全 文 ：中国农学通报 2010,26(17):273-276
Chinese Agricultural Science Bulletin
0引言
柑桔黄龙病（Citrus Huanglongbing，HLB）是一种
世界范围内的毁灭性柑桔病害，最早在中国广东省潮汕
地区发现，1919年中国华南地区首次报道该病发生[1]，
至今已有 100多年的历史。目前，柑桔黄龙病已在亚
洲、非洲和美洲的 40多个国家和地区发生与流行 [2]。
在中国该病主要分布于广东、广西、福建、湖南、江西、
浙江、云南、贵州、四川、海南和台湾，中国19个柑桔栽
培省、区中有 11个遭受黄龙病危害，其面积占柑桔总
栽培面积的80%以上，产量占总产量的85%左右[3]。广
西柑桔因黄龙病为害而淘汰的面积超过 6.7万 hm2以
上，累计给农民造成直接和间接经济损失超过 100亿
基金项目：科技部国际科技合作项目“柑桔优势品种繁育及其高效栽培关键技术研究”（2008DFA30900）；农业部公益性行业（农业）科研专项“柑桔模
式化栽培与贮藏技术研究”（nyhyzx07-08）；广西农业重点科技计划项目“柑桔黄龙病综合防治技术研究”（NK200827）；广西自然科学基金项目“黄
皮、九里香抗柑桔黄龙病机理研究”（桂科自0728038）。
第一作者简介：邓崇岭，男，1962年出生，副研究员，研究方向：柑桔品种选育、柑桔无病毒苗木繁育和柑桔黄龙病防控。通信地址：541004桂林市普
陀路40号广西柑桔研究所，Tel：0773-5861940，E-mail：cldeng88168@126.com。
通讯作者：白先进，男，1956年出生，研究员，广西农业厅总农艺师，研究方向：柑桔黄龙病防治及柑桔无病毒苗木繁育。Tel:0771-2182519，E-mail：
b5629@126.com。
收稿日期：2010-04-21，修回日期：2010-06-11。
用Nested-PCR检测广西黄皮与九里香黄龙病病原
邓崇岭 1，陈传武 1，赵小龙 2，付慧敏 1，陈国平 1，白先进 2，娄兵海 1，吴礽超 1
（1广西壮族自治区柑桔研究所，广西桂林 541004；2广西壮族自治区农业厅，南宁 530022）
摘 要：运用Nested-PCR技术对来自广西部分市、县的 40个黄皮和九里香进行柑桔黄龙病（Citrus
Huanglongbing，HLB）病原检测，结果表明：从部分黄皮和九里香样品抽提的DNA中，可扩增出一条特
异性的400 bp条带，说明广西种植的黄皮和九里香均可感染黄龙病；在柑桔黄龙病疫区，黄皮和九里香
黄龙病感染率分别为35.0%和40.0%，黄龙病感染率已相当高。为了减少柑桔黄龙病的发生，有利于对
柑桔黄龙病进行综合防控，不宜在柑桔种植区栽种黄皮和九里香，铲除已感染黄龙病的植株。
关键词：黄皮；九里香；黄龙病；Nested-PCR
中图分类号：Q789 文献标志码：A 论文编号：2010-1257
Nested-PCR Detection of the pathogen of Citrus Huanglongbing on
Clausena lansium and Murraya paniculata
Deng Chongling1, Chen Chuanwu1, Zhao Xiaolong2, Fu Huimin1,Chen Guoping1,
Bai Xianjin2, Lou Binghai1, Wu Rengchao1
(1Guangxi Citrus Research Institute, Guilin Guangxi 541004;
2Department of Agriculture of Guangxi, Nanning 530022)
Abstract：Nested-PCR was used for the detection of the pathogen of citrus Huanglongbing (HLB) on 40
samples of Clausena lansium and Murraya paniculata from several cities of Guangxi. The result demonstrated
that a specific 400 bp band could be amplified from part of the DNA extracted from these plant materials,
respectively. It indicated that Clausena lansium and Murraya paniculata from Guangxi could be infected by
HLB. In HLB-infected area, HLB infection rates of Clausena lansium and Murraya paniculata were 35.0% and
40.0% , respectively. For the purpose of reduction of HLB infection rates and integrated control of HLB,
Clausena lansium and Murraya paniculata should not be planted in the citrus planting area, and plants infected
by HLB should be removed as soon as possible.
