全 文 ：第 28 卷第 3 期
2005年 9 月 　　　　　
辽宁师范大学学报(自然科学版)
Journal of Liaoning Normal Unive rsity (Natural Science Edition)　　　　　
Vo l. 28　No . 3
Sep. 　2005
　　文章编号:1000-1735(2005)03-0339-03
土槿皮对红色毛癣菌的抑菌作用及其超微结构的研究
唐金花1 , 　张薪薪1 , 　刘　伟2 , 　王关林1
(1.辽宁师范大学 生命科学学院 ,辽宁 大连　116029;2.通化师范学院 生物系,吉林 通化　134002)
摘　要:采用药基混合法和液体稀释法对红色毛癣菌进行敏感性实验;观察药物作用下红色毛癣菌的超微结构变化.
结果发现土槿皮水提物对红色毛癣菌菌丝有明显的抑制作用 ,抑菌效果与浓度呈正相关;最小抑菌浓度(MIC)为
1 mg /mL;透射电镜观察到药物作用下红色毛癣菌菌丝细胞壁明显增厚 ,细胞质及细胞器内部物质被降解 ,出现空腔 ,
残留不规则膜结构.认为土槿皮对红色毛癣菌有强烈的抑制作用 ,有代替抗生素治疗皮肤癣症的应用潜力.
关键词:土槿皮;红色毛癣菌;抑菌作用;超微结构;最小抑菌浓度
中图分类号:Q949. 95　　　文献标识码:A
真菌病的发病率日益增加 ,由红色毛癣菌引发的体癣 、股癣 、手足癣 、甲癣 、脓癣等病例也时见报道.
临床上应用的抗真菌药物(Amphotericin B 、黄霉素酮康唑 、硝酸益康唑等)对红色毛癣菌引发的病症有
一定疗效 ,但从高效低毒 、耐药性方面均不能令人满意.近年来 ,国内外学者十分重视中药对癣症的治
疗 ,做了大量研究工作 ,试图找到理想的低毒高效中药[ 1 ～ 4] . 土槿皮(Pseudolarix kaemp f eri Gord)又
名土荆皮 、金钱松 、水松皮 、荆树皮 ,来源于松科植物金钱松的树皮和近树皮. 最早见于清代赵学敏所著
《本草纲目拾遗》,性辛 、温 、有毒 、止痒杀虫 ,用于治疗癣症[ 5] . 笔者通过药基混合法和液体稀释法试验 ,
发现土槿皮对红色毛癣菌有较好的抑制作用;通过对药物作用后红色毛癣菌超微结构的观察 ,分析了可
能的抑菌机制 ,对临床应用具理论指导作用.
1　材料与方法
1. 1　实验材料
1. 1. 1　土槿皮水提物　取土槿皮(购自大连医药公司)50 g ,粉碎 ,过 200目筛 ,用 5倍量蒸馏水冷浸 3
次 ,每次 24 h ,合并提取液 ,减压浓缩成浸膏状 ,计算其出膏率为 7. 35%,置 4 ℃冰箱中备用.
1. 1. 2　实验菌株 　红色毛癣菌 Trichopyhton rubrum 由大连医科大学附属第一医院提供.
1. 1. 3　培养基 　沙氏培养基(Sabouraud’ s medium):1%蛋白胨 , 4%葡萄糖.
1. 2　实验方法
1. 2. 1　药液稀释 　将土槿皮水提物所得浸膏用沙氏液体培养基溶解 ,并稀释成 5个浓度 ,药物终浓度
分别为 10 ,5 ,1 ,0. 5 ,0. 1 mg /mL.
1. 2. 2 　菌悬液制备 　刮取红色毛癣菌菌丝体 ,加入无菌生理盐水 ,研磨 ,至形成菌悬液(菌丝长度约
为 10 ～ 50 μm).离心(4 000 rad /min ,5 min),弃上清液.取沉淀菌丝分别加入沙氏液体培养基中 ,用血
细胞计数板调节 ,使每毫升培养基含菌丝为 0. 5×107 ～ 1. 0×107个.
