全 文 ：中国农学通报 2012,28(31):227-230
Chinese Agricultural Science Bulletin
0 引言
地黄是中国的一种重要药用植物，具有非常悠久的
栽培历史。在地黄的栽培中，存在着严重的连作障碍。
同一块地种植地黄 1年后，要 8~10年后才能再种[1-2]。
虽然地黄是连作障碍最为严重的植物之一，但关于地
黄连作障碍机理的研究报道却非常有限。有人认为地
黄根系分泌物、地黄叶和块根中的化感物质是造成地
黄连作障碍的主要原因[3-4]，但关于影响地黄生长的化
感物质的种类、来源、作用方式及其在土壤中的维持时
间等至今还不清楚[5]，现有研究结果也很难解释地黄
基金项目：江苏省自然科学基金“化感细菌DH9杀草机理研究”(BK2009234)；国家环境保护部公益性行业科研专项“典型微生物农药使用环境行为
与生态效应研究”(201009023)；江苏省科技支撑计划——农业部分“一种防治小麦白粉病新的生防菌制剂的研发”(BE2011355)和“解淀粉芽孢杆菌
CC09菌株与环脂肽联合增效生防菌剂的研发”(BE2012372)；长江学者和创新团队发展计划资助(IRT1020)；中央高校基本科研业务费专项资金资助
(1082020803)。
第一作者简介：郭利川，男，1985年出生，河北邢台人，硕士，研究方向：植物学。通信地址：210093南京市南京大学鼓楼校区生命科学学院，Tel：
025-83685469，E-mail：guolichuan@sina.cn。
通讯作者：刘常宏，男，1964年出生，陕西绥德人，教授，博士，目前从事的研究方向：微生物农药的开发、微生物次生代谢产物的转录调控机理研究、
太湖蓝藻水华形成机理及防治研究。通信地址：210093南京市汉口路22号南京大学生命科学学院，Tel：025-83685469，E-mail：chliu@nju.edu.cn。
收稿日期：2012-05-16，修回日期：2012-06-19。
地黄连作障碍机制分析
郭利川 1，刘常宏 1，左广胜 2，薛雅蓉 1，双惊雷 1
（1南京大学生命科学学院，南京 210093；2北京中龙创科技有限公司，北京 100071）
摘 要：研究采用土壤微生物平板分离技术和16S rRNA基因序列分析技术，旨在研究化感细菌与地黄生
长的关系，阐明引起地黄连作障碍的原因。从地黄连作1年的土壤中分离到19株细菌，其中2株细菌为
恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida DH03)和河生肠杆菌(Enterobacter amnigenus DH05)；DH03菌株和
DH05菌株不侵染地黄叶片，但其代谢产物对地黄叶片及块根有毒害作用，为典型的化感细菌；而地黄
块根成分对DH03菌株和DH05菌株的生长有促进作用。根据化感细菌与地黄的相互作用，提出了引起
地黄连作障碍的化感细菌作用假说，化感细菌的化感作用是引起地黄连作障碍的重要原因之一。
关键词：地黄；连作障碍；化感细菌
中图分类号：S4 文献标志码：A 论文编号：2012-1867
Mechanism Analysis of Continuous Cropping Obstacle of Rehmannia glutinosa
Guo Lichuan1, Liu Changhong1, Zuo Guangsheng2, Xue Yarong1, Shuang Jinglei1
(1School of Life Science, Nanjing University, Nanjing 210093; 2Beijing Wlong Technology Co. Ltd, Beijing 100071)
Abstract: This study aimed to study the relationship between allelopathic bacteria and Rehmannia glutinosa
growth, and clarify the causes of R. glutinosa continuous cropping cbstacle by using soil microbial plate
isolation technique and 16S rRNA gene analysis method. From 1 year R. glutinosa replanted soil, 19 strains of
bacteria were extracted, two of which were identified to be Pseudomonas putida DH03 and Enterobacter
amnigenus DH05. Strain DH03 and strain DH05 didn’t infect R. glutinosa leaves. However, their metabolites
had toxic effects on both leaves and tubes of R. glutinosa, and were typical allelopathic bacteria. Meanwhile,
constitutes of R. glutinosa had a positive effect on the growth of strain DH03 and strain DH05. Based on the
interactive effects between allelopathic bacteria and R. glutinosa, the hypothesis was proposed on the
allelopathic bacterial effect which had caused the R. glutinosa continuous cropping cbstacle. Allelopathy of
allelopathic bacteria was one of the main factors that had caused R. glutinosa continuous cropping obstacle.
