全 文 ：minetheeffectofdiaphoresisandrelievingasthmaoftherawdrug, stir-fryingwithhoneyproduct, stir-fryingwithoutsupplementmaterials
productandtheirpharmacodynamicactionpartsrespectively, thestainingmethodwasusedtoobservetheefectofdiaphoresisofthedrugson
thesudorsecretionofvoixpedisinnormalratsandsprayingwayleduptoalergicasthmawithacecolexandhistamineinguineapigswasused
todeterminetheefectofrelievingasthma.Results:TherawdrugsofEphadraherbhadthestrongestefectofdiaphoresis, themainpharma-
codynamicactionpartsarevolatilizeoilandalcoholextract, whichhadthestatisticsignificantcomparingthecontrolgroup.Thestir-friedwith
honeyproducthadthestrongesteffectofrelievingasthma, themainpharmacodynamicactionpartsarevolatilizeoilandalkaloid, whichhad
thestatisticsignificantcomparingthecontrolgroup.Conclusion:Themoityandcontentofvolatilizeoilandalkaloidhavebeenchangedbe-
causeofprocessing, whichledtothechangeofdiaphoresisandrelievingasthmaeffectsrespectively.
Keywords　 Processing(炮制);Ephedraherb;diaphoresis;relievingashtma
地锦草提取物抗皮肤癣菌的电镜观察＊
李治建 1 ,古力娜·达吾提 2＊＊ ,肖 威1 ,安惠霞 1 ,斯拉甫·艾白 2, 3＊＊
(1新疆石河子大学药学院 ,石河子市　 832000;2新疆维吾尔自治区维吾尔医医院 ,乌鲁木齐市　 830049;3.新疆
维吾尔自治区维吾尔医药研究所 ,乌鲁木齐市　 830049)
　　摘　要　目的:观察地锦草提取物对皮肤癣菌超微结构的影响。方法:参照 NCCLS推荐的 M38-A方案 ,将受试药与皮肤癣菌
26℃共同培养 7 d后分离菌体 ,按常规方法进行样品处理 , 在扫描电镜和透射电镜下观察其细胞表面形态结构变化与细胞内超微结
构变化。结果:扫描电镜下观察地锦草提取物作用于皮肤癣菌后 , 真菌细胞表面皱缩不平 , 有严重皱褶 、破裂现象;透射电镜下可
见 , 真菌细胞壁不完整 ,局部有缺损 ,厚薄不均;细胞膜轮廓不清 , 局部有破损;胞内细胞器损伤严重 , 多见空泡化 , 细胞内成分聚集
成电子密度较高的团块。结论:地锦草提取物作用皮肤癣菌后 , 可使其形态和超微结构发生明显的改变。
　　关键词　地锦草提取物;皮肤癣菌;超微结构
　　红色毛癣菌(Trichophytonrubrum)和石膏样毛癣菌(Tricho-
phytonmentagrophytes)是临床常见的皮肤癣菌 ,也是浅部真菌病
的主要病原菌 ,主要侵犯人的皮肤 、指(趾)甲 、毛发 ,所致癣菌
病病程持久 , 难治愈 , 易复发。 地锦草为大戟科植物地锦 Eu-
phorbiahumifusaWild.或斑地锦EuphorbiamaculataL.的干燥全
草 , 是维吾尔医常用药材 , 临床主要用于治疗手癣 、体癣 、足癣 、