1. 2. 3　土槿皮水提物对红色毛癣菌的敏感性试验
1. 2. 3. 1　药基混合法　将沙氏固体培养基置于 120 ℃、0. 1 M Pa 条件下灭菌 20 min ,当灭菌培养基冷
却至 40 ～ 50 ℃时 ,在超净台上将其分装于试管中 ,使每管终体积 1 mL ,再以无菌操作加入 5个不同浓
度的药液 500μL ,混匀制成斜面 ,同时用沙氏液体培养基作对照. 取米粒大小受试菌接种于斜面上 ,置
收稿日期:2005-04-08
基金项目:辽宁省教育委员会基金资助项目(990321076)
作者简介:唐金花(1981-),女 ,吉林舒兰人 ,辽宁师范大学硕士研究生;
王关林(1943-),男 ,浙江海盐人 ,辽宁师范大学教授 ,博士 ,博士生导师.
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于 28 ℃温箱中于 12 ,24 ,48 ,72 h观察菌生长状态[ 6] .
1. 2. 3. 2　液体稀释法　将制备好的菌悬液分别加到终浓度为10 ,5 , 1 ,0. 5 ,0. 1 mg /mL 的药基中 ,使每
毫升药基含菌丝 103 ～ 104 个 ,将各试管放入摇床中培养(28 ℃,130 rad /min),于 72 h后取出培养物划
线于沙氏固体培养基上 ,平皿置于 28 ℃恒温箱中继续培养 , 72 h 后取出观察 ,平皿上的菌落数小于 5
个的最小稀释度即为最小抑菌浓度.
1. 2. 4　透射电镜观察 　用沙氏液体培养基将土槿皮水提物稀释成终浓度为 1 mg /mL 的药基 ,将制好
的菌悬液加入 ,使每毫升药基含菌丝 103 ～ 104 个 ,于摇床(28 ℃,130 rad /min)中培养 8 h取样 ,离心弃
上清 ,沉淀用磷酸缓冲液洗涤 3次 ,用戊二醛将沉淀固定 2 h ,按照透射电镜制备方法制备样品[ 7] ,在透
射电镜(JEM - 2000EX)下观察 ,正常的红色毛癣菌菌悬液观察作为对照.
2　结果
2. 1　土槿皮水提物的抑菌作用及 M IC
由图 1(a)可见 ,红色毛癣菌在未加药的沙氏培养基上培养 72 h 时 ,菌体生长旺盛 ,菌丝向周围蔓
延 ,相互缠结 ,其长度可达 0. 5 ～ 1 cm. 而图 1(b)则明显看出在加有1 mg /mL 土槿皮水提物的沙氏培养
基上 ,经过 72 h ,红色毛癣菌菌丝生长完全受到抑制.经 72 h的培养 ,发现浓度低于1 mg /mL 的土槿皮
水提物对菌体生长无影响 ,而在此浓度下菌体生长完全受到抑制.药基混合法试验观察不同浓度 、不同
时间药物的抑菌作用 ,可见 ,土槿皮水提物对红色毛癣菌有明显抑制作用 ,且抑菌效果与浓度呈正相关.
另外 ,浓度越大 ,其抑制菌体生长的时间越短.药物浓度低于一定浓度(1 mg /mL)时 ,菌体在 48 h后便
不再受药物影响 ,与对照组菌体一样 ,开始旺盛生长(附表).经液体稀释法得出 ,土槿皮水提物对红色毛
癣菌的最低抑菌浓度(M IC)为 1 mg /mL ,与药基混合试验法结果完全一致.
图 1　土槿皮水提物对红色毛癣菌的抑菌作用
2. 2　透射电镜观察
附表　不同浓度 、不同时间土槿皮水提物的抑菌作用
t /h
浓度 /(mg /mL)
10 5 1 0. 5 0. 1 0
12 + ++ +++ ++++ ++++ ++++
24 - + ++ ++ +++ ++++
48 - - + +++ ++++ ++++
72 - - - ++++ ++++ ++++
　　　目测并以下列标准纪录:菌生长迅速旺盛++++;菌生长较旺盛 ,但菌
　落比正常较小+++;菌生长不旺盛++;菌生长迟缓 ,形成菌落较小+;菌完
　全无生长 - .
