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毷维吾尔医药
地锦草有效部位对红色毛癣菌羊毛甾醇生物合成的影响*
赵明月1，李治建2＊＊，古力娜·达吾提3，斯拉甫·艾白3＊＊
( 1新疆石河子大学 药学院，石河子 832000; 2新疆维吾尔自治区维吾尔医药研究所，乌鲁木齐 830049;
3新疆维吾尔自治区维吾尔医医院，乌鲁木齐 830049)
摘 要 目的:研究地锦草有效部位对红色毛癣菌中羊毛甾醇含量的影响。方法:样品在 24 孔板中培养七天，经皂化提取、
甲醇定容后，采用高效液相色谱法进行定量测定。结果:地锦草有效部位浓度最小为 32 μg /ml能使真菌中的羊毛甾醇含量发生蓄
积( P ＜ 0． 01) ，在 32 μg /ml ～ 128 μg /ml之间有明显的剂量依赖性。结论:地锦草有效部位可使真菌中羊毛甾醇蓄积，导致细胞膜麦
角甾醇的合成受阻来发挥其抗真菌作用。
关键词 地锦草有效部位;红色毛癣菌;羊毛甾醇;高效液相色谱法
近年来，真菌感染的发病率呈现出增多的趋势，这与艾滋
病、器官移植、肿瘤化疗等免疫缺陷患者增多，以及广谱抗生素、
介入治疗、免疫抑制药和肾上腺皮质激素等广泛应用密切相
关。羊毛甾醇是真菌细胞膜麦角甾醇合成过程中的一个重要
中间甾醇，其含量的多少会影响细胞膜的合成，是研究抗真菌
药物作用靶点的重要甾醇之一［1］。红色毛癣菌 ( Trichophyton
rubrum) 是目前临床上常见的皮肤癣菌，也是主要导致浅部真菌
病的病原菌，红色毛癣菌引起的皮肤癣菌病约占临床上 69．
5%，是目前国际上重点研究和防治的皮肤癣菌［2］。本实验采
用高效液相色谱法，检测地锦草有效部位作用于红色毛癣菌后
对其羊毛甾醇生物合成的影响，以探讨地锦草有效部位抗真菌
的作用机制。
1 材料与方法
1． 1 试验药物 地锦草有效部位( EHE，批号: 20121225 ) ，由
新疆维吾尔自治区维吾尔医药研究所实验室自制。乙醇回流
提取三次，醇提物经大孔树脂吸附得有效部位。采用高效液相
色谱法，测定有效部位中鞣花酸含量为 159． 6 mg /g。用二甲基
亚砜( DMSO) 溶解制成浓度为 102． 4 mg /ml 的储存液，于-80℃
冰箱保存备用，实验前用 RPMI-1640 培养基稀释至浓度为 64、
128、256μg /ml的 2 倍终浓度药液。
1． 2 菌种 红色毛癣菌( Trichophyton rubrum，菌种编号: XYZ
T． r 40015) ，由新疆医科大学真菌与真菌病研究中心菌种保藏
库( XYZ) 提供。
1． 3 试剂 RPMI-1640 培养基，批号: N × A0547，赛默飞世尔
生物化学制品北京有限公司; 马铃薯葡萄糖琼脂培养基
( PDA) ，批号: 20110808，北京奥博星生物科技有限公司;羊毛甾
醇标准品( ChromaDex公司) 。
1． 4 仪器 LC-20AB液相色谱仪( 日本岛津公司) ，CBM-20A
二极管阵列检测器 CTO-20A柱温箱和 LCsolusion色谱工作站。
1． 5 方法
1． 5． 1 色谱条件 色谱柱: Waters symmetry shieldTMRP C18
( 4． 6 mm × 150 mm，5μm) ，柱温 35℃ ;流动相:甲醇∶ 水 = 90∶
10;检测波长: 210 nm;流速: 1． 0 ml /min;进样量: 20 μl。
1． 5． 2 样品的制备 参照美国临床实验室标准化委员会( NC-
CLS) 推荐的《产孢丝状真菌的液基稀释法抗真菌药物敏感性试
验方案》( M38-A) ［3］，将红色毛癣菌菌接种于马铃薯培养基
( PDA) 上，26 ℃培养七天，吸取 2 ml 无菌的 0． 9 %的 NaCl 溶