Key words: Clausena lansium; Murraya paniculata; Huanglongbing; Nested-PCR
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元。柑桔黄龙病病原属于变形菌门（Proteobacteria），
α-变形菌纲（Alphaproteobacterial），韧皮部杆菌属
（Liberibacter）。该病原到目前可分三个种：亚洲种
（Candidatus Liberibacter asiaticus）、非 洲 种（Ca.
Liberibac africanus） [4] 和 美 洲 种（Ca. Liberibac
americanus）[5]。在中国发生的黄龙病病原为亚洲种[6]。
该病可通过嫁接和柑桔木虱传播[7-9]。黄龙病主要为害
柑桔属（Citrus spp.）、枳属(Poncitrus trifoliata)和金柑属
(Fortunella spp.)[10-11]的植物。
黄皮 (Clausen lansium)作为一种果树，九里香
（Murraya paniculata）作为一种观赏和绿化植物而大量
分布于广西区内。由于黄皮、九里香是柑桔木虱的寄
主[12]，同时也是黄龙病病原的寄主[10,13]，这给柑桔黄龙
病的防控带来一定的困难。对广西黄皮和九里香黄龙
病感染情况的研究，尚未见报道。作者就广西的黄皮
和九里香，运用PCR检测技术，对其黄龙病感染进行
检测，以期为广西柑桔黄龙病的综合防控及进一步研
究提供依据。
1 材料与方法
1.1 植物材料
检测的黄皮、九里香样品来自广西不同市、县，共
计40个样品，于2008年9月在柑桔黄龙病疫区重点选
择有木虱取食的植株进行采集。以典型斑驳症状的柑
桔黄龙病叶片为阳性对照，阴性对照采自广西柑桔研
究所脱毒母本园。
1.2 引物
Nested-PCR引物根据柑桔黄龙病病原亚洲株系
16SrDNA设计 [6]，由上海生工生物工程有限公司合
成 。 其 中 Nested-PCR 外 侧 引 物 为 ：P1：
TGAATTCTTCGAGGTTGGTGAGC；P2：AGAATTC
GACTTAATCCCCACCT。Nested-PCR内侧引物为：
P3：GCGTTCATGTAGAAGTTGTG；P4：CCTACAG
GTGGCTGACTCAT。
1.3 方法
病原的提纯方法为 CTAB法 [14]，并做部分改进。
称取 0.3 g左右的叶脉，加入液氮研磨至粉末状，分装
于 2.0 mL Eppendorf管中。加入含 2% CTAB的DNA
提取液，65℃水浴45 min，每隔15 min轻摇1次；苯酚-
氯仿-异戊醇(25:24:1)抽提2次，取上清，加入2倍体积
无水乙醇沉淀10 min，12000 r/min离心15 min；沉淀用
75%乙醇清洗，吹干，加入 50 μL无菌 ddH2O溶解。调
整浓度到50 ng/μL，置-20℃备用。
Nested-PCR检测：以总DNA为模板，采用 20 μL
反应体系，进行 Nested-PCR扩增。体系中含 10×
PCR Buffer 2 μL，2.5 mol/L dNTP 2 μL，5 U/μL Taq酶
0.1 μL，25 mmol/L MgCl2 1.2 μL，10 mmol/L的引物各
1 μL，每个反应重复两次。使用引物 P1/P2进行第一
轮 PCR扩增，将第一轮 PCR产物稀释 40倍，取 1 µL
做第二轮 PCR的模板。使用引物对 P3/P4进行第二
轮扩增，两轮的扩增程序均为：预扩增 95℃，5 min；
95℃，30 s，55℃，45 s，72℃，45 s，30循环；72℃，
10 min。最后进行电泳检测，在凝胶成像系统下观
察记录结果。
2 结果与分析
2.1 黄皮、九里香黄龙病检测
分别对来自广西不同市、县的黄皮、九里香样品抽
提的DNA进行黄龙病Nested-PCR扩增检测，结果（图
1，图 2）表明，从部分黄皮、九里香的植株材料中能扩
增出一条与预期片段大小一致的400 bp片段，表明这
些植株均能感染黄龙病。
2.2 黄皮上黄龙病感染率
共检测黄皮样品 20个，通过Nested-PCR检测，带
黄龙病病原的有7个（表1），黄龙病感染率为35.0%。
2.3 九里香上黄龙病的感染率
共检测九里香样品 20个，通过Nested-PCR检测，
