全 文 ：第10 卷 第 l 期
1 98 9年 3月
热 带 作 物 学 报
CH I NE S E J O U R N A LO F T R
.
O P I C A LC R O P S
V o l
。
1 0 No
。
1
M
a r 。 1 98 9
余甘子对强致癌物质
N 一亚硝基化合物合成的阻断作用(二 ) `
候开卫 刘凤书 杨巨武
( 中国林业科学研究院萦胶研究所 )
程 列二
( 北京医科大学公共卫生学院 )
摘 要
本文采用O h: 扒m a 1 9 8 1年建立的定量研究体内亚硝化的方法 , 研究了余甘子果汁在大鼠体
内对 N一亚硝基化合物合成的阻断作用 。 实验在给予大鼠能在体内合成 N一亚硝基化合物的两种
前休物— L 一脯氨酸和亚硝酸钠的同时 , 分别给予同浓度的抗坏血酸和余甘子果汁后 , 收集 24小时的尿浓 , 用气相色谱一热能分析仪测定处理后的 N P R O 甲醋。 结果表明 , 余甘子果汁能有
效地阻断动物体内 N P R O 的合成 , 其阻断率明显地优越于杭坏血酸 , 从而提示出余甘子果汁除
所含的抗坏血酸外 , 还有其它成份能阻断前休物在动物体内的亚硝化反应 。
关份阅 : 余甘子 , 阻断率 , 亚硝基脯氨酸 , 强致痛物。
一 、 月lJ 亩
N 一亚稍基化合物是一种强致癌物质 , 它对各种动物的各个器官和组织均会诱发肿瘤 。
N 一亚硝基化合物 , 特别是它的前体 -一硝酸盐 、 亚硝酸盐和胺类 , 广泛存在于食物及人类的环竞中。 人类不但接触 巳形成的亚硝基化合物 , 而且经常摄入存在于食品中的可行亚硝化
反应的含氮化合物 , 在体内合成相应的 N 一亚硝基化合物 。 这可能是人体内亚硝胺的主要来
源 cl 〕。 M i : vi hs 指 出 , 胃癌的发病率与亚硝酸盐的摄入有显著的相关性 吻 。 研 究N一亚硝
基化合物在动物体内合成的阻断作用 , 对于预防人类接触较多的此类致癌物对人类的潜在危
害 , 具有重要意义 。
1 9 8 5年我们 用余甘子汁 , 在体外模拟胃液的条件下对 N一亚硝基吗琳形成的阻断作用 进
行了研究 , 其阻断率比同浓度的抗坏血酸溶液的阻断率要高得多〔” 〕。 在 此 基 础 上又 采 用
O hs h i o
a建立的定量研究体内亚硝化的方 法〔` 〕 , 进一步研究 了余甘子果汁对动物体内 N 一
亚硝基化合物合成的阻断作用 。 本文即报导该项研究的结果 。
本文于 1 0 5 7年 1 0月 2 5日收到。
带宋圃菊教授 、 唐乾若研究员对本项研究进行了指导 , 在此表示感谢。
. 带程列 , 原为北京医科大学公共卫生学院81 级学生 。
热 带 作 物 学 报 1 0卷
二 、 材料和试剂
1
. 余甘子汁 : 采自云南省景东县自然分布的山甘野生种的果实 , 洗净 、 晾干 、 去核 、
压榨而得 。 p H值为 2 . 65 , 抗坏血酸 含量为 52 1 m g / d1 。
2
. 抗坏血酸溶液 : 称取抗坏血酸 ( A R ) 2 6 0 . 5 m g , 用缓冲液定容至 50 m l 夕 此液含抗
坏血酸 5 2 1m g d/ 1。 取 l . Zm l与同体积余甘果原汁所含抗坏血酸量相当 , 即 36 卜m ol 。
3
.
o
.
08 M亚硝酸钠溶液 : 称取亚硝酸钠 ( A R ) 2 76 m g , 用 p H 3 , 0的柠檬 酸一磷 酸 氢
二钠缓冲液定容至 50 m l , 每次用前新鲜配制 。
4
。
o
.
08 M L一脯氨酸溶液 : 称取 L一脯 氨酸 ( 纸层析纯 ) 4 6 5 . 5 5m g , 用缓冲液 定 容
至 5 0 nr l 。
5
.
N P R O标准液 : 称取 N P RO 〔国际癌瘤研究机构 ( I A R C )赠送 〕 20 m g , 溶于 50 m l无
水 乙醇 , 为储备液 。 取此液 1 m l用无水乙醇稀释至 10 m l , 为应用 液 , 含N P R O 40 林 g / m l 。
6
.
