全 文 ：49※工艺技术 食品科学 2009, Vol. 30, No. 06
大叶冬青叶中总黄酮测定方法和提取工艺研究
旷春桃，李湘洲，汪玉霞，刘 慎，吴 斌
(中南林业科技大学材料科学与工程学院，湖南 长沙 410004)
摘 要：采用氯化铝法、硝酸铝-亚硝酸钠法分别测定大叶冬青叶中的总黄酮含量。实验结果表明两种方法的测
定结果相差很大，通过显色机理的分析，确立了氯化铝法为大叶冬青叶总黄酮含量测定的适宜方法，方法的回收
率90.7%～109.5%，平均回收率为97.8%，相对标准偏差2.2%。通过正交试验研究了大叶冬青叶中总黄酮提取工
艺，结果表明其适宜工艺条件为液料比12:1(V/m)、乙醇浓度60%、提取时间2h、提取次数2次，此条件下总黄
酮得率为0.68%。
关键词：大叶冬青叶；总黄酮；测定方法；提取工艺
Study on Determination Methods and Extraction Process of Total Flavonoids in Leaves of Ilex latifolia
KUANG Chun-tao，LI Xiang-zhou，WANG Yu-xia，LIU Shen，WU Bin
(College of Material Science and Engineering, Central South University of Forestry and Technology, Changsha 410004, China)
Abstract ：The content of total flavonoids in leaves of Ilex tif liaThunb. were determined using aluminum chloride method
and aluminum nitrate-sodium nitrite method. The experimental results showed that the determination results of content of total
flavonoids by the two methods are different from each other. The analysis on mechanism of color development of two methods
indicated that the aluminum chloride method is suitable for the determination of total flavonoids in leaves of Ilex latifolia Thun ..
The relative standard deviation of precision is 2.2%. The spike recovery rates are from 90.7% to 109.5% and their average value
is 97.8%. The extraction process of total flavonoids from leaves of Ilex latifolia Thunb. w s optimized by means of orthogonal
test design. The results showed that the extraction rate of total flavonoids is 0.68% under the optimal conditions of ratio of
extractant to raw material 12:1, taking 60% ethanol as extractant, extraction time 2 h and extraction times 2.
Key words：leaves of Ilex latifoliaThunb.；t tal flavonoids；determ nation method；extrac i n process
中图分类号：TS201.1 文献标识码：A 文章编号：1002-6630(2009)06-0049-03
收稿日期：2008-04-13
基金项目：中南林业科技大学青年科学研究基金资助项目(06014B)
作者简介：旷春桃(1973-)，男，副教授，博士研究生，主要从事天然产物化学和精细化工研究。E-mail：hnkct@163.com
