全 文 ：吉九里香碱体外诱导人大肠癌 HCT － 15 细胞凋亡的机理研究*
王三龙1，罗红梅2，蔡兵3，崔承彬4，阎少羽5，吴春福5
(1．中国食品药品检定研究院 国家药物安全评价监测中心，北京 100176;2．中国中医科学院眼科医院药剂科，北京 100040;
3．北京生物医药研究所，北京 100091;4．北京药理毒理研究所，北京 100850;5．沈阳药科大学中药学院药理系，沈阳 110016)
摘要 目的:探讨中药单体吉九里香碱体外诱导 HCT － 15 细胞凋亡的分子作用机理。方法:采用 Western Blotting、体外 Bcl －
xL蛋白竞争结合检测实验及 RT － PCR对吉九里香碱诱导细胞凋亡的机制进行研究。结果:结果显示 50 μmol·L －1吉九里香
碱分别作用 HCT － 15 细胞 6 h、12 h及 24 h，P53 蛋白表达水平基本没有变化;Cyto c呈时效性的从线粒体释放到胞质中，Bcl －
2 蛋白表达基本没有变化，Bcl － xL的表达被抑制在较低水平，吉九里香碱处理细胞 6 h后 Bax表达开始增加，Bax 与 Bcl － xL
蛋白表达的相对比例上调;与死亡受体通路中相关的 FADD表达未见异常，同时线粒体通路中的蛋白包括 Caspase － 7、Caspase
－ 8、Caspase － 9、Caspase － 3 等均没有被剪切，但相应的凋亡标志物 PARP和 Rb等以时间依赖形式被剪切;RT － PCR检测结
果显示 Bcl － 2 的 mRNA水平基本不变，而 Bax的 mRNA水平随时间的增加而略有增加，说明吉九里香碱从基因水平影响 Bax
靶基因的转录表达;另外，吉九里香碱能明显竞争 BH3 与 Bcl － xL蛋白的结合，强度甚至强于阳性药 HA14 － 1。结论:吉九里
香碱诱发 HCT － 15 细胞凋亡的分子机制在于从基因水平影响 Bax靶基因的转录表达，同时通过与 Bcl － xL蛋白的 BH3 结构
域特异性结合置换出 Bax蛋白以增加 Bax同源二聚体的浓度，进而影响二者的蛋白表达水平比例，最终导致线粒体功能紊乱
来发挥其诱导 HCT － 15 细胞凋亡的效应，且为 P53 和 Caspases非依赖型。
关键词:细胞凋亡;HCT － 15 细胞;分子作用;中药;生物碱;黑果黄皮;吉九里香碱;线粒体途径;死亡受体途径
中图分类号:R917 文献标识码:A 文章编号:0254 － 1793(2011)09 － 1736 － 07
* 国家重点基础研究发展规划项目(973 项目，No． 1998051113) ;国家杰出青年基金(No． 39825126)
第一作者 Tel:(010)67876251;E － mail:wangsanlong@ nicpbp． org． cn
Mechanism study on induction of apoptosis by girinimbrine in
HCT － 15 cell in vitro*
WANG San － long1，LUO Hong － mei2，CAI Bing3，CUI Cheng － bin4，
YAN Shao － yu5，WU Chun － fu5
(1． National Center for Safety Evaluation of Drugs，National Institutes for Food and Drug Control，Beijing 100176，China;
2． Eye Hospital of China Academy of Chinese Medical Sciences，Beijing 100040，China;3． Beijing Institute of
Biomedicine，Beijing 100091，China;4． Beijing Institute of Pharmacology and Toxicology，Beijing 100850，China;
5． Department of Pharmacology，School of Chinese Material Medica，Shenyang Pharmaceutical
University，Shenyang 110016，China)
Abstract Objective:To investigate the molecular mechanism study on induction of apoptosis by Chinese medicine
monomer girinimbrine in HCT －15 cell in vitro． Methods:The mechanism of apoptosis of HCT － 15 cells induced
by girinimbrine was investigated by Western Blotting，in vitro Bcl － xL competitive binding assay and reverse tran-
scription － PCR(RT － PCR)assay． Results:The results showed that the expression of P53 protein did not change
when HCT －15 cells was treated with 50 μmol·L －1 girinimbrine for 6，12，24 h，respectively;Moreover，the Cy-