液，冲洗菌落表面的菌丝和孢子，将含有菌丝和孢子的冲洗液用
血细胞计数板记数，浓度在 l × 105 ～ 5 × 105 cfu /ml 之间，用 RP-
MI-1640 培养基稀释 50 倍至 2 倍终浓度的菌接种液。将 2 ml
的 2 倍终浓度的菌接种液分别加入到 4 个无菌的 24 孔细胞培
养板内，在 1 号板各微孔中分别加入 2 ml RPMI-1640 培养基，为
空白菌对照组;在 2 ～ 4 号板各微孔中分别加入 2 ml浓度为 64、
128、256μg /ml的药液，这将使不同浓度的药物和菌接种液分别
被 1: 1 稀释到终浓度( 32、64、128μg /ml) 。26℃孵育 7 d后挑取
各孔菌落转入离心管中，用 pH 7． 4 磷酸缓冲溶液洗涤 3 次至上
清液无色，离心 10 min( 10000 rpm) ，去上清，称各菌湿重。精密
称取湿菌 3． 5g，加新鲜配制的 10% KOH 的甲醇溶液 20ml，混
匀，80 ℃水浴皂化 100min。加石油醚( 沸程 30 ～ 60 ℃ ) 20ml回
流提取 3 次，提取液置于分液漏斗中，加水 20ml 洗涤，醚层于
60 ℃水浴挥干，得未皂化脂( nonsaponifiable lipids，NSLs) ［4］，未
皂化脂用甲醇溶解定容至 5ml，0． 45 μm 有机微孔滤膜过滤。
在 1． 5． 1 色谱条件下测定样品中羊毛甾醇的峰面积，计算样品
中羊毛甾醇的浓度，并计算菌丝中羊毛甾醇的含量。
2 结果
2． 1 线性范围及检出限 将羊毛甾醇标准品配制成 10． 0、7．
0、5． 0、2． 5、0． 5 及 0． 1μg /ml系列浓度的溶液，按照 1． 5． 1 条件
进行分析测定，以色谱峰面积( S) 为纵坐标，进样浓度为横坐标
( μg /ml) 进行回归，回归方程为: Y =55601X + 163403，相关系数
为 0． 9981，羊毛甾醇在 0． 1 ～ 10． 0 μg /ml 浓度范围内具有良好
的线性关系，且菌丝样品中羊毛甾醇的浓度包含在这个线性范
围。因此，可以作为菌丝样品中羊毛甾醇含量的定量分析标准
241 中药药理与临床 2012; 28( 3)
* 基金项目 国家自然科学基金项目( 81160557; 81060370) ;新疆维吾尔自治区自然科学基金资助项目( 2011211B52) 。 ＊＊通讯作者
曲线。取羊毛甾醇的标准母液不断稀释，一次进样 20μl，当羊
毛甾醇的检测信号为 3 倍噪音信号时，测得羊毛甾醇最低检出
浓度为 0． 05 μg /ml。
2． 2 回收率 将羊毛甾醇标准母液加入在空白 RPMI-1640 培
养基中，使得羊毛甾醇浓度分别为 1． 0、3． 0 和 4． 5μg /ml，按照
上述样品的分析步骤，进行添加回收率实验，各个浓度进样 3
次。羊毛甾醇的平均回收率为 93． 7%，RSD为 1． 9% ( n = 3) 。
2． 3 稳定性、重复性和精密度 室温下贮存的样品溶液，于 0，
0． 5，2． 0，4． 0，6． 0，12． 0，24． 0 h测定，结果样品溶液在 24 h内稳
定，RSD为 1． 9 %。精密称取空白菌丝 5 份各 1． 0 g，按照上述
样品的制备和分析步骤，测定峰面积，RSD 为 2． 3 %。取 6．
0μg /ml羊毛甾醇对照品，按 1． 5． 1 色谱条件，重复进样 5 次，结
果显示精密度良好，RSD为 0． 7%。
2． 4 菌丝样品中羊毛甾醇含量 按照上述样品的制备和分析
条件，测定各组菌丝样品，结果见表 1; 样品中羊毛甾醇的保留
时间为 12． 1 min，与羊毛甾醇标准品一致，色谱图见图 1。
表 1 空白菌对照组和不同浓度的 EHE 处理后红色毛癣菌菌丝中
羊毛甾醇的含量( 珋x ± s，n = 3)