大叶冬青叶是冬青属植物大叶冬青(Ilex latifolia
Thunb.)的干燥叶，为苦丁茶的基原植物之一，主要分
布于长江下游各省及福建等地[1]。据《新华本草纲要》
记载：大叶冬青叶味苦、微涩、性寒，具有清热解
毒、止渴生津的功效，常用于风热头痛、鼻炎、口
腔炎、疟疾、斑癌肚痛；外治烫伤、黄水疮、骨折
肿痛等，亦可用于防治高血压[2]。我国大叶冬青资源非
常丰富，目前主要用于制作苦丁茶，其药用价值还未
得到应有的开发和利用。现代植物化学研究表明，大
叶冬青叶中主要含有黄酮及多酚类化合物，三萜及其皂
苷和多种微量元素[3-5]。黄酮类化合物是大叶冬青中具有
医疗保健作用的主要成分，因此对大叶冬青中黄酮类化
合物的研究具有很高的应用价值。
黄酮类化合物是很多中药的活性成分，其分析方法
研究报道很多，主要有分光光度法[6]、荧光光度法[7]和
高效液相色谱法[8]，而对于评价和监测含黄酮类天然产
物的总黄酮含量通常采用分光光度法。在黄酮类化合物
的紫外光谱吸收中，主要吸收带是由A环苯酰系统引起
的吸收I(240～280nm)和B环肉桂酰系统引起的吸收带II
(300～400nm)。但是一般常用的分光光度法存在一定的
缺陷，使得各种分光光度法测得的总黄酮含量相差甚
远。本实验以大叶冬青叶的提取物为研究对象，对常
用于总黄酮含量测定的方法进行比较研究，分析不同测
定方法总黄酮含量差异的原因，建立一种适宜于大叶冬
青叶提取物中总黄酮含量测定的适宜方法，并研究大叶
冬青叶中总黄酮提取的工艺条件。
2009, Vol. 30, No. 06 食品科学 ※工艺技术50
1 材料与方法
1.1材料、试剂与仪器
大叶冬青叶(经鉴定为冬青属大叶冬青叶) 采于中南
林业科技大学。
芦丁(生化试剂) 辽宁省生物医药研发中心；95%
乙醇、氯化铝、醋酸钠、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧
化钠等均为分析纯。
UV-1201紫外分光光度计 北京瑞利分析仪器公司；
FA-1004电子分析天平 上海恒平科技仪器有限公司；
DJZ型粉碎机 上海淀久中医机器制造有限公司；SHB-
IIIA循环水式多用真空泵 郑州长城科工贸有限公司。
1.2方法
1.2.1总黄酮的测定方法
1.2.1.1氯化铝法
准确吸取0.4mg/ml的芦丁标准储备液0.0、 .2、0.4、
0.6、0.8、1.0ml置于10.0ml的容量瓶中，加0.1mol/L
氯化铝溶液2.0ml和醋酸钠-醋酸溶液3ml，用60%的乙
醇溶液稀释至刻度，摇匀，放置10min后，以0号为
空白分别测定上述标准溶液在波长420nm处的吸光度，
绘制标准曲线，得到回归方程为Y=0.0289X+0.0656，
R=0.9987。
1.2.1.2硝酸铝-亚硝酸钠法
准确吸取0.2mg/ml的芦丁标准储备液0.0、1.0、2.0、
3.0、4.0、5.0、6.0ml置于25ml的容量瓶中，加入5%
NaNO2溶液1.0ml，放置6min后，加10%的Al(NO3)3溶
液1.0ml，放置6min，加4% NaOH溶液10.0ml，用60%
的乙醇溶液稀释至刻度，摇匀，放置15min后，以0
号为空白分别测定上述标准溶液在波长506nm处的吸光
度，绘制标准曲线，得到回归方程为Y=0.0126X－0.0089，
R=0.9984。
1.2.2总黄酮的提取工艺
准确称取20目大叶冬青叶样品2.0g，放入250ml两
口烧瓶中，加入一定量50%～70%乙醇，在80℃回流
一定时间，抽滤，得滤液，滤渣倒入烧瓶，同种条
件下回流提取1～2次，合并滤液即为样品液。
2 结果与分析
2.1大叶冬青叶中总黄酮含量的测定方法的选择与分析
分别采用氯化铝法和硝酸铝-亚硝酸钠法对大叶冬
青叶提取液中总黄酮含量进行测定，总黄酮含量测定结
果见表1。实验结果表明氯化铝法测定的总黄酮含量与
硝酸铝-亚硝酸钠法相差甚远，因为在不同测定方法
中，溶液中的铝离子与黄酮的酚羟基及其邻位的酮基之
间有多种络合方式，并且黄酮的酚羟基也可单独与铝离
子形成配合物[9-11]，从而使总黄酮含量的测定结果差异
较大。
样品 硝酸铝-亚硝酸钠法 氯化铝法
大叶冬青叶提取液(μg/ml) 10.6 5.2
表1 不同测定方法总黄酮的测定结果
Table 1 Determination results of content of total flavomoids in
leaves extract of Ilex Iatifolia by different methods
