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年第 2 期2015
高效液相色谱法测定地锦草颗粒中槲皮素含量的不确定度分析
杨修镇，高迎春，张传津，李淑花
（山东省兽药质量检验所 山东省畜产品质量安全监测与风险评估重点实验室，山东济南 250022）
摘 要：对 HPLC法测定地锦草颗粒中槲皮素含量的测量不确定度进行分析，以找出影响不确定度的因素，对
不确定度进行评估，为地锦草颗粒中槲皮素标准限量的制定提供科学依据。
关键词：地锦草颗粒；槲皮素；不确定度
中图分类号：S853.7 文献标志码：A 文章编号：1000-6354（2015）02-0033-03
DOI:10.13823/j.cnki.jtcvm.2015.02.010
收稿日期：2014-12-12
基金项目：“十一五”国家科技支撑计划重大项目“抗耐药菌中兽
药的研制与开发”（2008BADB4B04）子项目“中药耐药
抑制剂地锦草提取物及其制剂的研制与开发”（2008
BADB4B04－5）
作者简介：杨修镇（1983-），男，兽医师，主要从事兽药和畜禽产
品质量监督检验工作。
地锦草为大戟科大戟属地锦（Euphorbia humifusa Willd.）
的干燥全草，收载于《中华人民共和国兽药典》二○一○年
版二部，也是一种维吾尔药和蒙药，具有清热解毒、凉血止
血之功能 [1]。地锦草颗粒是山东省兽药质量检验所与山东
华尔康兽药有限公司共同研制的新兽药，对人工感染鸡大
肠杆菌病具有显著的治疗效果 [2]，现已取得新兽药证书和
批准文号。
不确定度是指被测量值的不能肯定的程度 [3]，是反映
测量结果质量的指标。在报告测量的结果时，必须给出相
应的不确定度，一方面便于使用者评定其可靠性，另一方
面也提高了测量结果之间的可比性 [4]。为保障测量结果的
可靠性，笔者等对 HPLC 法测定地锦草颗粒中槲皮素含量
的测量不确定度进行分析。
1 材料与方法
1.1 仪器和材料
Agilent 1200 高效液相；槲皮素对照品，批号：100081-
200907，含量为 96.5%，购自中国食品药品检定研究院；地
锦草颗粒，批号：20130608，山东华尔康兽药有限公司提供；
甲醇、磷酸为色谱纯；流动相用水为超纯水；其余试剂为分
析纯。
1.2 方法
1.2.1 对照品溶液和供试品溶液的制备 对照品溶液的
制备：取槲皮素对照品约 10 mg，精密称定，置 500 mL 容
量瓶中，加 80%甲醇溶解并稀释至刻度，即得。供试品溶液
的制备：取地锦草颗粒研细后的粉末（过三号筛）约 1 g，精
密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入 80%甲醇 50 mL，密
塞，称定重量，加热回流 1.5 h，放冷，再称定质量，用 80%
甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，精密量取续滤液 20 mL，
精密加入 25％盐酸 7 mL，置 85 ℃水浴中水解 30 min，取
出，迅速放冷，转至 50 mL 量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇
匀，滤过，取续滤液，即得。
1.2.2 色谱条件与系统适用性 以十八烷基硅烷键合硅
胶为填充剂，以甲醇-0.4%磷酸溶液（50 ∶50）为流动相，检
测波长360 nm，理论板数按槲皮素峰计算应不低于 3 000。
1.2.3 测定方法 分别精密吸取对照品溶液和供试品溶
液各 10 μL，注入液相色谱仪，记录图谱。
1.2.4 数学模型
X = Ax·C0·VxA0·M
其中：X-样品中槲皮素含量，mg/g；Ax-样品中槲皮素
色谱峰面积；C0-槲皮素对照品的质量浓度，mg/mL；A0-槲
皮素对照品的色谱峰面积；M-样品取样量，g；Vx-样品稀
释倍数。
1.2.5 不确定度计算 根据数学模型分析，单份供试品含
量测定的不确定度主要来源于 C0、A0、Ax、Vx 和 M 5 个分
量。经过对检验整个过程的不确定因素分析，并对上述 5
个因素进行归纳，其不确定度可以归纳为 3 个方面：对照
品溶液的制备、供试品溶液的制备和仪器测定精密度的不
确定度。
2 结果
2.1 对照品溶液制备的不确定度
2.1.1 对照品称量的不确定度 检定不确定度：从天平检
定证书上得到，最大允许误差为±0.010 mg，假设为矩形分
布，K=3，故称量的不确定度 u1（m 对照）= 0.01/ 3姨 = 0.005 77 mg；
u1rel（m 对照）＝0.005 77/ 10=0.057 7%。重复性不确定度：对照
