1957年 -),女 , 研究员 ,从事兽药检验和研究工作。 E-mail:gaoyingchun@ivdc.gov.cn
PrimaryStudyonExtractionsfromHerbaeuphorbiaehumifusae
toEliminateResistanceofEscherichiacoli
GAOYing-chun1 , WEIXiu-li1 , ZHANGChuan-jin1 , SUMei1 , YANGXiu-zhen1 ,
XIAOYong-xia2 , DUYe-liang2
(1.ShandongProvincialVeterinaryMedicineSupervisionInstitute, Jinan250022, China;
2.QingdaoAgriculturalUniversity, Qingdao, Shandong266109, China)
Abstract:DrugsensitivitytestswithdoubledilutionmethodforE.colistrainsthatisolatedfromanimalsshowed
theyhadobviousresistanceto10 of10 kindsofantibioticstested.Withextractionsfrom Herbaeuphorbiae
humifusaeandotherHerbaactingonresistantE.colitoeliminatedrugresistance, resultshowedthatextractions
fromHerbaeuphorbiaehumifusaehavebestelimination, theresistancetoaminoglycosideantibioticsdecline;
extractingplasmidofE.coli, amplificationaminoglycosideresistantgene, foundingasthedeclineMIC,
aminoglycosideresistantgenealsodeclinetoacertianextent.AsaresultextractionsfromHerbaeuphorbiae
humifusaecouldeliminateremovabledrugresistancegeneandcontrolresistanceprevalence.
Keywords:resistance;extractionsfromHerbaeuphorbiaehumifusae;elimination;Escherichiacoli
　　各类氨基糖苷类钝化酶一直是临床大肠杆菌
对氨基糖苷类抗生素产生耐药性的最重要原因 [ 1] 。
近年来 ,出现了一种新的由质粒介导的耐药机制 ,
导致革兰氏阴性杆菌对卡那霉素 、阿米卡星 、妥布
霉素 、庆大霉素等多种临床常用氨基糖苷类药物高
度耐药;它们都介导对 4, 6 -二脱氧链霉胺类高度
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耐药(MIC>512 μg/mL),但是不介导对新霉素 、安
普霉素和链霉素的耐药 。氨基糖苷类钝化酶和甲
基化酶基因位于质粒或染色体上 , 通常由可移动
DNA片段(整合子或转座子)携带 , 质粒的交换和
转座子的转座作用导致耐药基因在同种和不同种
细菌间广泛传播 ,成为临床抗感染治疗的重要问
题 [ 2-3] 。本试验主要选择了临床报道检出率高的
几种氨基糖苷类耐药基因:氨基糖苷乙酰转移酶
(AAC(3)-Ⅱ ,底物庆大霉素 、妥布霉素等)基因
aac(3)-Ⅱ和氨基糖苷类核苷转移酶(ANT(3″)-
Ⅰ ,底物链霉素 、大观霉素)基因 aadA1,以及近年
来检出率不断升高的 16SrRNA甲基化酶基因
rmtB,进行了扩增 ,比较在中药作用压力下的耐药
基因的变化情况 。本文旨在探讨中药在临床应用
中对于耐药基因的消除作用 ,为临床耐药性的消除
奠定基础。
1　材料和方法
1.1　药品和试剂
1.1.1　普通药品和试剂　地锦草 、黄连 、大黄 、黄
芩均购自山东省中医药大学第一附属医院中药大
