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地锦草提取物对皮肤真菌麦角甾醇生物合成的影响＊
李治建1 ,斯拉甫 ·艾白 2, 3 ,古力娜 ·达吾提 2 ,安惠霞 1 ,肖　威 1 ,周　凡 4
(1.石河子大学药学院 , 832002;2.新疆维吾尔自治区维吾尔医医院 ,乌鲁木齐　830049;3.新疆维吾尔自治区维
吾尔医药研究所 ,乌鲁木齐　830049;4.新疆医科大学药学院 ,乌鲁木齐　830000)
[摘　要 ] 　目的　研究地锦草提取物对真菌细胞膜中麦角甾醇生物合成的影响。方法　真菌经不同浓度地锦草
提取物作用孵育 7 d后 ,经过皂化 、提取 ,采用高效液相色谱法考察其麦角甾醇的含量变化。结果　地锦草提取物能使
真菌中的麦角甾醇含量下降(P<0.01), 麦角甾醇含量变化有明显的剂量依赖性。结论　地锦草提取物通过抑制真菌
的麦角甾醇生物合成而发挥其高效抗真菌活性。
[关键词 ] 　地锦草提取物;色谱法 ,高效液相;真菌 ,皮肤;麦角甾醇
[中图分类号 ] 　R282.71;R965　　　[文献标识码 ] 　A　　　[文章编号 ] 　1004-0781(2009)06-0830-03
EffectofExtractsfromEuphorbiaHumifusaonErgosterolBiosynthesisinDermatophyte
LIZhi-jian1 , SILAFU· Aibai2, 3 , GULINAR· Dawuti2 , ANHui-xia1 , XIAOWei1 , ZHOUFan4(1.Schoolof
Pharmacy, ShiheziUniversity, Shihezi832002, China;2.UighurMedicineHospitalofXinjiangUighur
AutonomousRegion, Urumqi830049, China;3.InstituteofTraditionalUighurMedicineofXinjiangUighur
AutonomousRegion, Urumqi830049 , China;4.SchoolofPharmacy, XinjiangMedicalUniversity, Urumqi
830000, China)
ABSTRACT　Objective　TostudytheefectofextractsfromEuphorbiahumifusaonergosterolbiosynthesisinfungus.　
Methods　 Thefungiwereincubatedfor7 dwithdiferentconcentrationsofEuphorbiahumifusaextracts, andthecontentof
ergosterolinwhichwasdetectedbyHPLCaftersaponificationandextraction.　Results　Euphorbiahumifusaextractsinhibited
theergosterolbiosynthesis(P<0.01)inadose-dependentmanner.　Conclusion　Euphorbiahumifusaextractshasremarkable
antifungalactivitybyinhibitingtheergosterolbiosynthesisinfungus.