品重复称量 10次变动的相对标准偏差为 0.324%。
由以上两项合成称量不确定度：
urel（m 对照）= 0.057 7%2+0.324%2姨 = 0.329%
2.1.2 对照品制备过程体积的不确定度 校准不确定度：
实验用 500 mL 量瓶为 A 类，限值为 0.25，假设为矩形分
布，K=3，得校准不确定度：u1（V 溶剂）=0.25/ 3姨 = 0.144 mL；
u1rel（V 溶剂）＝0.144/500=0.028 8%。温度不确定度：实验室
温度的波动范围为±3℃，溶剂（以甲醇计）膨胀系数 α 为
1×10- 3 k－1，故 500 mL量瓶引起的温度不确定度：u2（V 溶剂）=
1×10－3×500×3＝1.5 mL；u2rel（V 溶剂）＝1.5/500=0.3%。重复性
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不确定度：用 80%甲醇定容，称重，重复 10 次，计算相对
标准偏差为 0.141%。
由以上 3 项合成体积不确定度：
urel（V 溶剂）= 0.028 8%2+0.3%2＋0.141%2姨 =0.333%
2.1.3 对照品溶液的制备的不确定度 将上述 2 项不确
定度合成，得对照品溶液的制备的不确定度：
urel（C0）= 0.329%2+0.333%2姨 =0.468%
2.2 供试品溶液制备的不确定度
2.2.1 供试品称量的不确定度 检定不确定度：从天平
检定证书上得到，最大允许误差为±0.010 mg，假设为矩形
分布，K=3，故称量的不确定度 u1（M）= 0. 01/ 3姨 = 0.005 77 mg；
u1rel（M）＝0.005 77/1 000=0.000 577%。重复性不确定度：供试
品重复称量 10次的相对标准偏差为 0.005 25%。
由以上两项合成称量不确定度：
urel（M）= 0.0005 77%2+0.005 25%2姨 = 0.005 28%
2.2.2 供试品制备过程体积的不确定度
2.2.2.1 加入 80%甲醇的不确定度 校准不确定度：实验
用 50 mL 移液管为 A 类，限值为 0.05，假设为矩形分布，
K=3，得其校准不确定度为：u11（Vx）= 0.05/ 3姨 = 0.0289 mL；
u11rel（Vx）＝0.0289/50=0.057 7%。温度不确定度：实验过程
中温度的波动范围均为±3℃ ,溶剂（以甲醇计）膨胀系数 α
为 1×10-3 k-1，故温度引起的不确定度为：u12（Vx）= 1×10-3×
50×3=0.15 mL；u12rel（Vx）＝0.15/50=0.3%。重复性不确定度：
用 50 mL 移液管吸 80%甲醇至刻度，称重，重复 10 次，相
对标准偏差为 0.084 2%。
由以上 3 项合成加入 80%甲醇的不确定度：
u1rel（Vx）= 0.000577%2+0.3%2＋0.0842%2姨 =0.317%
2.2.2.2 两次称定质量带入的不确定度 检定不确定度：
从天平检定证书上得到，称定质量用天平最大允许误差
为±0.01 g，假定为矩形分布（K= 3姨 ），故一次称量的不确
定度 u21（Vx）= 0.01/ 3姨 = 0.005 77 g；两次称量的不确定
度为：u22（Vx）= 0.005 77%2+0.05 77%2姨 ＝0.008 16 g。50 mL
80%甲醇和供试品的重量为 42.71g，u2rel（Vx）＝0.008 16/42.71＝
0.019 1%。
2.2.2.3 提取液移液的不确定度 校准不确定度：实验用
20 mL移液管为 A 类，限值为 0.025，假设为矩形分布，K=3，
得其校准不确定度为：u31（Vx）=0.025/ 3姨 =0.014 4 mL；u31rel
（Vx）＝0.014 4/20=0.072%。温度不确定度：实验过程中温
度的波动范围均为±3℃ ,溶剂（以甲醇计）膨胀系数 α 为
1×10-3 k-1，故温度引起的不确定度为：u32（Vx）= 1×10-3×2
0×3 =0.06 mL；u32rel（Vx）＝0.06/20=0.3%。重复性不确定度：用
20 mL 移液管吸提取液至刻度，称重，重复 10 次，相对标
准偏差为 0.108%。
由以上 3 项合成提取液移液的不确定度：
u3rel（Vx）= 0.072%2+0.3%2+0.108%2姨 =0.327%
2.2.2.4 水解后定容的不确定度 校准不确定度：实验用
50 mL容量瓶为 A 类，限值为 0.06，假设为矩形分布，K=3，