Key words: Rehmannia glutinosa; continue cropping problem; allelopathic bacteria
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栽培 1年须间隔 8~10年方可再种植的连作障碍现
象。陈慧等[6]和刘峰等[7]发现，土壤中不同细菌对地黄
成分水苏糖和梓醇的利用能力存在差异，推测利用地
黄成分能力强的细菌随着地黄连作而成为优势种群，
而利用能力差的细菌种群数量将逐渐受到抑制，土壤
微生物种群结构的变化可能与地黄连作障碍有关。但
没有指出地黄根际存在的“优势菌”是什么，是否存在
对地黄有害的细菌，这些有害细菌对地黄生长有何影
响以及这种影响与连作障碍之间有何关系等。刘红彦
等[3]通过比较重茬土壤灭菌与未灭菌处理后地黄的生
长状况，发现灭菌处理后的地黄块茎产量显著高于未
灭菌处理，用农药浸种的方法使地黄种苗的出苗率及
成活率提高[8-9]，这些结果都说明地黄连作障碍与土壤
微生物有关。然而还没有人系统调査过地黄根际存在
的对地黄有害的微生物种类及数量分布，更无人研究
过它们与地黄栽培、地黄连作障碍发生之间的关系。
为此，本课题组系统研究了引起地黄连作障碍的
可能原因，利用土壤灭菌栽培地黄和土壤成分的
HPLC分析，证明引起地黄连作障碍的主要原因是微
生物，进而通过土壤微生物的分离、鉴定及其对地黄植
物生长的影响以及地黄对其生长的影响研究，探讨引
起地黄连作障碍的原因及可能机理，为有效控制地黄
连作障碍提供参考。
1 材料与方法
1.1 供试材料
1.1.1 土壤样品 连作土壤样品于2008年6月采自山西
省临汾市地黄产区。种植年限为1年。样地0.7 hm2，5
点取样，每点取样20 cm土层，然后混合均匀为一个样
品。另取未种植过地黄的土样作为对照。
1.1.2 地黄 地黄块根于2008年6月采自山西省临汾市
地黄产区，生长状况良好。块根为淡黄色，圆柱形，平
均根长10 cm，直径1.5 cm。
1.2 方法
1.2.1 土壤微生物的分离 采用稀释平板菌落计数法，
细菌用LB培养基，真菌用PDA培养基。
1.2.2 细菌鉴定 根据LB平板上的菌落形态、细胞的
显微观察和生理生化反应以及16S rDNA基因序列分
析结果[10]，参照伯杰氏细菌鉴定手册和常见细菌鉴定
手册进行化感细菌DH03和DH05的鉴定。
1.2.3 无菌滤液与菌悬液的制备 接种细菌于含有
250 mL液体LB培养基的1 L锥形瓶中，37℃、120 r/min
摇床培养两天（含菌发酵液）；培养液 4000 r/min离心
20 min，沉淀菌体用少量无菌水洗涤2次，用与原发酵
液相同体积的无菌水重悬浮得到菌悬液（细菌细胞）；
而上清液则用0.22 μm的滤器过滤，制备无菌滤液（无
菌发酵液）。
1.2.4 化感细菌对地黄生长的影响 利用沙土种植健康
地黄，将沙土于 121℃灭菌 30 min，冷却。将健康的地
黄块根分成小段，种入装有无菌沙土的花盆中，每盆种
2株，每处理共 5盆。用DH03和DH05菌株的无菌滤
液和菌悬液代替清水浇灌刚播种下的地黄块根，以灭
菌水浇灌作为阴性对照。10天后，将块根挖出后洗干
净，统计坏死情况。
1.2.5 地黄汁液对细菌生长的影响 称取健康地黄块根
5 g，表面消毒后切成小块，用组织捣碎机粉碎成浆，纱
布过滤，滤液用0.22 μm滤器过滤，制备无菌地黄块根
汁液。适量汁液加入含 250 mL LB液体培养基的 1 L