花斑癣 、银屑病。作者 [ 1 , 2]研究发现 , 地锦草提取物具有显著的
抗皮肤癣菌作用 , 尤其对红色毛癣菌和石膏样毛癣菌最敏感。
本实验旨在通过扫描电子显微镜(SEM)和透射电子显微镜
(TEM)观察地锦草提取物作用于皮肤癣菌后对其超微结构的
影响 , 进一步证实其抗真菌活性 , 为其抗真菌作用机制的研究
提供线索。
1　材料与方法
1.1　试验药物　地锦草提取物(DJC)由新疆维吾尔自治区维
吾尔医药研究所药剂室提供 ,提取方法及质量控制参照《中华
人民共和国药品标准维吾尔药分册》中百癣夏塔热片之地锦草
提取方法及质量控制 [ 3] , 用二甲基亚砜(DMSO)溶解制成浓度
为 102400 μg/ml的储存液 , 存于-60℃冰箱备用。 特比奈酚
(Terbinafine, TBF),诺华公司 , 批号:NO.010482,纯度:99.9%,
用 DMSO溶解制成浓度为 16 μg/ml的储存液 , 存于-60℃冰箱
备用。
1.2　菌株　红色毛癣菌(Trichophytonrubrum)1株 , 菌株编号:
XYZT.r40001;石膏样毛癣菌(Trichophytonmentagrophytes)1
株 ,菌株编号:XYZT.m60002;质控菌株:近平滑念珠菌 ,菌株编
号:XYZ5001。本试验所采用的菌株均来自新疆医科大学真菌
与真菌病研究中心菌种保藏库(XYZ)。
1.3 　试剂　RPMI-1640培养基(Gibco);马铃薯葡萄糖琼脂培
养基(PDA),批号:20070825,北京奥博星生物科技有限公司;环
氧树脂(Epon812, DDSA, NMA, DMP-30), SPI-CHEM。
1.4 　仪器　日本 HITACHIHUS-5GB真空喷镀仪;瑞典 LKB-
7800 KNIFEMAKER制刀机;德国 LEICAULTRACUTR超薄切
片机;德国 LEO1430VP扫描电镜;日本 HITACHIH-600型透射
电镜。
1.5　方法
1.5.1　菌接种液的制备　参照美国临床实验室标准化委员会
(NCCLS)推荐的《产孢丝状真菌的液基稀释法抗真菌药物敏感
性试验方案》(M38-A)[ 4] ,将受试的皮肤癣菌接种于马铃薯培
养基(PDA)上 , 26℃培养 7 ～ 14 d。吸取 2 ml无菌的 0.85%的
NaCl溶液 , 冲洗菌落表面的菌丝和孢子 , 将含有菌丝和孢子的
冲洗液用血细胞计数板记数 ,浓度在 1×105 ～ 5×105 cfu/ml之
间 ,用 RPMI-1640培养基稀释 50倍至 2倍终浓度。
1.5.2　DJC的抗真菌作用　参照 NCCLS推荐的 M38-A方
案 [ 4] , 将 100 μl的 2倍于试验浓度的药液分别由高浓度到低浓
度加人无菌的 96孔细胞培养板中 ,第 5孔为生长对照孔(仅加
56 中药药理与临床 2008;24(6)
＊ 基金项目:国家自然科学基金项目(30760308)　　　　＊＊通讯作者
DOI :10.13412/j.cnki.zyy l.2008.06.028
菌接种液和 RPMI-1640培养基 , 不加药物)。第 6孔为空白对
照孔(真菌 、药物都不加 , 只有 RPMI-1640培养基)。将调好的
菌接种液 100 μl分别加入相应的微孔内 , 这将使每一梯度的抗
真菌药物和菌接种液(2倍终浓度)分别被 1:1稀释到终浓度。
26℃孵育 7 d后挑取各孔菌落迅速进行电镜样品制备。
1.5.3　抗真菌作用的质控　参照 NCCLS推荐的 M38-A方
案 [ 4] , 对近平滑念珠菌 XYZ5001进行反复测定 , 其两性霉素 B
的 MIC值 0.5 ～ 4.0 μg/ml, 氟康唑的 MIC值 1.0 ～ 4.0 μg/ml,
5-氟胞嘧啶的 MIC值 0.12 ～ 0.5 μg/ml。每次试验以此菌株为
对照 , 只有当其 MIC值介于其质控范围之内时 , 方认为试验操
作准确可靠。且只有当生长对照孔生长良好 ,空白对照无生长 ,
其它孔随药物浓度升高 , 呈现真菌生长梯度受抑制时 , 方证明
试验成功。
1.5.4　扫描电镜样品制备及观察　将各孔菌丝调出 , 分别置