KEYWORDS　Euphorbiahumifusaextracts;HighPerformanceliquidchromatography;Dermatophyte;Ergosterol
　　近年来 ,真菌感染呈持续增多趋势 ,这与肿瘤化
疗 、艾滋病 、器官移植等免疫缺陷患者增多 ,以及介入
治疗 、广谱抗生素 、肾上腺皮质激素和免疫抑制药等广
泛应用密切相关 。红色毛癣菌 (trichophytonrubrum)
是临床常见的皮肤真菌 ,也是浅部真菌病的主要病原
菌 ,主要侵犯人的皮肤 、指(趾)甲 、毛发 ,所致真菌病
病程持久 ,难治愈 ,易复发 [ 1] 。地锦草为大戟科植物
地锦(EuphorbiahumifusaWild.)或斑地锦(Euphorbia
maculataL.)的干燥全草 ,是维吾尔医常用药材 ,临床
主要用于治疗手癣 、体癣 、足癣 、花斑癣 、银屑病 [ 2] 。
古力娜等[ 3]报道 ,地锦草提取物具有显著的抗皮肤癣
菌作用 ,尤其对红色毛癣菌和石膏样毛癣菌最敏感 ,但
作用机制尚不清楚。笔者在本实验中采用高效液相色
谱(HPLC)法 ,检测地锦草提取物作用于红色毛癣菌
后对其细胞膜成分麦角甾醇生物合成的影响 ,以研究
地锦草提取物抗真菌作用的机制。
1　材料与方法　
1.1　药物　地锦草提取物由新疆维吾尔自治区维吾
尔医药研究所药剂室提供(批号:20080117)。提取方
法及质量控制参照《中华人民共和国药品标准-维吾尔
·830· HeraldofMedicineVol.28No.7 July2009
药分册 》中百癣夏塔热片之地锦草提取方法及质量控
制 [ 4] 。用 二 甲亚 砜 (DMSO)溶 解制 成 浓度 为
102.400 mg· mL-1的储存液 , 存于 -60 ℃冰箱备用 ,
实验前用 RPMI-1640培养基稀释至浓度为 128, 256,
512μg·mL-1的 2倍终浓度药液。
1.2　菌种　红色毛癣菌(菌种编号:XYZT.r40001)
由新疆医科大学真菌与真菌病研究中心菌种保藏库
(XYZ)提供。
1.3　试剂　RPMI-1640培养基(Gibco公司);马铃薯葡
萄糖琼脂培养基(PDA),批号:20070825,北京奥博星生
物科技有限公司;85%麦角甾醇标准品(BBI公司);甲
醇为色谱纯(Fisher公司),其余试剂均为分析纯。
1.4　仪器　FM型生化培养箱 ,上海福玛实验设备有
限公司;BHC-1300ⅡA型生物安全柜 ,苏州安泰空气
技术有限公司;Waters2487双波长 UV检测器 、Waters
1525泵 、Waters1500系列柱温箱和 Breeze色谱数据处
理工作站(美国 Waters);CINTRA型紫外分光光度计
(澳大利亚 GBC)。
1.5　方法　
1.5.1　色谱条件　色谱柱 WaterssymmetryshieldTM
RP(4.6 mm×150 mm, 5 μm),柱温:30 ℃;流动相:
100%甲醇;检测波长:282 nm;流速:1.0 mL· min-1;
进样量:20 μL。
1.5.2　样品的制备　参照美国临床实验室标准化委员
会(NCCLS)推荐的 《产孢丝状真菌的液基稀释法抗真菌
药物敏感性试验方案》(M38-A)[ 5] ,将受试的皮肤癣菌
接种于马铃薯培养基(PDA)上 , 26 ℃培养 7 d,吸取无
菌的 0.85%氯化钠溶液 2 mL,冲洗菌落表面的菌丝和
孢子 ,将含有菌丝和孢子的冲洗液用血细胞计数板记
数 ,浓度在 1×105 ～ 5×105 cfu· mL-1之间 ,用 RPMI-
1640培养基稀释 50倍至 2倍终浓度的菌接种液。将 2
倍终浓度的菌接种液 100 μL分别加入到 4个无菌的 96
孔细胞培养板微孔内 ,然后在 1号板各微孔中分别加入