to c was released from mitochondria into the cytosol in a time － dependent manner． The expression of Bcl － 2 pro-
tein kept unchangable and the expression of Bcl － xL has been suppressed to a lower level，therefore while Bax be-
gan to increase at 6 h after the treatment of girinimbrine，the ratio of Bax /Bcl － xL expression was up － regulated．
But the expression of proteins related to death receptor such as FADD，Caspase － 8 maintained invariable，and the
proteins of mitochondrial pathways including Caspase － 7，Caspase － 9 and Caspase － 3 were not cleaved，whereas
—6371— 药物分析杂志 Chin J Pharm Anal 2011，31(9)
DOI:10.16155/j.0254-1793.2011.09.035
PARP and Rb which are relevant key substrates for apoptosis were cleaved in a time － dependent manner． The re-
sult of RT － PCR assay indicated that the transcription level of mRNA for Bcl － 2 gene was not altered and Bax gene
increased slightly in HCT －15 cells treated with 50 μmol·L －1 girinimbrine for different times，revealing that Bax
gene was involved in the apoptosis induced by girinimbrine but Bcl － 2 was not． In addition，girinimbrine could
competitively bind with Bcl － xL protein structure domain and showed stronger binding affinity than that of the posi-
tive control HA14 － 1． Conclusion:The molecular mechanism of girinimbrine inducing HCT －15 cells apoptosis in-
volves in such processes as affecting the transcription level of Bax gene，binding with the Bcl － xL protein structure
domain and exchanging the Bax protein by specific binding with the BH3 structural domain of Bcl － xL protein to in-
crease the concentration of the Bax homodimers which further affect the ratio of Bax /Bcl － xL expression level and
at last leading to mitochondrial dysfunction and thus to induce cell apoptosis，but not depending on P53 and
Caspases of the death receptor and mitochondrial pathways．
Key words:apoptosis;HCT － 15 cell;molecular action;traditional Chinese medicine;alkaloid;Clausena dunniana
Levl．;girinimbrine;mitochondrial pathway;death receptor pathway
吉九里香碱(girinimbrine) ，又名吉尼宾，属
咔唑类生物碱化合物，系从隶属于芸香科(Ruta-
ceae)黄皮属(Clausena)的黑果黄皮(Clausena
dunniana Levl． )中分离得到。根据前期已经完成
的研究结果［1］发现吉九里香碱主要通过诱发人
大肠癌 HCT － 15 细胞凋亡来发挥其抑制肿瘤细
胞增殖作用，初步预测其可能通过作用线粒体来
发挥其诱发细胞凋亡的作用。另据文献检索发
现，有关该化合物抗人癌细胞方面的活性及作用
机制研究目前未见更多文献报道。因此本研究
的目的在于前期研究结果的基础上，进一步探讨
中药单体吉九里香碱体外诱导 HCT － 15 细胞凋
亡的作用机制。
1 仪器及试剂
SPECTRA MAX 型 plus 酶标仪(美国 Molecular
Devices Co．)、DRI － BLOCK DB 2A 恒温热板仪
(英国 TECHNE Inc．)、WB1 型转印仪(美国 SCIE －
PLAS Co．)、EPH － 6 型电泳凝胶自动成像系统(美