　　透射电镜下观察 ,正常红色毛癣菌菌
丝细胞壁 、细胞膜结构完整 、紧密 ,细胞基
质均匀 ,可观察到细胞核 ,线粒体内可见很
多嵴. 1 mg /mL 的土槿皮水提物作用 8 h
后 ,红色毛癣菌菌丝细胞壁明显增厚 ,细胞
质降解 ,细胞核缩小 ,变形 ,直至最后不可
辨.其他的膜性细胞器内部结构也被降解 ,
残留膜包围的空腔. 整个菌体最后成为增
厚的细胞壁的空腔 ,内部残留形状不规则
的膜性结构 ,菌体死亡(图 2).
3　讨论
抑菌实验结果表明 ,土槿皮水提物对红色毛癣菌有很强的抑制作用 ,最低抑菌浓度为 1 mg /mL ,两
种不同实验方法结果完全一致 ,抑菌效果随浓度升高 、作用时间延长而增加.
透射电镜观察 ,红色毛癣菌在土槿皮水提物的作用下细胞壁明显增厚 ,这与胡汉华等报道的电镜下
观察夏塔热片对红色毛癣菌破坏作用相类似[ 8] .细胞质降解 ,细胞内出现空腔 ,同时细胞器也被破坏掉 ,
第 3 期 唐金花等:　土槿皮对红色毛癣菌的抑菌作用及其超微结构的研究 341　
图中 M 为放大 3 000×的线粒体;N 为细胞核;C为细胞壁
图 2　透射电镜下正常红色毛癣菌与药物作用下红色毛癣菌的形态观察
a 正常的红色毛癣菌菌丝(1 200 ×) ;b 、c药物作用 8 h后的红色毛癣菌菌丝(1 200 ×)
最后残留下膜状结构 ,导致菌体死亡.由此可见 ,菌体的膜性系统并未崩溃 ,而药物作用的机制可能是对
细胞内部蛋白质的降解.
红色毛癣菌为我国最常见的 1种皮肤癣菌.它所引发的各种癣症一直是医药界人员致力解决的问
题.土槿皮作为抗真菌药物 ,其毒副作用小 ,来源广 ,价格低廉 ,较少出现耐药性 ,尤其对红色毛癣菌有很
强的抑制作用 ,电镜研究表明具杀伤性.因此土槿皮可能是临床防治红色毛癣菌疾病的很好药物 ,有开
发潜力.
参考文献:
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Study on Fungistasis Action and Ultrastructure of
Pseudolarix kaemp feri Gord
TANG Jin-hua1 , 　ZHANG Xin-xin 1 , 　LIU Wei 2 , 　WANG Guan-lin 1
(1. College of Life Science , Liaoning Normal University , Dalian 116029 , China;
2. Biology Department , T onghua Teach er’ s College , T onghua 134002 , China)
Abstract:The Trichophy ton rubum was cultured wi th the agar mix ing method and liquid di lut ing
method for antifungal sensi tivity test;The ult ralst ructure of T. rubum in the process o f P seudolarix
kaemp feri Gord w as studied by t ransmission elect ron micro scope (TEM). T he aqueous ex t ract o f P.
kaemp feri Gord w as show n to have obvious action on T. rubum , and the ant ifungal effect was po si-
tively co rrelative w ith concentration;The minimal inhibitory concentration w as 1 mg /mL ;Observa-
tion under t ransmission elect ron microscope revealed that the hypha of T. rubum thickened obviously ,
the internal substances o f cy toplasm and org anelles w ere degraded , the empty cavi ty appeared and the
i rregular membraneous structure were resided in the cell. P. kaemp feri Gord w as found to posse ss in-
tense action on T. rubum. This has practical potent of substi tuting antibiotic to cure ringw o rm of
skin.
Key words:P seudolari x kaemp f eri Gord;T. rubum;fungistasis action;ult rast ructure;the minimal
inhibitory concentration