得其校准不确定度为：u41（Vx）=0.06/ 3姨 =0.034 6 mL；u41rel
（Vx）＝0.034 6/50=0.069 2%。温度不确定度：实验过程中
温度的波动范围均为±3℃,溶剂（以甲醇计）膨胀系数 α 为
1×10-3 k-1，故温度引起的不确定度为：u42（Vx）=1×10-3×50×
3=0.15 mL；u42rel（Vx）＝0.15/50=0.3%。重复性不确定度：用
80%甲醇定容，称重，重复 10次，计算相对标准偏差为 0.164%。
由以上 3 项合成定容的不确定度：
u4rel（Vx）= 0.069 2%2+0.3%2＋0.164%2姨 = 0.349%
根据“2.2.2.1-2.2.2.4”，合成供试品制备过程体积的
不确定度：
urel（Vx）= 0.317%2+0.019 1%2＋0.327%2＋0.349%2姨 = 0.574%
2.3 仪器测定精密度的不确定度
2.3.1 对照品溶液重复测定的不确定度 取对照品溶
液，重复测定 6 次，对照品溶液的峰面积分别为 696.201、
694.512、691.550、691.977、693.334、693.578。相对标准偏
差为 0.245%，即 urel（A0）＝0.245%。
2.3.2 供试品溶液重复测定的不确定度 取供试品溶
液，重复测定 6 次，供试品溶液的峰面积分别为 507.815、
508.426、507.064、507.931、508.954、509.111。相对标准偏
差为 0.151%，即 urel（Ax）＝0.151%。
2.4 合成标准不确定度
将上述各项的相对不确定度用方和根法合成，得出
HPLC 法测定地锦草颗粒中槲皮素含量的测量相对不确定
度：urel＝ 0.468%2+0.0052 8%2＋0.574%2＋0.245%2＋0.151%2姨
＝0.79%
2.5 扩展不确定度 U
U=k·urel，取置信水平为 95%时，包含因子 k（95）= 2，
则 U=2×0.79% =1.6%。
3 讨论
供试品溶液制备过程中，加热回流时间足以满足槲皮
素的充分提取，其微小变动不会引起槲皮素含量的变化。
盐酸的浓度及用量、水解温度及时间也足以满足槲皮素苷
完全水解为槲皮素，其微小变动也不会引起槲皮素含量的
变化。这些都是在地锦草颗粒质量标准研究中进行了充分
考察的，故在进行 HPLC 法测定地锦草颗粒中槲皮素含量
的测量不确定度分析时不需再考虑这些因素。
表征合理地赋予被测量值的分散性，与测量结果相联
系的参数称为测量不确定度，这是 JJF1001-1998《通用计
量术语及定义》中对其作出的最新定义。测量不确定度是
独立而又与测量结果密切相关的、反映测量结果分散性的
一个参数。在测量的完整的表示中应包括测量不确定度。
测量不确定度用标准偏差表示时，称为标准不确定度，如
用说明了置信水准的区间的半宽度的表示方法，则称为扩
展不确定度 [5]。
笔者等对 HPLC 法测定地锦草颗粒中槲皮素含量的
测量不确定度进行了分析，以找出影响不确定度的因素，
对不确定度进行评估，为地锦草颗粒中槲皮素标准限量的
制定提供了科学依据。
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Uncertainty analysis on quantifying quercetin in Euphorbia humifusa particles by HPLC
YANG Xiu-zhen, GAO Ying-chun, ZHANG Chuan-jin, LI Shu-hua
(Shandong Provincial Veterinary Medicine Supervision Institute, Institute of Veterinary Drug Quality Inspection of Shandong
Province, Jinan Shandong 250022, China)
Abstract：In order to find out the influential factors and assess experimental data of the uncertainty, this paper analysed
the uncertainty occurring in quantifying quercetin in Euphorbia humifusa particles by HPLC, so that the limitation standard of
quercetin in Euphorbia humifusa particles can be established.