国 Cole － Pharmer Ins． Co．)、RPN 2069 型 ECL照相
仪(美国 Amerhsam Pharmacia Biotech Co．)、Gene-
Amp PCR System 9700(美国 Norwalk CT)、9814 －
Series Mini － Table 型紫外透射发射仪(美国 Cole －
Pharmer Ins． Co．)、DNA 电泳仪(北京市六一仪器
厂)、FluoStar /PolarStar Galaxy 型荧光计(德国 BMG
Labtechnology Pty． Ltd．)。
RPMI － 1640 培养基(Gibco) ;无支原体胎牛
血清(Hyclone) ;琼脂糖(日本和光制药工业株式
会社) ;蛋白酶 K、RNA 酶、溴化乙啶(ethidium bro-
mide，EB)、十二烷基磺酸钠(SDS)、N，N，N，N －
四甲基乙二胺(TEMED)、乙二胺四乙酸(EDTA)、
过硫酸铵(APS) ，美国 Sigma;丙烯 /双丙烯酰氨、
三羟甲基氨基甲烷 －碱(Tris －碱)、三羟甲基氨基
甲烷 －盐酸(Tris － HCl) ，美国 BIO － RAD Labora-
tories;蛋白质标准相对分子质量、BCA 蛋白定量试
剂盒、ECL 发光试剂盒，美国 PIERCE Chemical
Co．;HA14 － 1，美国 Sigma 公司;TRIZOL试剂
盒、逆转录合成第一链试剂盒，美国 Invitrogen Life
Tech．;随机引物(Random Primer) ，美国 Stratagene
公司;DNA maker，日本 TakaRa 公司，100，250，
500，750，1000，2000 bp) ;青霉素、链霉素(华北制
药有限责任公司)。
实验用抗体:鼠 P53 单抗、鼠 Bcl － 2 单抗、兔
Bax多抗、鼠 Caspase － 3 单抗、兔 pRb 多抗(美国
Santa Cruz Biotechnology) ;鼠 PARP 单抗、鼠 caspase
－ 7 单抗(美国 PharMingen) ;鼠 Bcl － xL 单抗(美国
BD Biosciences) ;鼠 FADD 单抗(美国 Cell Signaling
Tech．) ;鼠 Caspase － 8 单抗、鼠 Caspase － 9 单抗
(美国 NeoMarkers) ;辣根过氧化酶标记的抗鼠抗
体、辣根过氧化酶标记的抗兔抗体(美国 Amersham
Life Science Co．)。
吉九里香碱:本实验室自制，质量分数≥99%，
样品用 80%甲醇配制成浓度为 2 mg·mL －1的储存
液，保存于 － 20 ℃。临用时稀释到相应浓度进行实
验。FITC标记的 Bid － BH3 多肽(中科院动物所合
成)。
2 方法
2. 1 细胞培养 人大肠癌 HCT － 15 细胞(日本引
进)在 5% CO2、37 ℃的条件下生长于含有 10%的
胎牛血清的 RPMI － 1640 培养基中，取对数生长期
细胞用于实验。
—7371—药物分析杂志 Chin J Pharm Anal 2011，31(9)
2. 2 蛋白印迹分析吉九里香碱对相关蛋白表达的
影响 取对数生长期的 HCT － 15 细胞按 2 × 105个
·mL －1的密度接种到 Φ30 mm 培养皿中，5 mL /
dish，37 ℃培养过夜;10 μmol·L －1吉九里香碱溶液
处理细胞 6，12，24 h 后，收集细胞后加细胞裂解液
裂解，于 100 ℃热板上加热 5 min 得总蛋白提取液，
按照蛋白定量试剂盒说明测定蛋白浓度。按所测浓
度，每个样品各取蛋白 100 μg，加蛋白上样缓冲液
到 15 μL，混匀后，100 ℃加热 5 min，用微量注射器
将各组蛋白溶液 15 μL 加到 SDS 聚丙烯酰胺凝胶
上样孔内;蛋白电泳分离。电泳结束后，在 4 ℃下将
凝胶上的蛋白质电转移到硝酸纤维素膜上，用封阻
液封闭硝酸纤维素膜上非特异性结合位点 2 h;然后
将 1∶ 1000 稀释的一抗与硝酸纤维素膜室温反应 2
h，漂洗 4 次后，再将 1∶ 1000 稀释的二抗与硝酸纤维
素膜室温反应 2 h，漂洗 4 次。然后用 ECL 发光试
剂盒显色，在感光相机内成像。将免疫印迹所得结
果用凝胶图像处理系统扫描分析目标区带积分光密
度(Integral opticaldensity，IOD)值。实验在相同条
件下重复 3 次。
2. 3 Bcl － xL蛋白竞争结合实验 本实验中采用
的 FITC － Bid － BH3(简称 F － BH3)是用荧光素
FITC标记的人 Bid BH3 多肽，该多肽能与 Bcl － xL
特异性结合，POLARSTAR能够检测到不同浓度的 F
－ BH3 的荧光变化。如果在反应体系里有一种小
分子化合物能够与 Bcl － xL 发生特异性结合，则表
示能与 F － BH3 竞争结合 Bcl － xL，表现为 F － BH3
与 Bcl － xL荧光结合强度下降。若检测的荧光强度
数值低，则表示该化合物与 Bcl － xL 结合多;数值
高，则相反。
在 96 孔板中首先进行 Bcl － xL蛋白(包被浓度
5 μg·mL －1)包板，然后加入 0. 025 μmol·L －1 F －
BH3，37 ℃下反应 90 min，用 100 mL PBS(pH 为
7. 4)清洗 3 次，加入 50 μmol·L －1吉九里香碱溶液
于 30 ℃下反应 30 min 后用 100 mL PBS(pH 为
7. 4)洗掉未反应的吉九里香碱和多肽，POLARSTAR
检测 96 孔板的荧光强度，每个浓度作 3 个重复孔，