组别
剂量
( μg /ml)
菌株数
( 株)
样品中麦角甾醇
的浓度( μg /ml)
菌丝中麦角甾醇
含量( μg /g湿菌)
空白菌对照组 3 4． 26 ± 0． 01 6． 01 ± 0． 02
地锦草有效部位 32 3 1． 45 ± 0． 01 1． 07 ± 0． 01＊＊
地锦草有效部位 64 3 2． 60 ± 0． 02 2． 71 ± 0． 21＊＊
地锦草有效部位 128 3 3． 46 ± 0． 05 5． 98 ± 0． 36＊＊
＊＊ P ＜0． 01 vs 空白菌对照组
A:羊毛甾醇标准品; B:菌丝样品; C:溶剂图谱; 1．羊毛甾醇在 210 nm下的吸收图谱
图 1 各样品色谱图谱
3 讨论
麦角甾醇的生物合成途径，是一个多酶参与的复杂代谢过
程［5，6］。其生物合成途径如图 2 所示，其中羊毛甾醇为细胞膜
CYP51酶的底物，也是真菌细胞膜麦角甾醇合成中的重要中间
甾醇，一旦羊毛甾醇代谢异常，必将引起真菌细胞膜功能异常，
甚至发生细胞破裂或死亡。安慧霞、李治建［7］等采用透射电镜
观察地锦草有效部位作用于红色毛癣菌后，可使其超微结构和
形态明显发生改变; 通过高效液相色谱法检测药物作用后，红
色毛癣菌中细胞膜中麦角甾醇含量与其生长对照菌比，含量降
低，具有显著性差异，并且有明显的剂量依赖性。另有研究结果
表明，药物浓度增大，白念珠菌麦角甾醇含量减少，羊毛甾醇成
分有明显累积［8］。本研究结果表明，随着药物浓度的升高，导
致红色毛癣菌中羊毛甾醇蓄积，与文献报道一致。安慧霞、李治
建［9］等研究发现，地锦草提取物为 256μg /ml 时，红色毛癣菌中
角鲨烯环氧化酶的活性可被显著降低( P ＜ 0． 01) 。角鲨烯环氧
化酶可催化全反式角鲨烯 2，3-双键的立体专一性环氧化反应，
使角鲨烯环氧化，从而易于成环，在角鲨烯转化为羊毛甾醇刚
性甾环的过程中起着重要作用。本研究结果显示，药物浓度升
高羊毛甾醇含量累积，但其含量均低于空白菌，可能是由于药
物抑制了此酶的活性，从而导致羊毛甾醇合成受阻，故含量均
低于空白菌丝组。
图 2 真菌麦角甾醇的生物合成途径
影响羊毛甾醇的生物合成会导致真菌细胞膜麦角甾醇的
合成异常，必将破坏真菌的细胞膜结构，而起到抗真菌作用。目
前，羊毛甾醇生物代谢途径已成为研究新型抗真菌药物的重要
靶位之一。本研究采用高效液相色谱法，测定了地锦草有效部
位作用后红色毛癣菌细胞膜羊毛甾醇的含量变化。结果表明，
地锦草有效部位作用红色毛癣菌后，可使真菌羊毛甾醇含量明
显增多( P ＜ 0． 01) ，说明地锦草有效部位可显著影响红色毛癣
菌中羊毛甾醇的生物合成。目前研究较多的丙烯胺类、三唑类
和咪唑类抗真菌药都是作用在细胞膜麦角甾醇合成通路的不
同环节，其中氮唑类能够竞争性抑制真菌羊毛甾醇 14α-去甲基
341中药药理与临床 2012; 28( 3)
化酶，阻断依赖 P45014DM的羊毛甾醇 14α-甲基的羟基化反应，
导致真菌中羊毛甾醇含量蓄积，致真菌细胞膜成分麦角甾醇缺
乏，使真菌细胞膜合成受阻从而使细胞发生破裂甚至死亡 ［2］。
目前报道甾醇的分析方法主要为气相色谱法［10］和薄层色
谱法［11］。因甾醇类的沸点较高，用气相色谱法直接分析则存在
拖尾后峰型展宽等问题，若通过硅烷化衍生进行测定，方法比
较繁琐［12］;薄层色谱法虽然能够分离，但分离效果不理想并且
结果不太直观，定量也不够准确。本实验以 HPLC法，定量测定
了红色毛癣菌菌中羊毛甾醇的含量，收到了较理想的效果。文
献报道羊毛甾醇在 205 ～ 210 nm ［13］有最大吸收波长，因为波长
越大杂峰越少并且峰型也较好，本实验对羊毛甾醇标准品的甲
醇溶液利用紫外分光光度计，进行紫外( 190 ～ 700 nm) 扫描，故
本实验选择 210 nm作为检测波长。检测甾醇类物质常用的流