药房 ,经鉴定均为正品 。盐酸环丙沙星:含量 98%,
批号为 20090608;硫酸新霉素:含量 99.8%,批号
为 20090706;土霉素含量 99.9%批号为 20090905;
头孢噻呋钠含量 88.6%,批号为 20090815;SMZ含
量 100.8%, 批号为 20091006;甲氧苄啶 , 含量
99.7%,批号为 20090916,均由齐鲁动物保健品有
限公 司提 供。大 观霉 素含 量 99.2%, 批号
20090906;阿莫西林含量 99.1%,批号 20090708;庆
大霉素含量 99.6%,批号 20090925;小檗碱含量
99.2%,批号 20090828;利福平含量 98.2%,批号
20091025,均由山东华尔康兽药有限公司提供 。
1.1.2　分子生物学试剂 　TaqDNA聚合酶:
TaKaRaExTaqR★(5 U/μL), 购自宝生物工程 (大
连)有限公司 。 DNA分子量标准:DL2000 (50
ng/μL)、250bpDNAladder购自宝生物工程(大连)
有限公司。分子生物学试剂盒:QIAprepSpin
miniprepKit(250T),购自德国 QIAGEN。
1.1.3　引物　氨基糖苷类钝化酶和 16SrRNA甲
基化酶耐药基因扩增引物 ,由宝生物工程(大连)有
限公司合成(表 1)。
1.2　仪器　96孔微量反应板;水浴震荡培养箱;超
净工作台:苏州净化仪器设备有限公司;冰箱:海尔。
表 1　引物序列
引物名称 核苷酸序列(5 ※3 ) 片段大小 /bp
rmtB F:ACATCAACGATGCCCTCAC 724
16SrRNA甲基化酶 R:AAGTTCTGTTCCGATGGTC
aadA1 F:ACTATCAGAGGTAGTTGGCG 752
核苷转移酶 R:ATTTGCCGACTACCTTGGTG
aac(3)-II F:TACGCGGAAGGCAATAACG 744
乙酰转移酶 R:TCGAACAGGTAGCACTGAG
　注:F上游引物 , R下游引物。
电泳凝胶成像系统 ,英国 UVItec公司。台式高速
离心机 、EppendorfMastercyclerPCR扩增仪 、微量移
液器 ,德国 eppendorf公司 。
1.3　培养基　MH肉汤 、MH琼脂 、LB肉汤 、伊红
美兰琼脂 、麦康凯琼脂培养基 ,均购自浙江杭州天
和微生物试剂有限公司 。
1.4　菌株来源
1.4.1　质控菌株　大肠杆菌 ATCC25922 , 购自浙
江杭州天和微生物试剂有限公司 。 rmtB基因阳性
菌株由华南农业大学兽医学院兽药研制与安全评
价国家重点实验室刘健华副教授惠赠。
1.4.2　样品来源　来自临床禽源和猪源的 10株
已经过鉴定的大肠杆菌 ,本试验室保存 。
1.5　体外抑菌试验(肉汤稀释法)
1.5.1　抗菌药贮备液的配制　本实验室采用水
提 、醇提等方法自制中药提取物:地锦草提取物 、三
黄汤提取物 ,以及地锦草 +三黄汤(1 ∶1)混合提取
物。各提取物均浓缩至每 1 mL相当于生药材
1 000 mg,高压灭菌低温 -20 ℃冰箱保存备用。
兽药储备液的制备 ,参照文献 [ 4]进行配置。
将 10种原料药配制成 5 120 μg/mL的标准贮备
液 ,用过滤器(直径 0.22 μm)除菌 ,置于低温冰箱
避光保存备用 。
1.5.2　培养基的制备　MH肉汤 、LB肉汤 、MH琼
脂 、伊红美兰琼脂 、麦康凯琼脂均按产品说明书配
制 ,高压灭菌备用。
1.5.3　菌液的制备　挑取经鉴定后保存的单菌落
接种于 5 mLMH肉汤管 , 35孵育 16 h。
1.5.4　中药提取物作用细菌前后西药对大肠杆菌
MIC的测定 　以大肠杆菌 ATCC25922作为质控
菌 ,采用微量肉汤 2倍稀释法。无菌操作 ,制备浓
度相当于 0.5麦氏比浊标准的菌悬液 ,约含 1 ×
10
8 ～ 2×108 CFU/mL。经 MH肉汤 1 ∶100稀释后 ,
取 160 μL菌悬液加入到灭菌的 96孔聚苯乙烯板
的每排第 1孔中 ,其余每孔加入 100 μL菌悬液 ,在
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第 1孔加入抗菌药物原液 40 μL混匀 , 然后吸取