计算 3 个重复孔的平均荧光强度，独立重复 3 次实
验，计算均值及标准偏差并作图。实验中用 HA14
－ 1 作为阳性药，浓度为 9 μmol·L －1(用无菌 DM-
SO配制成 30 mmol·L －1储存液，－ 80 ℃保存，用前
解冻并稀释) ，步骤同上。
2. 4 RT － PCR 分析吉九里香碱对 Bcl － 2 /Bax
mRNA表达的影响
2. 4. 1 Bcl － 2、Bax及 β － actin的引物
根据 Genebank中公布的人 Bcl － 2、Bax 及 β －
actin mRNA 全序列，用 Generunner 软件(美国 Mi-
crosoft公司)设计，然后由上海生工公司代为合成。
内参 β － actin 引物序列:β － actin － 5’5’—
ATC TGG CAC CAC ACC TTC TAC A—3’
β － actin －3’5’—GTT TCG TGG ATG CCA CAG
GAC T—3’，扩增片段长度:577 bp;Bcl － 2 引物序
列:Bcl － 2 － 5’5’—CGA CGA CTT CTC CCG CCG
CTA CCG C—3’，Bcl － 2 － 3’5’—CCG CAT GCT
GGG GCC GTA CAG TTC C—3’，扩增片段长度:318
bp;Bax引物序列:Bax － 5’5’—TCC CAC CAA GAA
GCT GAG CGA G—3’，Bax － 3’5’—GTC CAG CCC
ATG ATG GTT CT—3’，扩增片段长度:271 bp。
2. 4. 2 RNA 提取 使用 TRIZOL试剂盒(1 mL
TRIZOL /1 × 107细胞) ，按照试剂盒说明书中的
方法，通过匀浆、RNA 分离、RNA 沉淀、RNA 洗涤
等步骤获得 RNA，将 RNA 重新溶解后使用 DU70
型紫 外 分 光 光 度 计 测 RNA 的 吸 光 度 值
(A260 /280 nm) ，以 DEPC 处理的琼脂糖电泳检测
RNA 的 完 整 性 (28S:18S) ，将 RNA 存 放 于
－ 20 ℃保存备用。
2. 4. 3 逆转录(Reverse Transcription)合成 cDNA
第一链 在 0. 2 mL EP 管中加入:5 × buffer 8
μL，0. 1 mol· L － 1 DTT 4 μL，10 mmol· L － 1
dNTPs 1 μL，Oligo(dT)12 － 18(0. 5 μg·μL － 1)1
μL，RNase inhibitor 0. 5 μL，总 RNA 2 μg，DEPC
水定容至 40 μL。混匀后，尽快放入 PCR 中，按
照设定程序进行反应:60 ℃加热 60 min，72 ℃加
热10 min，4 ℃保存。
2. 4. 4 PCR 扩增(50 μL /管) 在 0. 2 mL 薄壁
PCR专用离心管中，依次加入:10 × buffer 5 μL，
10 mmo l· L －1 dNTPs 1 μL，10 pmol· L －1 primer
12 μL，10 pmol·L －1 primer 22 μL，Taq 酶 1 μL，
cDNA 5 μL，ddH2O 34 μL，定容至 50 μL。β － actin
反应条件:94 ℃预变性 5 min，94 ℃变性 40 s，57 ℃
退火 40 s，72 ℃延伸 1 min，30 个循环后，72 ℃后延
伸 10 min，4 ℃保存;Bcl － 2 反应条件:97 ℃预变性
5 min，94 ℃变性 1 min，72 ℃退火 1 min，72 ℃延伸
1 min，30 个循环后，72 ℃后延伸 7 min，4 ℃保存;
Bax反应条件:94 ℃预变性 5 min，94 ℃变性 1 min，
60 ℃退火 45 s，72 ℃延伸 45 s，35 个循环后，72 ℃
后延伸 10 min，4 ℃保存。
2. 4. 5 PCR产物分析 扩增完成后，每个 EP管体
—8371— 药物分析杂志 Chin J Pharm Anal 2011，31(9)
积为 50 μL。每管精确取出 18 μL，分别向管中加入
2 μL 10 × Loading buffer 混匀，取出 10 μL 上样，在
1. 5% (w /v)琼脂糖 TAE /TBE 缓冲液凝胶电泳
(4 V·cm －1)中电泳，EB 染色 15 min，凝胶成像分
析系统成像并分析目标区带 IOD 值。实验在相同
条件下重复 3 次。
2. 5 统计学处理 实验结果以均数 ±标准差(x—
± s)表示，采用 SPSS(11. 5 版)统计软件进行组
间比较采用方差分析，p ＜ 0. 05 为具有统计学
意义。
3 结果
3. 1 蛋白印迹分析吉九里香碱对相关蛋白表达影
响的实验结果 由图 1 和表 1 结果可知，50 μmol·
L －1吉九里香碱溶液作用于 HCT － 15 细胞 6，12，
24h，不影响 P53 蛋白和 Bcl － 2 蛋白的表达;在 6 h
时即可明显抑制 Bcl － xL的表达(p ＜ 0. 05) ，并一直
维持低表达到 24 h(p ＜ 0. 001) ;对于 Cyto c，作用
6 h(p ＜ 0. 001) ，能够明显促进 Cyto c从线粒体中的
释放，在整个作用时间里，能够缓慢地促进 Cyto c从
线粒体中的释放，到 12 h、24 h时释放程度较最初有
明显提高(p ＜ 0. 001) ;而 Bax 的表达在 6 h 稍有增
加，12 h时开始明显增强(p ＜ 0. 001) ，到 24 h 时达
到最大(p ＜ 0. 001) ，具有一定的时效性，相对于 Bcl