三角瓶中，使其终浓度相当于地黄重量为 5、10和
15 mg/mL，37℃、120 r/min摇床培养，调查地黄汁液对
细菌DH03和DH05生长的影响，另设相同体积的液体
LB培养基为阴性空白对照。
2 结果与分析
2.1 化感细菌分离
利用稀释平板菌落计数法，从连作 1年的土壤中
共获得 19株细菌，2株真菌。通过接种地黄叶片或块
根的侵染性试验，发现所有菌株均无侵染性，为非致病
菌。进而通过摇瓶LB发酵，测定其发酵液(48 h)对地
黄生长的影响，发现有 2株细菌(DH03和DH05)的培
养液滤液对地黄叶片有毒害作用（图1），表明这2株细
菌通过分泌化感效应分子而影响地黄生长，是典型的
化感细菌。
2.2 化感细菌的鉴定
经形态学、生理生化反应以及 16S rDNA序列分
析，能够产生对地黄有化感作用的细菌分别为恶臭假
单胞菌 (Pseudomonas putida DH05)和河生肠杆菌
(Enterobacter amnigenus DH03)，其中DH05菌株与恶
图1 化感细菌对地黄叶片的毒害作用
·· 228
郭利川等：地黄连作障碍机制分析
臭假单胞菌(Pseudomonas putida)的同源性达 100%，
DH03 菌株与肠杆菌属河生肠杆菌 (Enterobacter
amnigenus)的同源性达到100%（表1）。
2.3 化感细菌对地黄生长的影响
用DH03和DH05菌株的无菌滤液和菌悬液代替
清水浇灌刚播种下的地黄块根，10天后，用灭菌水浇
灌的阴性空白对照有 10%块根出现坏死斑，用DH03
和DH05菌株的无菌滤液处理的坏死斑率分别为90%
和100%。而2株细菌悬液处理组中，DH03和DH05菌
株处理的坏死斑率均为 30%，表明细菌的代谢产物是
导致地黄坏死的主要因素。
2.4 地黄对DH03和DH05生长的影响
将不同浓度的地黄汁液加入 LB培养基中培养
DH03和DH05菌株，测定其在37℃下的生长规律。结
果显示（图2），添加地黄汁液对2株化感细菌的生长均
有促进作用，而且促进作用的大小与添加地黄的量成
正相关。随着添加地黄浓度的增加，DH03和DH05菌
株进入对数期的时间以及倍增时间均缩短，而对数期
的持续时间则延长。表明地黄成分能够促进化感细菌
表1 菌株DH03和DH05的生理生化反应
项目
革兰氏染色
氧化酶反应
接触酶反应
V-P实验
硝酸盐还原
H2S产生
葡萄糖利用
吲哚实验
甲基红实验
蔗糖利用
28度生长
42度生长
明胶液化
柠檬酸盐利用
DH03
-
+
+
-
-
-
+
-
-
+
+
-
-
+
恶臭假单胞菌
-
+
+
-
ND
-
+
-
-
ND
+
-
-
ND
DH05
-
-
+
+
+
-
+
-
+
+
+
ND
ND
+
河生肠杆菌
-
-
ND
+
ND
-
+/-
-
+
+
+
ND
-
+
注：+：反应结果为阳性；-：反应结果为阴性；ND：未做此项试验；恶
臭假单胞菌和河生肠杆菌为《伯杰氏细菌鉴定手册》和《常见细菌鉴定
手册》中的生理生化指标。
DH03
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
培养时间/h
OD 6
00
0 mg/mL5 mg/mL10 mg/mL15 mg/mL
DH05
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
培养时间/h
OD 6
00
0 mg/mL5 mg/mL10 mg/mL15 mg/mL