于无菌的 1.5 ml离心管中 , 4 ℃冰箱中以 3%戊二醛固定 2 h;
PBS溶液洗 3次 , 每次 20 min;再浸泡于 1%锇酸溶液中 , 4 ℃下
2 h左右;用 30%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 100%,
100%系列乙醇各脱水 20 min,丙酮脱水 3次 , 每次 20 min, 临界
点干燥 , 真空镀膜 ,扫描电镜观察。
1.5.5　透射电镜样品制备及观察　样品的固定 、脱水处理等
步骤同扫描电镜 , 脱水处理后 , 环氧树脂 Epon812包埋 , 超薄切
片 , 醋酸铀和柠檬酸铅染色 ,透射电镜观察。
2 　结果
2.1地锦草提取物(DJC)抗红色毛癣菌作用的扫描电镜(SEM)
和透射电镜(TEM)观察
2.1.1红色毛癣菌对照组　未经药物处理的红色毛癣菌 SEM
下观察 , 形态规则 、粗细均匀 、表面光滑饱满 、有分支 、生长良好
(图 1:①)。 TEM下观察 , 菌丝切面的细胞壁完整 、厚薄均匀 、
质地致密;细胞基质均匀 ,密度较大 ,细胞器丰富 , 胞质内清晰可
见细胞核 、线粒体 、脂滴等(图 1:②)。
图 1　红色毛癣菌的 SEM、TEM图
2.1.2　不同浓度 DJC作用后红色毛癣菌超微结构的变化
　　SEM观察:64 μg/ml浓度 DJC作用后 , 红色毛癣菌菌丝形
态基本正常 , 仅有少数菌丝出现表面粗糙 、膨大;128 μg/ml浓
度作用后 , 菌丝形态明显变化 , 菌丝干瘪变形 , 出现多处破坏和
断裂;256 μg/ml药物处理后 , 菌丝普遍出现明显变形膨胀 , 且
可见表层剥离 , 菌丝破裂 ,呈粘糊状 ,细胞内容物流失 , 见图 2。
图 2　DJC对红色毛癣菌的作用(SEM)
①:64μg/ml(200×);②:128μg/ml(1500×);③:250μg/ml(1500×)
　　TEM观察:64μg/mlDJC作用下 ,红色毛癣菌细胞内无明显
变化 ,仅见细胞壁有所增厚;128μg/ml浓度作用后 , 细胞壁剥
脱 、破裂 , 细胞膜皱缩 、破裂 , 细胞外表面有明显高电子致密颗粒
聚集 ,细胞肿胀明显 , 在细胞内可见较多的泡状结构 , 已无完整
的细胞器结构;256 μg/ml浓度作用后 , 细胞壁缺损严重 , 细胞
膜内陷 、破裂 , 细胞基质大部分溶解 、变淡 、消失 、空泡化 , 细胞内
残存多处高电子密度凝集块 ,见图 3。
图 3　DJC对红色毛癣菌的作用(TEM)
①:64μg/ml(3000×);②:128μg/ml(50000×);③:256μg/ml(25000×)
2.1.3 　不同浓度特比奈芬(TBF)作用后红色毛癣菌超微结构
的变化　SEM观察:0.00125 μg/mlTBF浓度作用后 , 红色毛癣
菌菌丝形态基本正常 ,仅有少数菌丝出现表面凹陷;0.0025μg/
ml浓度作用后 , 菌丝形态明显变化 , 干瘪皱缩 , 表面有破裂 , 孢
子表面皱缩 ,有裂纹;0.005 μg/ml浓度作用后 , 菌丝普遍出现
明显变形 ,可见大部分菌丝破裂粘成糊状。
　　TEM观察:0.00125 μg/mlTBF浓度作用后 , 红色毛癣菌细
胞内无明显变化 ,细胞壁 、细胞膜基本正常;0.0025 μg/ml浓度
时 ,细胞膜皱缩 ,胞内容物外漏 、空泡化;当 TBF以 0.005 μg/ml
浓度时 ,可见细胞壁 、细胞膜严重破坏 ,细胞基质密度降低 , 细胞
器溶解 ,消失 , 空泡化。
2.2　 地锦草提取物(DJC)抗石膏样毛癣菌作用的扫描电镜
(SEM)和透射电镜(TEM)观察
2.2.1　石膏样毛癣菌对照组　未经药物处理的石膏样毛癣菌
菌丝 SEM下观察 ,菌丝表面光滑饱满 , 有分支 , 生长良好(图 4:
①)。 TEM观察:菌丝切面的细胞壁完整 , 厚薄均匀 , 胞质内核
区清晰 ,细胞基质较密(见图 4:②)。
图 4　石膏样毛癣菌
①:SEM(8000×);②:TEM(50000×)
2.2.2　不同浓度 DJC作用后石膏样毛癣菌超微结构的变化　