RPMI-1640培养基 100μL,在 2 ～ 4号板各微孔中分别
[收稿日期 ] 　2008-10-10　　　[修回日期 ] 　2008-12-29
[基金 项目 ] 　＊ 国家 科 技支 撑 计划 (基 金 编号:
2007BAI30B03)、国家自然科学基金资助项目(基金编号:
30760308)。
[作者简介 ] 　李治建(1982-),男 ,河南商丘人 ,在读硕士 ,
从事药理学研究。电话:(0)15981799975, E-mail:lizhijian0220@
126.com。
[通讯作者 ] 　斯拉甫·艾白(1960-), 男, 维吾尔族 ,新疆
伊犁人 ,主任药师 ,硕士生导师 , 主要从事药理和毒理学研究。
电话:0991-2563702。
加入浓度为 128, 256, 512μg· mL-1的药液 ,使不同浓度
的药物和菌接种液分别被 1：1稀释到终浓度(64, 128,
256μg·mL-1)。 26℃孵育 7 d后挑取各孔菌落迅速进
行样品制备 ,收集到的菌落转入离心管中 , pH值 7.0磷
酸缓冲溶液洗涤 3次至上清液无色 , 离心 10 min
(10 000r·min-1 , r=10 cm),去上清液 ,称各菌湿重。
精密称取各组湿菌 1.08 g,加皂化剂(新鲜配制的含
10%氢氧化钾的甲醇溶液)15 mL,混匀 , 80℃水浴皂化
90min。加石油醚(沸程 30 ～ 60℃)15mL提取 3次 ,合
并提取液置于 60 mL分液漏斗中 ,加水 15 mL洗涤 ,醚
层于 60 ℃水浴挥干 , 得未皂化脂 (nonsaponifiable
lipids, NSLs)[ 6] ,未皂化脂用甲醇溶解 ,定容至 10mL,经
孔径 0.45μm微孔滤膜过滤 。在 “1.5.1”项色谱条件下
测定各样品中麦角甾醇的峰面积 ,计算样品中麦角甾醇
的浓度及菌丝中麦角甾醇的含量。
1.5.3　统计学方法　使用 PEMS3.1统计软件 ,比较
生长对照组和不同浓度地锦草提取物干预组菌丝中麦
角甾醇含量的差异 ,评价地锦草提取物对红色毛癣菌
中麦角甾醇生物合成影响的程度。
2　结果　
2.1　检测波长的选择　文献报道麦角甾醇紫外检测
波长为 282nm[ 6, 7] ,利用紫外分光光度计对麦角甾醇
标准品(4mg·L-1)进行紫外光(190 ～ 700 nm)扫描 ,
结果麦角甾醇在 282nm处具有最大吸收峰 ,本实验选
择 282nm作为检测波长 。
2.2　流动相的选择　检测麦角甾醇常用的流动相为
甲醇 、甲醇-水等洗脱系统 。本实验考察了不同比例的
甲醇-水作为流动相的差别 ,结果甲醇在流动相中的比
例越高 ,不但出峰时间相对提前 ,其响应值也相对提
高 ,故本研究选用 100%甲醇作为流动相 ,麦角甾醇的
保留时间为 8.9min,柱效和峰形良好 。
2.3　线性范围及检出限　将麦角甾醇标准品准确配
制成 29.75, 14.88, 7.44, 3.72, 1.86和 0.93 mg· L-1
系列浓度的溶液 ,按照 “1.5.1”项条件进行分析测定 ,
以色谱峰面积(S)为纵坐标 ,进样浓度(mg· L-1)为横
坐标进行回归 ,回归方程为:Y=39 004X+2 422.3,
r=0.999 8,麦角甾醇在 0.93 ～ 29.75 mg· L-1浓度范
围内具有良好的线性关系 。取麦角甾醇的标准母液不
断稀释 ,稀释液一次进样 20 μL,当麦角甾醇的检测信
号为 3倍噪音信号时 ,测得麦角甾醇最低检出浓度为
0.008 mg·L-1。
2.4　回收率　在不含菌丝的空白 RPMI-1640培养基
中加入麦角甾醇标准母液 ,使得麦角甾醇浓度分别为
3.5, 7.0和 14.0mg·L-1 ,按照上述样品的制备和分析