动相为甲醇、甲醇-水、乙腈等洗脱系统。本实验考察了不同比
例的甲醇-水作为流动相的异同，结果甲醇与水的比例为 90 ∶
10 时，不但响应值相对提高并且出峰时间也相对提前，峰型也
较好，故本研究选用甲醇∶ 水 = 90∶ 10 作为流动相。该方法快
速、简便、重现性好，可以用于测定红色毛癣菌中羊毛甾醇的含
量，并且本实验为研究抗真菌药物的作用机理提供了更简便、
可靠的方法。
本研究采用高效液相色谱法，研究地锦草有效部位作用后
对红色毛癣菌中羊毛甾醇含量的影响。结果表明，地锦草有效
部位能使红色毛癣菌细胞膜中羊毛甾醇蓄积，提示地锦草有效
部位可作用于羊毛甾醇合成麦角甾醇的生物途径的某个环节，
从而影响细胞膜的生物合成，具体作用机制有待于进一步深入
研究。
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菌丝中麦角甾醇和羊毛甾醇的含量．分析化学，2007; 35( 2) ∶ 255 ～ 258
Effect of Euphorbia humifusa extract on lanosterol biosynthesis in dermatophyte
Zhao Mingyue1，Li Zhijian2，Gulnar·Dawuti3，Silafu·Aibai3
( 1 Shihezi University，Shihezi 832000; 2 Institute of Xinjiang Traditional Uighur Medicine，Urumqi 830049;
3 Xinjiang Uighur Medicine Hospital，Urumqi 830049)
Objective: To study the effect of Euphorbia humifusa extract on lanosterol biosynthesis in fungus． Methods: The sample was analyzed af-
ter saponifing，extracting and methanol voluming． Results: Euphorbia humifusa extract inhibited lanosterol biosynthesis with a dose-dependent
manner during 32 ～ 128μg /ml in fungus． Conclusion: Euphorbia humifusa extract has remarkable antifungal activity because of its accumula-
tion on lanosterol biosynthesis in fungus．
Key words Euphorbia humifusa(地锦草) ; lanosterol; high efficiency liquid chromatography
土大黄提取物中蒽醌类成分的含量测定及其对 ECV- 304 细胞的增值作用*
张 燕1，李治建2，3，夏木西努尔·肖盖提4，艾克拜尔·安扎尔4，斯拉甫·艾白2，3，4＊＊
( 1 新疆石河子大学药学院，石河子 832000; 2新疆维吾尔自治区维吾尔医药研究所，乌鲁木齐 830049;
3新疆维吾尔医方剂学实验室，乌鲁木齐 830049; 4新疆维吾尔自治区维吾尔医医院·国家中医药管理局维医
白癜风诊治重点研究室，乌鲁木齐 830049)
摘 要 目的:探讨土大黄不同乙醇提取物对 ECV-304 细胞的生长抑制作用。方法:采用 HPLC法测定土大黄提取物中蒽醌
441 中药药理与临床 2012; 28( 3)
* 基金项目: 国家自然科学基金资助项目( 81060314) ＊＊通讯作者