SEM观察:64 μg/mlDJC浓度作用后 , 石膏样毛癣菌菌丝形态
基本正常 ,仅有少数菌丝出现内陷;128 μg/ml浓度作用后 , 菌
丝形态以断裂 、干瘪为主;256 μg/ml高浓度药物处理后 , 菌丝
普遍出现明显变形 、干瘪 、破裂 ,细胞内容物流失 , 见图 5。
图 5　DJC对石膏样毛癣菌的作用(SEM)
①:64μg/ml(8000×);②:128μg/ml(10000×);③250μg/ml(8000×)
57中药药理与临床 2008;24(6)
　　TEM观察:64 μg/mlDJC浓度作用后 , 石膏样毛癣菌细胞
内无明显变化 , 仅见局部细胞壁有所增厚 、质地疏松;128 μg/ml
浓度时 , 细胞壁破坏明显 ,细胞肿胀明显 , 在细胞内可见较大的
空泡状结构 , 有明显高电子致密颗粒聚集 , 细胞基质变淡;256
μg/ml浓度时 ,细胞壁剥脱 、破裂 , 细胞膜凹陷 、大部分消失 , 细
胞基质溶解 , 消失 ,空泡化 , 已无完整的细胞器存在 , 见图 6。
图 6　DJC对石膏样毛癣菌的作用
①:64μg/ml(60000×);②:128μg/ml(35000×);③ 250μg/ml(35000×)
2.2.3　不同浓度 TBF作用后石膏样毛癣菌超微结构的变化
　　SEM观察:0.00125 μg/mlTBF浓度作用后 , 石膏样毛癣菌
菌丝形态基本正常 , 仅有少数菌丝出现表面塌陷 , 孢子表面光
滑;0.0025 μg/ml浓度作用后 , 菌丝形态明显变化 ,粗细不一 ,
缩窄处菌丝干瘪;0.005 μg/ml浓度作用后 , 菌丝普遍出现明显
变形 , 粗细不一 ,以菌丝干瘪为主。
　　TEM观察:0.00125μg/mlTBF浓度作用后 , 石膏样毛癣菌
细胞内无明显变化 , 细胞壁略皱缩 , 细胞膜基本正常 , 细胞器清
晰可见;0.0025 μg/ml浓度时 ,细胞膜塌陷 、破裂 , 内容物外漏 ,
基质开始溶解 、空泡化;0.005 μg/ml浓度时 , 可见细胞膜消失 ,
细胞基质溶解 , 基质密度降低 , 消失 ,空泡化。
3 　讨论
3.1由本试验结果可见 , 从低浓度至高浓度的地锦草提取物作
用于红色毛癣菌和石膏样毛癣菌后 ,先是细胞壁和细胞膜的变
化 ,再出现细胞器 、细胞核损伤 ,直至细胞空泡化坏死。由此推
测 ,地锦草提取物抗真菌的药理作用是破坏真菌细胞壁 ,对细胞
膜也有损伤。其破坏细胞膜的机制可能是通过抑制真菌细胞膜
麦角甾醇的生物合成 ,引起细胞膜的损伤。
3.2电镜下可见特比奈芬作用于真菌后 ,菌丝和孢子明显皱缩
和凹陷 ,表现为细胞膜皱缩 , 逐渐出现细胞膜缺损。特比奈芬为
丙烯胺类抗真菌药 ,可通过抑制真菌的角鲨烯环氧化酶而阻断
真菌细胞膜成分麦角甾醇的合成 ,并使角鲨烯积聚 , 导致质膜脆
性增加 ,干扰和破坏了细胞膜的结构和功能 [ 10] 。
3.3本试验中还见到 , 地锦草提取物作用真菌后胞浆内线粒体
坏死减少。由于线粒体含有多种酶类 , 参与细胞内物质氧化与
形成高能磷酸化合物 ,所以线粒体一旦发生改变或消失 ,细胞呼
吸链和整套酶体系便受到抑制 , 使氧化磷酸化和细胞能量偶联
系统遭到破坏 , 细胞能量提供减少 , 从而影响基因调控和 DNA
的合成 ,导致细胞衰退或死亡。总之 , 本次电镜观察所提供皮肤
癣菌超微结构变化的信息 ,将为进一步揭示地锦草的抗真菌作
用机制奠定基础。
参考文献
1　古力娜·达吾提 ,努尔买买提·艾买提 ,尤丽都孜·买买提 , 等.雅
丽蔓(地锦草)总黄酮体外抗真菌作用研究.中国民族医药杂志 , 2006;
(4)∶ 44 ～ 45
2　古力娜·达吾提 ,尤丽吐孜 , 艾则孜· 亚森 ,等.维药地锦草软膏的
体外抗真菌及其对豚鼠皮肤真菌感染的治疗作用研究.中药药理与临
床, 2007;23(5)∶178～ 180
3　亚森·吐尔逊 ,哈木拉提 ,张彦福 ,等.中华人民共和国卫生部药品
标准维吾尔药分册.新疆科技卫生出版社.1999∶ 124
4　 NationalCommiteeforClinicalLaboratoryStandards.ReferenceMethod