100 μL至第 2孔 ,混匀后再吸取 100 μL至第 3孔 ,
如此连续倍比稀释至第 11管 ,并从第 11管中吸取
100 μL弃去 ,第 12管为不含药物的生长对照 。稀
释完毕后 ,将 96孔板置 37 ℃普通空气孵箱中 ,孵
育过夜 16 h后 ,以在小孔内完全抑制细菌生长的
最低药物浓度为 MIC,判断结果。
1.5.5　中药提取物对大肠杆菌最小抑菌浓度
(MIC)的测定　中药对大肠杆菌最低抑菌浓度测
定 。将各种中药提取物稀释成生药比为 1 mL∶
1 000 mg的药液。采用试管二倍稀释法对试验菌
株进行 MIC试验 。
1.6　中药提取物作用耐药大肠杆菌试验　用 MH
肉汤分别将 3种中药提取液稀释为 1 /2MIC的药
液 。分别挑取 10株耐药性大肠杆菌于 4 mL含药
MH肉汤中 ,同时接种到不含药物的 MH肉汤 ,作为
阴性对照 ,分别培养 24 h后再次重复接种传代 ,共
作用 24代。在无药的伊红美兰琼脂平板上连续传
代 3次 , 20% ～ 30%甘油低温保存备用。对中药作
用前后的大肠杆菌进行 10种兽药 MIC的测定 ,比
较作用前后的 MIC的变化 。
1.7　大肠杆菌质粒提取　对药物作用前后的大肠
杆菌进行质粒提取 ,严格按照 QIAprepSpinmini-
prepKit(50T)说明书进行 。
1.8　PCR反应体系和扩增条件　见表 2和表 3。
表 2　PCR反应体系
体系组分 用量 /μL
模板 DNA 2.0
上游引物(10μmol/mL) 1.0
下游引物(10μmol/mL) 1.0
EX-TaqMixture 25.0
灭菌双蒸水加至 50.0
表 3　PCR扩增条件
扩增片段 预变性 变性 退火 延伸 再延伸 循环数
rmtB 95℃,
5min
95℃,
30s
54℃,
30s
72℃,
45s
72℃,
5min 30
aac(3)-II 95℃,
5min
95℃,
30s
54.5℃,
30s
72℃,
30s
72℃,
5min 25
aadA1 95℃,
5min
95℃,
30s
56.5℃,
30s
72℃,
30s
72℃,
5min 25
　　PCR产物的电泳分析:取 5 μLPCR产物进行
1.2%琼脂糖凝胶电泳 。
1.9　PCR产物的序列测定和分析　随机选取一菌
株送 TaKaRa生物技术有限公司进行序列测定 。测
序结果在 GenBank用 blastn进行比对。
2　结果与分析
2.1　规模化养殖场大肠杆菌的耐药性一直是临床
关注的要点 ,本文对病料分离的大肠杆菌进行了耐
药性检测 ,并使用地锦草等中药提取物对其进行耐
药性消除试验 。中药提取物作用前 , MIC测定结果
表明 10株大肠杆菌对 10种药物(阿莫西林 、庆大
霉素 、新霉素 、大观霉素 、土霉素 、头孢噻呋 、小檗
碱 、环丙沙星 、利福平 、SMZ+TMP)100%耐药 [ 4] 。
中药提取物作用耐药大肠杆菌 12代前后以及
阴性对照传代 12代以后 ,大肠杆菌对 10种药物的
MIC变化很小 ,对氨基糖苷类药物及环丙沙星 MIC
降低在 2 ～ 4倍左右 。继续传代 ,当中药提取物作
用耐药大肠杆菌 24代前后以及阴性对照传代 24
代以后 ,对阿莫西林 、利福平 、SMZ+TMP、土霉素 、
小檗碱的 MIC变化很小;但对其他 5种药物的 MIC
变化较大 ,见表 4。
表 4　中药作用前后耐药菌 MIC降低情况汇总表
中药组别 MIC降低 8倍以上的菌株数庆大霉素 新霉素 大观霉素头孢噻呋 环丙沙星
阴性对照 2 /10 3 /10 0/10 1/10 2/10
三黄汤提取物 3 /10 3 /10 2/10 0/10 3/10
地锦草提取物 6 /10 6 /10 5/10 0/10 7/10
混合提取物 3 /10 3 /10 2/10 1/10 5/10
　　实验结果表明 ,地锦草提取物作用大肠杆菌前
后 ,对氨基糖苷类药物(庆大霉素 、新霉素和大观霉
素)的敏感性发生了显著的变化 ,对环丙沙星敏感
性也发生了变化 ,对头孢噻呋的敏感性变化较小 ,
使部分耐药大肠杆菌变为敏感菌。与阴性对照组
相比较 ,地锦草提取物耐药消除作用最强 ,三黄汤
提取物和混合提取物的耐药消除作用较弱。由此 ,