图2 地黄含量对DH03和DH05生长的影响
的分裂增殖。
2.5 地黄连作障碍的细菌化感作用假说
根据细菌与地黄的相互关系，提出了地黄连作障
碍的细菌化感作用假说（图3），即：①化感细菌是一种
土壤常驻细菌，会向土壤中分泌化感物质毒害地黄；
②栽培地黄促进土壤中该类细菌的生长，使其成为优
势种群，随着连作次数的增加，该类细菌种群数量进一
步扩大，产生的化感物质越来越多，导致连作障碍更加
严重；③由于化感细菌为土壤常驻菌，无论栽培地黄与
否，都会在土壤中存在并不断释放化感物质，导致地黄
种植1年8~10年不能再种。 图3 地黄连作障碍的化感细菌假说
地黄
毒害
土壤
来源
积累
产生
化感细菌
促进
毒害
代谢产物
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3 讨论
目前有关引起地黄连作障碍的原因普遍认为有2
个，一个是由地黄化感物质引起的自毒作用[4,11-12]，另一
个是土壤微生态失衡所致[6-7,13]。但二者均缺乏直接证
据，也很难解释地黄种植 1年，8~10年不能再种的现
象。本研究通过对地黄连作土壤中生物与非生物因子
的分析，获得19株土壤常驻细菌，其中2株细菌鉴定为
恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida DH03)和河生肠杆
菌(Enterobacter amnigenus DH05)，并首次证明这 2株
细菌不能侵染地黄但对地黄生长有毒害作用，是典型
的化感细菌；另外，还发现地黄成分对化感细菌DH03
和DH05菌株的生长有显著的促进作用。提出的地黄
连作障碍的细菌化感作用假说整合并丰富了目前关于
地黄连作障碍的微生态失调理论与化感作用理论，将
为探讨地黄连作障碍的特殊之处提供新的途径，也为
控制地黄连作障碍提供了一条新的思路。
化感细菌通过分泌化感物质抑制植物生长或对植
物产生毒害作用 [14]，化感细菌多为假单胞菌属
(Pseadomonas)、肠杆菌属 (Enterobacter)、芽孢杆菌属
(Bacillus)、微杆菌属(Microbacterium)和克雷伯杆菌属
(Klebsiella)等的一些种[15]。Xie等[16]报道了一株恶臭假
单胞菌突变体可以通过分泌过量的吲哚乙酸来抑制油
菜幼苗根部的生长，抑制率可达 33%左右。本研究虽
证明恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida DH03)和河生
肠杆菌(Enterobacter amnigenus DH05)为化感细菌，对
地黄生长有抑制和毒害作用，但对其产生的化感物质
的种类及性质尚不清楚，值得进一步探讨。
4 结论
从地黄连作1年的土壤中分离到19株细菌，其中
2株细菌鉴定为恶臭假单胞菌 (Pseudomonas putida
DH03)和河生肠杆菌(Enterobacter amnigenus DH05)；
证明DH03菌株和DH05菌株是典型的化感细菌，不能
侵染地黄，但通过分泌化感物质对地黄生长有抑制和
毒害作用；发现地黄块根成分对DH03菌株和DH05菌
株的生长有促进作用。根据化感细菌与地黄的相互作
用，提出了引起地黄连作障碍的化感细菌作用假说，化
感细菌的化感作用可能是引起地黄连作障碍的重要原
因之一。
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