－ xL蛋白的表达，它们之间的比值呈增高趋势;吉
九里香碱在整个作用时间段中，都没有将 Caspase －
3、Caspase － 7、Caspase － 9 剪切成相应的活性片段，
且相应的酶原表达也基本没有变化;但是作为细胞
凋亡时被剪切的标志性底物 PARP，，当吉九里香碱
作用 12 h和 24 h即由 116 × 103 剪切成 85 × 103 的
片段，且随时间的延长，形成的片段更亮;而另一标
志性底物 Rb，当吉九里香碱作用 24 h 时被剪切。
进一步又探讨了死亡受体通路中相关蛋白的表达。
结果发现，吉九里香碱作用于 HCT － 15 细胞不同
时间后，基本不影响FADD的表达，且也不剪切
Caspase － 8 酶原，说明吉九里香碱诱发的凋亡也
不经过死亡受体通路。
图 1 蛋白印迹分析吉九里香碱处理 HCT － 15 细胞不同时间
Caspases、PARP和 Rb相关蛋白的表达、剪切
Fig 1 Western Blotting analysis for the expression of associated proteins
and the cleavage of Caspases，PARP and Rb after treated by girinimbrine
for different time periods in HCT － 15 cells
表 1 凋亡相关蛋白扫描分析(x— ± s，n =3)
Tab 1 The scanning analysis of apoptosis associated proteins
时间(time) P53 FADD Bcl － 2 Bcl － xL Bax Cytoc β － actin
0 h 710. 6 ± 22. 1 709. 3 ± 31. 2 215. 1 ± 20. 2 250. 5 ± 18. 7 200. 6 ± 17. 9 48. 3 ± 6. 1 850. 3 ± 89. 6
6 h 708. 2 ± 21. 3 713. 2 ± 22. 8 208. 5 ± 19. 5 210. 2 ± 15. 6a 215. 4 ± 20. 2 211. 1 ± 22. 2c 860. 3 ± 90. 1
12 h 707. 8 ± 30. 5 715. 8 ± 32. 3 207. 8 ± 18. 9 50. 8 ± 10. 2c 403. 1 ± 35. 6c 250. 5 ± 19. 4c 851. 8 ± 90. 0
24 h 711. 3 ± 22. 5 711. 2 ± 30. 5 205. 6 ± 15. 5 8. 1 ± 2. 2c 440. 8 ± 38. 4c 253. 6 ± 20. 0c 849. 2 ± 88. 7
注(note) :a p ＜0. 05，b:p ＜0. 01，c:p ＜0. 001，与作用 0 h处理组比较(compared with 0 h treatment group)
—9371—药物分析杂志 Chin J Pharm Anal 2011，31(9)
3. 2 吉九里香碱与 FITC － Bid － BH3 竞争结合 Bcl
－ xL结果 由图 2 可知，阳性药 9 μmol·L －1 HA14
－ 1 溶液与 50 μmol·L －1吉九里香碱溶液均能够明
显抑制 F － BH3 与 Bcl － xL蛋白的结合(p ＜ 0. 05) ，
且吉九里香碱更优于 HA14 － 1。显示出其诱导细
胞凋亡作用可能与 Bcl － xL 有关，从而也就可能影
响 Bcl － xL 蛋白的表达，这与用 Western Blotting 方
法检测到的 Bcl － xL蛋白表达水平随作用时间延长
而下降相一致。
图 2 吉九里香碱抑制 F － BH3 与 Bcl － xL的结合(x— ± s，n = 3)
Fig 2 Girinimbrine could inhibit the binding assay between F － BH3 and
Bcl － xL
浓度(concentration) :F － BH3，0. 025 μmol·L －1;HA14 － 1，9 μmol·
L －1;吉九里香碱，50 μmol·L －1与 F － BH3 比(compared with F －
BH3) ，* p ＜ 0. 05
3. 3 RT － PCR 分析吉九里香碱对 Bcl － 2 /Bax
mRNA 表达的影响 图 3 和表 2 显示了 Bax和 Bcl
－ 2 及 β － actin 的 PCR 产物凝胶电泳结果，扩增
产物分别为 271 bp、318 bp 和 577 bp。吉九里香
碱作用细胞 6 h、12 h、24 h 时，Bcl － 2 mRNA 的转
录表达基本无变化。但对 Bax 的表达有影响，在 6
h时，Bax的 mRNA表达与阴性对照比变化不太明
显;从作用 12 h开始到 24 h时，Bax的 mRNA表达
均明显高于阴性对照(p ＜ 0. 001)。在整个实验过
程中，β － actin 的表达基本不随时间的变化而变
化。
图 3 RT － PCR分析吉九里香碱处理 HCT － 15 细胞不同时间 Bcl －
2 和 Bax mRNA 转录水平
Fig 3 RT － PCR analysis for the transcription level of Bcl － 2 and Bax
mRNA after treated by girinimbrine for different time periods in HCT － 15
cells
表 2 Bcl － 2 和 Bax转录表达蛋白扫描分析(x— ± s，n =3)