Key words：Euphorbia humifusa particles; quercetin; uncertainty
参考文献：
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江西中医学院学报，2008，20（4）：78-80.
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羊胎盘转移因子康肽对猫免疫功能的影响
杨 涛 1，李忠诚 2，张斌恺 1，王广龙 1，杨小全 3，段超华 3，肖 啸 1，4
（1.云南农业大学动物科学技术学院，云南昆明 650201；2.云南省福贡县动物疫病预防控制中心，云南福贡
673400；3.云南省公安消防总队，云南昆明 650203；4.云南农业大学动物医院，云南昆明 650031）
摘 要：研究康肽（羊胎盘转移因子）对猫免疫功能的影响。将 28只猫分为 4组（即对照组，康肽低剂量组、中
剂量组、高剂量组），灌胃不同剂量的康肽，于试验前、后对免疫球蛋白 IgG、IgA、IgM、补体 C3、补体 C4及WBC、LY、
RBC进行测定比较，其中WBC、LY、RBC用自动血液细胞分析仪检测，IgG、lgM、lgA和补体 C3、补体 C4分别用 IgG、
lgM、lgA试剂盒和补体 C3、补体 C4试剂盒进行检测。结果表明，康肽能提高猫血清中免疫球蛋白（IgG、IgM、IgA）、补
体（C3、C4）和WBC、LY、RBC的含/数量。提示康肽具有正向调节作用，剂量越大，作用越好。
关键词：羊胎盘转移因子注射液（康肽）；猫；免疫球蛋白；补体
中图分类号：S853.7 文献标志码：A 文章编号：1000-6354（2015）02-0035-03
DOI:10.13823/j.cnki.jtcvm.2015.02.011
收稿日期：2014-11-21
基金项目：云南省高端科技人才引进计划项目子项目（2009C1125-6）
作者简介：杨 涛（1991-），男，在读硕士研究生，研究方向：兽医
临床诊断。
通讯作者：肖 啸（1966-），男，教授，硕士生导师，主要从事动物
病理学与兽医临床诊断学教学与研究，邮箱：13116
299366@163.com
康肽是羊胎盘转移因子注射液，系用怀孕 100 d 以上
的健康绵（山）羊新鲜或冷藏胎盘经低温高压超声波蛋白
质裂解法制备的转移因子复合溶液，是一种免疫激发剂，
是由体内 T 淋巴细胞所释放的一种能够转移免疫致敏信
息的因子，具有传递特异性免疫信息、发挥细胞调节作用、
促进免疫细胞活化与增殖、提高细胞因子总体水平、抗放
射性、抗免疫抑制、抗菌抗病毒、解毒等功能 [1，2]，用于免疫
力低下、白细胞数量减少以及体质虚弱的弱体、患病宠物
以及老年宠物等，配合常规治疗，可明显缩短病程、迅速改
善症状，恢复健康，效果明显。宠物出生当日、7 日龄、14
日龄分别注射康肽羊胎盘转移因子注射液一次，可避免或
降低因母源抗体不足而引起发病，提高成活率；在断奶、转
群、长途运输、恶劣天气等应激因素出现之前或当天注射
康肽羊胎盘转移因子注射液，1 次/d，连续注射 2-3 次，可
抵抗上述各种应激因素对宠物的不利影响；经常进入宠物
市场的宠物，在进入宠物市场前或购回后，1 次/d，连续注
射 2-3 次，以后每 3 个月注射 1 次，能避免或减少宠物感
染发病的机率；老龄宠物出现少食厌食、行动困难或呼吸
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