进一步研究中药作用前后氨基糖苷类药物其耐药
基因的变化。另外 ,未加药物的阴性对照组有几株
MIC下降较明显 ,对庆大霉素 、新霉素耐药性自行
下降 。
2.2　PCR产物电泳图谱结果　在相对于 Marker
500 ～ 1000 bp中间各有一 DNA条带 ,其大小与设计的
各种耐药基因的扩增产物长度一致 , PCR扩增成功。
2.3　中药作用前后耐药基因消除情况　见表 5。
由耐药基因的消除率来看 ,地锦草提取物和三
黄汤提取物的消除作用较好 ,混合中药提取物的消
除作用弱一些 ,阴性对照组的耐药基因也减少了一
部分 。可见 ,间歇用药和使用中药在一定程度上都
能消除大肠杆菌的耐药性。
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表 5　中药作用前后耐药基因消除情况汇总表
中药组别 耐药基因消除率aac(3)-I rmtB aadA1
中药作用前 6/10 8 /10 4 /10
阴性对照 2/6 3 /8 2/4
地锦草提取物 4/6 7 /8 4/4
三黄汤提取物 4/6 6 /8 4/4
混合提取物 3/6 6 /8 3/4
2.4　耐药基因的测序结果　aac(3)-I基因测序
结果与 EU022314.1 Escherichiacoli序列 100%同
源 。aac(3)-II编码的钝化酶 AAC(3)-Ⅱ介导
对庆大霉素 、妥布霉素 、萘替米星 、西梭米星耐药 。
国内研究报道 ,大肠埃希氏菌 [ 5-6] ,氨基糖苷钝化
酶基因以 aac(3)-I为主 ,而且 AAC(3)-Ⅱ通
常由质粒介导 。
aadA1基因测序结果与 FJ196387.1 Escherichia
coli序列 99%同源。 aadA1又名 ant(3″)-Ⅰ ,其在
革兰氏阴性菌中无所不在 [ 7] ,通过修饰链霉素的
3″-羟基和大观霉素的 9 -羟基而介导链霉素 、大观
霉素的耐药 ,常分布在非接合性质粒 、接合性质粒 、
转座子 、整合子上 ,并随这些可动遗传因子而传播。
RmtB基因测序结果与 EF158300.1 Escherichia
coliplasmidpMG005 16SribosomalRNAmethylase
(rmtB)gene, 序列 99%同源 。
3　讨 论
3.1　大肠杆菌对多类药物的耐药性与药物的使用
有密切的关系。本实验选择的是从大型养殖场送
检的鸡肝和猪肝病料中分离的高度的耐药菌 ,其对
临床常用的十种兽药全部耐药。这与兽医临床大
量的频繁的使用药物是密切相关的。阴性对照组
对部分抗菌药的敏感性提高 ,表明在无药压力环境
下 ,细菌的某些耐药基因元件可以自动消除 ,某些
药物的耐药性可以部分消失 。因此 ,进一步规范养
殖场用药 ,尽量减少药物使用是降低细菌耐药性的
重要途径 。
3.2　地锦草提取物对大肠杆菌耐药消除作用最
强。从细菌的敏感性和耐药基因的检出率来看 ,都
验证了其在一定程度上能消除耐药大肠杆菌对几
种氨基糖苷类药物的耐药性。三黄汤提取物和混
合提取物的耐药消除作用稍微弱一些。本研究还
处在摸索阶段 ,并将通过更多的实验样本进行消除
实验来验证中药对其他类药物的耐药消除作用。
3.3　遏制耐药基因的转移和扩散迫在眉睫 。首先
要建立系统的耐药性监测系统 ,虽然细菌耐药性监
测不是遏制耐药性传播和蔓延的措施 ,但监测数据
是决定采取措施的依据和检验措施效果的凭证。
应建立健全药物使用监管制度 ,严格控制兽药使用
的品种和剂量。大型的养殖场要通过不断的提高
饲料营养配比 ,饲养环境的改善来预防动物发病 ,
尽可能的减少不必要的用药;在控制疾病时 ,必须
用药的情况下 ,一定要通过药敏试验来筛选有效的
药物 ,避免盲目用药加剧耐药性的蔓延 。
另外 ,要加快新兽药尤其是中药新剂型的研
发 ,缓解耐药基因的扩散和转移 ,以控制或者消除
某类药物的耐药性 。
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中国兽药杂志 2010, 44(11):12 ～ 16/高迎春 ,等　
参考文献:
[ 1] 　李玉红.氨基糖苷类钝化酶耐药机制的研究进展 [ J].国外医
学药学分册 , 2005, 32(3):199 -203.