Tab 2 The scanning analysis of Bcl － 2 and Bax transcr －
iption proteins
时间 /检测蛋白 Bcl － 2 Bax β － actin
0 h 236. 4 ± 18. 8 107. 3 ± 11. 5 1120. 5 ± 100. 3
6 h 240. 1 ± 20. 1 110. 3 ± 13. 2 1109. 7 ± 89. 9
12 h 231. 8 ± 18. 2 507. 8 ± 80. 3a 1123. 8 ± 103. 7
24 h 230. 1 ± 13. 7 1068. 3 ± 110. 1a 1130. 7 ± 106. 5
注(note) :a p ＜ 0. 001，与作用 0 h 处理组比较(compared with 0 h treat-
ment group)
4 讨论
分离自黑果黄皮的吉九里香碱，在 1970 年就由
Joshi BS［1］等人分离得到，经文献检索发现无相关活
性研究的报道，尤其是有关该化合物抗癌活性的研
究目前未见更多文献报道。在先前的系列研究中，
发现吉九里香碱能够诱发细胞凋亡来抑制人大肠癌
HCT －15 细胞增殖，可能通过作用线粒体来发挥诱
发细胞凋亡作用［2］，但具体作用机理未知。
大量的实验结果表明，多种因素诱导的细胞凋
亡都有 P53 基因的参与。作为“基因警卫”P53 具有
正向调节细胞凋亡的功能［3］，但也有其他 P53 非依
赖型通路可以诱导凋亡［4，5］。鉴于 P53 作用的重要
性，利用 Western Blotting 方法考察了吉九里香碱对
P53 蛋白表达的影响。结果显示，吉九里香碱作用
于 HCT －15 细胞不同时间，对 P53 蛋白表达水平基
本没有影响，提示吉九里香碱诱发的细胞凋亡为
P53 非依赖型。
众所周知，线粒体是真核细胞能量代谢的中
心，因此细胞凋亡过程中对线粒体损伤的最直接
结果是其正常功能的丧失。在凋亡细胞中，线粒
体至少在 3 个层次上参与对细胞凋亡的调控。
(1)线粒体可通过释放凋亡蛋白因子诱导细胞凋
亡，如释放 Cyto c诱导 Caspase活化;(2)通过反馈
放大效应，Caspase可活化 Bcl － 2 家族蛋白如 Bid、
Bak等，而这些因子反过来又造成更多的线粒体损
伤;(3)即使在 Caspase 依赖或不依赖的凋亡途径
都不能正常运作的情况下，线粒体正常功能的丧
失也会最终导致细胞的死亡［6］。另外 Bcl － 2 家
族蛋白 Bcl － 2、Bcl － xL通过抑制 Cyto c 的释放而
抑制线粒体介导的凋亡 ［7］。Bax、Bak 可直接结合
Bcl － 2，抑制其抗凋亡作用;或从 Bcl － xL － Apaf －
Cyto c 复合物中把 Cyto c 置换出来，导致 Caspase
活化，促进凋亡发生［8］。这个促进凋亡途径往往
是 Caspase依赖性的，但是也有研究报道，一些促
—0471— 药物分析杂志 Chin J Pharm Anal 2011，31(9)
凋亡蛋白如 Bax 等通过锚定于线粒体外膜上，从
而诱发线粒体损伤及细胞凋亡，但是在这个过程
中 Caspase家族酶并没有被激活［9 ～ 11］。在本研究
中，利用Western Blotting方法检测了与 2 种细胞凋
亡途径相关的一些蛋白如 P53、Bcl － 2、Bcl － xL、
Bax、Cyto c、Caspase － 3、Caspase － 7、Caspase － 8、
Caspase － 9、PARP、Rb 和 FADD 等的时效性表达
情况。结果显示吉九里香碱主要是通过诱发 HCT
－ 15 细胞线粒体功能紊乱，抑制 Bcl － xL 的表达，
促进 Bax的表达增强进而诱发细胞凋亡，但所致
凋亡通路与 2 个经典的 Caspase 依赖途径无关，为
Caspase和 P53 非依赖型。
X光晶体衍射 Bcl － xL蛋白的三维空间结构显
示，其 BH1、BH2 和 BH3 结构域围成了一个疏水的
束缚口袋，通过定点突变实验证实这一疏水口袋是
保护细胞不进行凋亡的活性中心，与之高度同源的
Bcl － 2 也具有类似结构;而 Bax、Bid 及 Bak 则通过
各自的 BH3 结构域与疏水的口袋结合，从而促发凋
亡的发生。另外，目前已发现包括 HA14 － 1、BH31
－ 1 及 Antimycin 等［12 ～ 14］非肽类小分子，能特异性
的与 Bcl － 2 /Bcl － xL 作用，使之无法与 Bax、Bid 等
促凋亡蛋白结合，导致 Bax同源二聚体浓度的增加，
从而诱发多种癌细胞发生凋亡。在本研究中，吉九
里香碱相对分子质量仅有 263，也属于非肽类小分
子化合物，为此，利用荧光标记合成的 BH3 短肽，使
其与 Bcl － xL相互作用，检测在吉九里香碱存在条
件下与 BH3 短肽竞争结合 Bcl － xL 时荧光强度的
变化。结果显示，吉九里香碱明显与 BH3 竞争结合
Bcl － xL蛋白，结合强度高于阳性药 HA14 － 1，说明
吉九里香碱诱发 Bcl － xL 蛋白表达水平的下降，很
可能是由于吉九里香碱通过竞争结合 Bcl － xL 蛋白
表面的 BH3 结构域，使其不能与 Bax 等促凋亡蛋白
结合形成异源二聚体或将 Bax从异源二聚体中置换
出来，以增加胞浆中 Bax同源二聚体的浓度，进而促
发细胞凋亡。由此推测 Bcl － 2 /Bcl － xL 蛋白的
BH3 结构域有可能是吉九里香碱的一个作用靶点，
它有可能成为一个有潜力的小分子先导化合物，用
于抑制 Bcl － 2 /Bcl － xL抗凋亡作用，并提示可以进