图1 氯化铝法的显色机理
Fig.1 Mechanism of color development of aluminum chloride method
HO
O
O
OH
OH
OH
Al3+
HO O
O Al2+
O Al+
O
H+
HO O
O Al2+
OH
OH
硝酸铝-亚硝酸钠法是目前在食品和中草药测定总
黄酮时使用最多的方法之一。该法显色发生在卢丁B环
的3,4-邻二酚羟基部位，具有邻二酚羟基结构的原儿茶
醛、原儿茶酸、咖啡酸、绿原酸、羟基苯甲酸类等
非黄酮类多酚类化合物也发生此显色反应，并在波长
500nm左右有最大吸收峰或较强吸收峰，而大叶冬青叶
中含有大量非黄酮类多酚，显然会对黄酮的测定造成干
扰，势必导致测定结果偏高[12-13]。
氯化铝法的测定环境是酸性，可以避免邻二羟基结
构的非黄酮类化合物的干扰，所以氯化铝法具有更好的
专属性，更高的准确度，其显色机理见图1。通过显
色机理的比较分析说明氯化铝法是大叶冬青叶中总黄酮
测定的适宜方法。
2.2精密度和回收率实验
为验证该氯化铝法测定大叶冬青叶提取液中总黄酮结
果的精密度和准确度，进行了精密度实验和回收率实验。
准确吸取标准品溶液0.1ml分别置5只10ml容量瓶
中，按氯化铝法进行测定，相对标准差(RSD)为2.2%，
说明该法的精密度较高。
准确吸取0.4mg/ml芦丁标准品溶液0.1、0.2、0.3、

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从表2可以看出，加样回收率90.7%～109.5%，平
均回收率为97.8%，说明方法的准确度较高。
2.3提取实验结果
为得到总黄酮提取的适宜工艺条件，在探索实验的
基础上选择L9(34)进行四因素三水平正交试验考察相关因
素对总黄酮得率的影响，试验结果见表3。
样品 1 2 3 4 5
样品液含量(μg/ml) 9.32 9.32 9.329.329.32
加标量(μg/ml) 4.0 8.0 12.016.020.0
测得量(μg/ml) 13.7017.020.2024.4129.02
回收率(%) 109.596.0 90.794.398.5
平均回收率(%) 97.8
表2 回收率实验结果
Table 2 Results of recovery experiment
试验 A液料比 B乙醇浓度 C提取时间 D提取 得率
号 (V/m) (%) (h) 次数 (%)
1 10:1 50 1 1 0.28
2 10:1 60 2 2 0.51
3 10:1 70 3 3 0.45
4 12:1 50 2 3 0.58
5 12:1 60 3 1 0.56
6 12:1 70 1 2 0.63
7 14:1 50 3 2 0.54
8 14:1 60 1 3 0.59
9 14:1 70 2 1 0.58
K1 1.24 1.40 1.50 1.42
K2 1.77 1.66 1.67 1.68
K3 1.71 1.66 1.55 1.62
R×3 0.53 0.26 0.17 0.26
表3 正交试验结果
Table 3 Results of orthogonal test on extraction process of total
flavonoids from leaves of Ilex latifolia
间太长，得率下降，所以其适宜提取工艺条件为
A2B2C2D2，即料液比为12:1、乙醇浓度为60%、提取
时间2h、提取次数2次。适宜工艺条件下总黄酮的得
率为0.68%。
3 结 论
在常用于黄酮类物质含量测定的氯化铝法和硝酸铝-
亚硝酸钠法中，氯化铝法适宜于大叶冬青叶提取液中总
黄酮含量的测定，回收率90.7%～109.5%，平均回收率
为97.8%，相对标准偏差2.2%，该方法准确度和精密
度均较高。
大叶冬青叶中总黄酮的适宜提取工艺条件为：液料
比12:1、乙醇浓度60%、提取时间2h、提取次数2次，
此条件下总黄酮得率为0.68%。
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从表3可以看出，各因素对大叶冬青总黄酮得率影
响的主次顺序为A>B>D>C，料液比太小，提取不完
全；从提取的经济性考虑，以60%的乙醇溶液最适宜；
提取时间的影响最小，黄酮在高温下易氧化，提取时
0.4、0.5置于5只10ml容量瓶中，然后分别加入2.0ml样
品液，按氯化铝法进行测定，回收率实验结果见表2。