[ 2] 　陈 琳 ,刘健华 ,陈杖榴.氨基糖苷类药物耐药新机制 -16S
rRNA甲基化酶的研究进展 [ J].中国兽医科学, 2006, 36
(11):935-939.
[ 3] 　ChenLin, ChenZhang-Liu, LiuJian-Hua, etal.Emergence
ofRmtBMethylase-producingEscherichiacoliandEnterbacter
cloacaefrom PigsinChina[ J] .TheJAntimicrobChemother,
2007, 59(5):880-885.
[ 4] 　孙长贵 , 译.抗菌药物敏感性执行标准.第 19版信息增刊
[ S] .2009, 29(1):34-39, 102-104.
[ 5] 　姚 蕾 , 陈 琼 ,胡昌勤 , 等.64株大肠埃希菌对氨基糖苷类抗
生素的耐药表型与钝化酶基因型的分析 [ J] .中华微生物学
和免疫学杂志 , 2005, 25(9):727-732.
[ 6] 　张晓梅 ,王家平 ,糜祖皇.80株大肠埃希菌耐药性及氨基糖苷
类修饰酶基因分析 [ J] .江苏大学学报(医学版), 2006, 16
(3):240-250.
[ 7] 　ShawKJ, HareRS, SabateliFJ, etal.Correlationbetween
AminoglycosideResistanceProfilesandDNA Hybridizationof
ClinicalIsolatesAntimicrob[ J] .AgentsChemother, 1991, 35
(11):2253 -2261.
中国兽医药品监察所近日将举办兽用生物制品批签发申报技术培训班
为进一步保证兽用生物制品的质量 ,促进各兽用生物制品生产企业 、进口兽用生物制品代理机构和注
册机构严格按照 《兽用生物制品批签发管理程序 》规定开展兽用生物制品申报批签发的相关工作 ,中国兽
医药品监察所定于 2010年 11月 29 -30日举办 “兽用生物制品批签发申报技术”培训班 。
1.培训内容包括:
(1)兽用生物制品相关法律法规:《中华人民共和国产品质量法 》(1993年 2月 22日第七届全国人民
代表大会常务委员会第三十次会议通过 ,根据 2000年 7月 8日第九届全国人民代表大会常务委员会第十
六次会议《关于修改 <中华人民共和国产品质量法 >的决定 》修正);《兽药管理条例》(中华人民共和国国
务院令第 404号);《兽药产品批准文号管理办法 》(中华人民共和国农业部令第 45号);《兽药质量监督抽
样规定 》(中华人民共和国农业部令第 6号);《兽药进口管理办法》(中华人民共和国农业部 、中华人民共
和国海关总署令第 2号)。
(2)《兽用生物制品批签发管理程序》(中监所(业务)[ 2010] 58号)、兽用生物制品生产与检验报告填
报技术规范 。
(3)《中国兽药典》(2005年版三部)相关内容 ,以及《中国兽药典 》(2010年版三部)中新增以及修订的
内容 ,包括正文 、通则以及附录部分。
(4)兽用生物制品检验技术的标准化 。
(5)兽用生物制品生产及检验中的关键技术环节 。
2.培训人员
(1)兽用生物制品生产企业中在《兽用生物制品生产与检验报告 》中 “质管部负责人签名 ”栏中签字的
技术人员。质检部或质管部其他技术人员酌情参加 。每家企业限报 2人 ,必须参加考试 ,考试合格后颁发
结业证书。
(2)进口兽用生物制品代理机构的产品报验申请人酌情参加。每家企业限报 1人 ,自愿参加考试 。
(3)进口兽用生物制品注册机构的产品注册负责人酌情参加 ,每家企业限报 1人 ,自愿参加考试。
3.考试范围及形式
考试范围严格控制在培训内容内 。闭卷考试 ,时间为两小时 ,考题采用填空题 、单项选择题 、多项选择
题以及判断题的形式 。满分定为 100分 , 70分为及格线 ,不及格者需要进行补考 。
详细情况见网址:htp://www.ivdc.gov.cn/tz/201011 /t20101102 34668.htm
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