一步根据其结构来进行相关类似物的合成，以增加
作用的特异性。
进一步研究还发现，Bcl － 2 蛋白是通过抑制线
粒体膜的通透性和阻止 Cyto c 的释放而发挥作
用［7］;而促凋亡蛋白成员如 Bax 与 Bcl － 2 同源，具
有保守区域 BH1 － BH2。Bax与 Bcl － 2 /Bcl － xL基
因的蛋白产物可以通过保守区域彼此形成同源或异
源二聚体;Bax同源二聚体是促凋亡活性所必需的，
它在线粒体外膜上构成完整的 Cyto c 释放通道，因
此同源二聚体的形成是线粒体功能失调导致细胞凋
亡死亡的必要途径;而 Bcl － 2 /Bcl － xL 则必须与
Bax形成异源二聚体才能发挥其阻止细胞死亡的作
用，且 Bcl － 2 的凋亡保护作用与 Bcl － 2 /Bax 异源
二聚体的数量无关，而是取决于未与 Bax结合的 Bcl
－ 2 的数量，因此其蛋白质的相对表达水平是调节
凋亡进程的关键，二者的比例变化是决定细胞凋亡
敏感性的变阻器［1 5 ～ 2 0］。RT － PCR 法可以通过检
测基因转录的 mRNA量的变化，从而反应相应蛋白
表达量的变化，因此本实验利用 RT － PCR技术检测
了 Bax 与 Bcl － 2 基因的 mRNA 的变化，结果显示
Bcl － 2 的 mRNA水平基本不变，而 Bax的 mRNA表
达水平随时间的增加而增加，因此推测多余的 Bax
可能通过彼此间形成同源二聚体以增加同源二聚体
的浓度从而促发细胞凋亡。由此推测吉九里香碱可
能通过诱发 Bax mRNA 的上调进而通过间接增加
Bax基因的蛋白表达产物同源二聚体的浓度来促发
细胞凋亡。
综上所述，吉九里香碱诱发 HCT － 15 细胞凋亡
的分子机制在于从基因水平影响 Bax靶基因的转录
表达，同时通过与 Bcl － xL 蛋白的 BH3 结构域特异
性结合置换出 Bax 等促凋亡蛋白，从基因和蛋白水
平影响二者的蛋白表达水平比例，最终导致线粒体
功能紊乱来发挥其诱导 HCT － 15 细胞凋亡的作用，
但所致凋亡通路与 2 个经典的 Caspase 依赖途径无
关，为 Caspase 和 P53 非依赖型。至于具体是促发
哪条途径来导致凋亡标志性底物的剪切目前还不清
楚，还有待以后做更进一步的研究。
参考文献
1 Joshi BS，Kamat VN，Gawad DH，et al． On the structures of girinim-
bine，mahanimbine，isomahanimbine，koenimbidine and murray-
acine． Tetrahedron，1970，26(5) :1475
2 WANG San － long(王三龙) ，CAI Bing(蔡兵) ，CUI Cheng － bin
(崔承彬) ，et al． Study on induction of apoptosis by girinimbine in
HCT － 15 cell in vitro(吉九里香碱体外诱导 HCT － 15 细胞凋亡
的研究)． Chin J Pharm Anal(药物分析杂志) ，2008，28(2) :176
3 Oren M． Relationship of p53 to the control of apoptotic cell death．
Semin Cancer Biol，1994，5(3) :221
4 Kerr JF，Wyllie AH，Currie AR． Apoptosis:a basic biological phe-
nomenon with wide － ranging implications in tissue kinetics． Br J
Cance，1972，26(4) :239
5 Kerr JF，Winterord CM，Harmon BV． Apoptosis． Its significance in
—1471—药物分析杂志 Chin J Pharm Anal 2011，31(9)
cancer and cancer therapy． Cancer，1994，73(8) :2013
6 LIU Fang(刘芳) ，MAO Xiao － hua(毛晓华)． Mitochondrion － me-
diated apoptosis(线粒体介导的细胞凋亡研究进展)． Mod Med J
(现代医学) ，2002，30(3) :201
7 Yang J，Liu X，Bhalla K，et al． Prevention of apoptosis by Bcl － 2 re-
lease of cytochrome c from mitochondria blocked． Science，1997，275
(5303) :1129
8 Antonsson B，Montessuit S，Sanchez B，et al． Bax is present as a high
molecular weight oligomer /complex in the mitochondrial membrane
of apoptotic cells． J Biol Chem，2001，276(15) :11615
9 Xiang J，Chao DT，Korsmeyer SJ． BAX － induced cell death may not
require interleukin 1 beta － converting enzyme － like proteases． Proc
Natl Acad Sci USA，1996，93(25) :14559