带黄龙病病原的有 8个（表 1），黄龙病的感染率为
M：100 bp Marker；＋：阳性对照；－：阴性对照；1~13：待检测黄皮样品。
图1 广西不同黄皮样品黄龙病Nested-PCR检测
400bp
M + - 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
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邓崇岭等：用Nested-PCR检测广西黄皮与九里香黄龙病病原
40.0%。表明在柑桔黄龙病疫区，九里香感染黄龙病
已相当高。
3 讨论
在检测黄皮及九里香时发现其黄龙病病原菌浓度
较斑驳症状的柑桔黄龙病叶片明显要低，在用PCR检
测时只检测出 3个样品为阳性，但在Nested-PCR检测
出却检测出15个为阳性，说明用PCR检测黄皮和九里
香等病原菌含量低的样品时存在漏检现象。
Nested-PCR在检测中比PCR的灵敏度要高，且其重复
性好，这与李韬等[13]的结果是一致的。Nested-PCR为
检测九里香和黄皮等病原菌含量较低的样品提供了切
实可行的方法。
首次对广西黄皮进行黄龙病巢式PCR检测，得到
1条 400 bp的特异性条带，结果与Tirtawidjaja[10] 报道
一致，说明黄皮不但是柑桔木虱的寄主[12]，也是柑桔黄
龙病病原的寄主。黄皮在广西是一种时令水果，有一
定的面积，一般种植在房前屋后、柑桔园周围或与柑桔
园相互交叉种植，管理非常粗放，基本上不喷药，这给
柑桔黄龙病防控带来很大的困难。由于黄皮在自然生
长状态下，黄龙病的感染率达 35.0%，因此，建议在柑
M：100 bp Marker；＋：阳性对照；－：阴性对照；1~15：待检测九里香样品。
图2 广西不同九里香样品黄龙病 Nested-PCR检测
表1 黄皮、九里香黄龙病病原Nested-PCR检测结果
黄皮样品号
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
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检测结果
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+
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+
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九里香样品号
1
2
3
4
5
6
7
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9
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11
12
13
14
15
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检测结果
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注：“＋”表示Nested-PCR检测结果为阳性；“－”表示Nested-PCR检测结果为阴性。
400bp
M + - 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
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桔产区不宜种植黄皮，如确需种植黄皮应加强管理，喷
药防治木虱，并及时铲除携带黄龙病的病株。
试验结果表明九里香也是黄龙病病原的寄主，与
李韬等[13]的报道一致。九里香属芸香科常绿灌木，也
是柑桔木虱最喜爱的寄主植物，产自中国云南、广西、
广东、福建和台湾等地，以及亚洲其他一些热带及亚热
带地区，许多城乡通常将它作为观赏植物和绿化植物
来种植，且种植面积较大，有的果园甚至用它作为防护
带植物来种植。该次检测结果表明，在柑桔黄龙病疫
区，九里香的黄龙病感染率达40.0%，已达到相当高的
水平。为此，在柑桔种植区不宜栽种九里香，已种植的
应该铲除，这应作为柑桔黄龙病综合防控的一项重要
措施。
参考文献
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