forBrothDilutionAntifungalSusceptibilityTestingofFilamentousFungi;Ap-
provedStandard(M38-A).USA, 2002
ElectronMicroscopicObservationonAntidermatophytesActionofEuphorbiahumifusaExtract
LiZhijian1 , Gulnar· Dawuti2 , XiaoWei1 , AnHuixia1 , Silafu· Aibai2, 3＊＊
(1ShiheziUniversity, Shihezi　 832000;2.UighurMedicineHospitalofAutonomousRegion, Urumqi　830049;
3 XinjiangInstituteofTraditionalUighurMedicine, Urumqi　830049)
　　Objective:ToobservetheefectsofEuphorbiahumifusaextractontheultrastructureofcommonclinicaldermatophytes(Trichophyton
rubrumandTrichophytonmentagrophytes)andtofindoutthepotentialmechanismoftheirantifungalaction.Methods:Appliedthestandard
approvedbytheNationalCommitteeforClinicalLaboratoryStandards(NCCLS):ReferenceMethodforBrothDilutionAntifungalSusceptibili-
tyTestingofFilamentousFungi(M38-A), themixturesofEuphorbiahumifusaextractanddermatophyteswereincubatedat26℃ inconstant
temperaturefosterboxfor7d.Treatedthesampleundertheroutinemethod.Theultrastructureofdermatophyteswasobservedunderscanning
electronmicroscope(SEM)andundertransmissionelectronmicroscope(TEM).Results:AfterexposingtoEuphorbiahumifusaextract, cel
surfacewrinkles, andfoldsandcellbreakagewereobservedunderSEM.Thecellwallwasincomplete, thethicknessofcelwalbecameune-
venandthedensityofthecelwaldecreased, thecelmembranebecamediscontinuouswithTEMobservation.Theorganelessuchasmito-
chondriaandendoplasmicreticulumweredeeplydamaged.Thecytoplasmaaggregatedandsomehighdensityelectronlightareasaswelas
vacuoleswereformed.Conclusion:Euphorbiahumifusaextracthasastrongantifungalefectwhichcanobviouslychangetheconformationand
theultrastructureofdermatophytes.
Keywords　Euphorbiahumifusaextract;dermatophytes;ultrastructure
58 中药药理与临床 2008;24(6)