·831·医药导报 2009年 7月第 28卷第 7期
步骤 ,进行添加回收率实验 ,每个浓度重复 3次 。麦角
甾醇的平均回收率为 94.8% ～ 96.3%, RSD为
1.8% ～ 3.3%。
2.5　稳定性 、重复性和精密度　将样品溶液在室温下
贮存 ,于 0, 0.5 , 2.0, 4.0, 6.0, 12.0, 24.0 h测定 ,结果
样品溶液在 24h内稳定 , RSD为 1.3%。精密称取生
长对照菌丝 5份 ,每份 0.5 g,按照上述样品的制备和
分析步骤 ,测定峰面积 , RSD为 2.8%。将 7.0 mg·L-1
麦角甾醇对照品 ,按 “ 1.5.1”项色谱条件 ,重复进样 5
次 ,结果精密度良好 , RSD为 0.62%。
2.6　菌丝样品中麦角甾醇含量　按照上述样品的制
备和分析条件 ,测定了 4批菌丝样品 ,结果见表 1。样
品中麦角甾醇的保留时间在 8.9min,与麦角甾醇标准
品一致 。
　　表 1　生长对照和不同浓度地锦草提取物处理后红色毛
癣菌菌丝中麦角甾醇的含量　 x±s
组别 药物浓度 /(μg· mL-1)
样品(NSLs)中麦角甾醇
的浓度 /(mg· L-1)
菌丝中麦角甾醇
含量 /(μg· g-1)
地锦草提取物
　低剂量组 64 16.74±0.00 155.31±0.02＊1
　中剂量组 128 14.37±0.02 133.41±0.22＊1＊2
　高剂量组 256 9.68±0.05 89.65±0.43＊1＊2＊3
生长对照组 0 20.62±0.00 191.01±0.04
　　与生长对照组比较 , ＊1P<0.01;与地锦草提取物低剂量组
比较 , ＊2P<0.01;与地锦草提取物中剂量组比较 , ＊3P<0.01
3　讨论 　
目前报道麦角甾醇的分析方法主要为薄层色谱
法 [ 8]和气相色谱法 [ 9] 。薄层色谱虽然能够分离 ,但结
果不直观 ,分离效果不理想 ,定量不准确;因甾醇类的
沸点较高 ,直接用气相色谱法分析则存在拖尾后峰型
展宽等问题 ,通过硅烷化衍生进行测定 ,方法比较繁
琐 [ 9] 。笔者以 HPLC法 ,定量测定了红色毛癣菌中麦
角甾醇的含量 ,收到了较理想的效果 。该方法简便 、快
速 、重复性好 ,为研究抗真菌药物的作用机制提供了更
简便 、可靠的方法 。
麦角甾醇是真菌细胞膜的重要结构组成成分 ,可
以通过与磷脂结合稳定膜结构 ,具有调节真菌细胞膜
流动性的功能 ,在确保膜结构的完整性 、与膜结合酶的
活性 、细胞活力以及物质运输等方面起着重要作用。
一旦麦角甾醇缺乏 ,必将引起真菌细胞膜功能异常 ,甚
至发生细胞破裂 。因此 ,抑制麦角甾醇的生物合成必
将破坏真菌的细胞膜结构 ,而起到抗真菌作用 ,麦角甾
醇生物代谢途径已成为研究新型抗真菌药物的重要靶
位 。笔者在本研究中采用 HPLC法测定了地锦草提取
物作用后红色毛癣菌细胞膜麦角甾醇的含量变化。结
果表明 ,地锦草提取物作用红色毛癣菌后 ,可使真菌细
胞膜麦角甾醇含量明显减少(P<0.01),说明地锦草
提取物可以显著抑制红色毛癣菌中麦角甾醇的生物合
成 。目前研究较多的咪唑类 、三唑类和丙烯胺类抗真
菌药都是作用在细胞膜麦角甾醇合成通路的不同环
节 ,引起细胞膜麦角甾醇合成减少 ,使细胞膜通透性改
变 ,导致细胞内重要物质丢失而使真菌死亡 [ 10] 。地锦
草提取物也能抑制红色毛癣菌细胞膜麦角甾醇的生物
合成 ,提示地锦草提取物可能与它们具有相同的作用
靶点 ,或者地锦草提取物中有与它们相同结构的有效
成分 ,这些都是今后研究的方向 。
[ DOI] 　10.3870/yydb.2009.07.002
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