10 Dauglas RG，Reed JC． Mitochondria and apoptosis． Science，1998，
281(5381) :1309
11 Bredesen DE． Apoptosis:Overview and signal transduction pathways．
J Neurotrauma，2000，17(10) :801
12 Degterev A，Lugovskoy A，Cardone M，et al． Identification of small
－ molecule inhibitors of interaction between the BH3 domain and
Bcl － xL． Nat Cell Biol，2001，3:173
13 Enyedy IJ，Ling Y，Nacro K，et al． Discovery of small － molecule in-
hibitors of Bcl － 2 through structure － based computer screening． J
Med Chem，2001，44(25) :4313
14 Tzung SP，Kim KM，Basanez G，et al． Antimycin A mimics a cell －
death － inducing Bcl － 2 homology domain 3． Nat Cell Biol，2001，3
(2) :183
15 Otter I，Conus S，Ravn U，et al． The binding properties and biological
activities of Bcl － 2 and Bax in cells exposed to apoptotic stimuli． J
Biol Chem，1998，273:6110
16 Han J，Sabbatini P，Perez D，et al． The E1B 19K protein blocks ap-
optosis by interacting with and inhibiting the p53 － inducible and
death － promoting Bax protein． Genes Dev，1996，10(4) :461
17 Oltvai ZN，Milliman CL，Korsmeyer SJ． Bcl － 2 heterodimerizes in vi-
vo with a conserved homolog，Bax，that accelerates programed cell
death． Cell，1993，74(4) :609
18 Oltvai ZN，Korsmeyer SJ． Checkpoints of dueling dimers foil death
wishes． Cell，1994，79:189
19 Yin XM，Oltvai ZN，Korsmeyer SJ． BH1 and BH2 domains of Bcl － 2
are required for inhibition of apoptosis and heterodimerization with
Bax． Nature，1994，369:321
20 Yang E，Zha JP，Jockel J，et al． Bad，a heterodimeric partner for Bcl
－ xL and Bcl － 2，displaces Bax and promotes cell death． Cell，
1995，80(2) :285
(本文于 2011 年 2 月 28 日收到
檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾
)
欢迎订阅 2012 年《药物分析杂志》
《药物分析杂志》是由中国科学技术协会主管，中国药学会主办，中国食品药品检定研究院(原中国
药品生物制品检定所)药物分析杂志编辑部编辑出版的学术性期刊。主要栏目有研究论文、交流、综述
等。报道化学药物、中药与天然药物、抗生素、蛋白质、多肽类药物、生物技术药物等的分析、质量标准研
究、临床药物分析、药物分析基础理论与实践以及新方法、新技术的应用，并及时报道国家重大研究课题
的最新成果。
本刊获 2006 年、2007 年、2008 年中国科协精品科技期刊工程项目 C类资助，获 2009 年中国科协精
品科技期刊示范项目证书，2010 年、2011 年再度获得中国科协精品科技期刊工程 C类项目资助。
本刊为我国自然科学核心期刊、中文核心期刊、全国统计源期刊，被国内外主要检索系统收录。
本刊坚持质量第一、面向广大读者，以其独具的深度与广度展示我国药物分析的现状与发展。
本刊为月刊，大 16 开本，国内外公开发行。每期定价 30 元，全年定价 360 元，国内邮发代号:2 －
237，国外读者请同中国国际图书贸易总公司(北京 399 信箱)联系。欢迎广大读者到当地邮局订阅，并
欢迎有关专业人员集体订购，价格从优。
本刊已将创刊以来的文章制成光盘，需要者请与本刊联系。
希望为本刊推广发行者，价格另议。
地址:北京市天坛西里 2 号中国食品药品检定研究院《药物分析杂志》编辑部(100050)
联系人:刘小帅
电话:(010)67058427 － 8 传真:(010)67012819 － 4
编辑部网址:www． ywfxzz． cn 浏览网址:www． nicpbp． org． cn
E － mail:ywfx@ nicpbp． org． cn
《药物分析杂志》编辑部
—2471— 药物分析杂志 Chin J Pharm Anal 2011，31(9)