N一亚硝基呱可酸 ( N P I C ) 标准液 : 称取 N P IC ( I A R C赠送 ) 4 m g , 溶于 1 0 m l无
水 乙醇 ,为储备液 。取此液 1 m l , 用无水乙醇稀释至 10 m l , 为应用液 。 此液含 N IP C 40 协 g /m l 。
7
. 重氮甲烷制备 : 由亚硝基甲基脉制备 , 按文献 〔幻方法 , 用甲胺和亚硝酸钠合成 N一
亚硝基甲基脉 。 制备重氮 甲烷时 , 在含有 20 m 1 6 0%的氢氧化钾溶液 、 4 o m l甲醇及 1 20 m l 乙醚
的圆底烧瓶中加入 2 克干燥 N 一亚硝基 甲基脉 , 轻轻摇动 , 使产生气泡并出现黄色 。 每次用
前新鲜配制。
8
.
20 %氨基磺酸按八 . SM 硫酸溶液 ( A S ) : 取 50 m l 18 M 浓 硫 酸 ( A R ) , 加 水至
s o o m l , 称取 1 0 0克氨基磺酸按 ( A R ) 溶于 s o o m l 1 . 8 M硫酸 。
9
. 醋酸 乙醋等试剂均为分析纯 。
1 0
. 旋 转蒸发仪 . Z F Q一 1 型 , 天津市第一玻璃厂出品 。
1 1
. 气相色谱仪 ( G C ) : S P一 2 3 0 5型 , 北京分析仪器厂出品 。
1 2
. 热能分析仪 ( T E A ) : 543 型 , 美国热电子公司出品 。
1 5
. 动物 : W i s t e r正常雄性大自鼠 , 体重 2 4 0~ 2 60克 。
三 、 实验方法
采用 1 9 8 1年 O五s ih m a 提出的定量方 法 c4 〕 , 即以气相 色谱一热能分析仪测定摄入 L 一脯
氨酸和亚硝酸钠后 , 2 4小时尿中排出的并经处理的亚硝基脯氨酸 ( N P RO ) 甲醋 , 定量地反
映动物体内N一亚硝化的情况 。
( 一 ) 大鼠体内亚硝化
选择 13 只健康雄性大白鼠 , 实验前禁食过夜 。 以自身为对照 , 按下列分期顺序先后给予
不同食物 。
第 1期 : 不给任何食物 , 即无处理的对照期 ,
第 2 期 : L一脯氨酸 ,
第 3 期 : 亚硝酸钠 ,
第 4 期 : L一脯氨酸 十 亚硝酸钠 ,
i期 侯开卫等 : 余甘子对强致癌物质 一亚硝基化合物合成的阻断作用 (二 )
第 5期 : L 一脯氨酸 + 亚硝酸钠 十 抗坏血酸 ,
第 6期 : L一脯氨酸 + 亚硝酸钠 + 余甘子果汁 ` ,
按 1 一 6 期顺序分别处理后 , 单个置于干净的代谢笼中 , 自由饮水 , 收集 24 小时尿液子
预先加有 2 m l A S液的聚乙烯塑料瓶中 , 并用少量蒸馏水冲洗代谢笼及漏斗上的痕迹 尿 , 合
并于瓶中夕 定容至 30 m l 。 其中第 l 期所测定的 N P R O作为本底 。 l ~ 3 期相邻两期的处理间
隔为 2 4小时 , 4 ~ 6 期间隔 48 小时 。
( 二 ) 尿中 N P R O含量测定
取 15 毫升尿样 , 加入 4 0 n g N IP C ( 为内标 ) 及 2 毫升 A S液 , 用 30 毫升醋酸 乙醋分别萃
取三次 , 合并萃取液 , 加入无水硫酸钠干燥处理后用旋转蒸发仪蒸干溶液 ( 水浴 温 度 “ 一
70 ℃ ) 。 用重氮甲烷处理 5 分钟 , 再用氮气浓缩至。 。 1二 1左右 , 取 10 时在 G C一 T E A上测 定
N P R O甲醋的含量 , 以标准 N P R O作同样处理为定参照 。
色谱柱为 Z m x 3 m m不锈 钢 柱 , 充 填 物 为 10 % C ar ob w a 二 20 M 涂 布 的 60 ~ 80 目
C h r o m o s o r b W
。 以氢气为载气 , 流速每分 2 5m l , 柱温 1 9 0℃ , 汽化室温度 2 1 0℃ 。
抗坏血酸含量测定用 2 , 6一二氯靛酚滴定法〔 5〕 。
四 、 实验结果
大鼠经不同处理后 , 2 4小时尿中N P R O的排出量见表 1 。
裹 1 不同受试物大鼠 24 小时尿液 N P R O排出盆 ( 卜m ol )
冲女\ 实验期 } i } 乞 } 3 一 4 } 。 { e
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a .脯笼酸 、 亚硝 酸钠荆量均为 40 卜位 o1 , 。 . 5m l灌胃。 扰坏血酸及余甘子汁含杭坏血酸荆量 均为 36 件m ol , 1 . 2 m l祖 胃 。
b
. 阻断率 ( % ) = 〔实验 4 一 实验 5 或 6 〕 + 〔实脸 4 一 本房〕 :城 10 。%
. 砚对 t检脸 < 。 . 01
可见 , 在 2 、 3 期 , 分别加脯氨酸或亚硝酸钠 的处理 , N P R O的排出最与 1 期的本底值
“ 热 带 作 物 学 报 0 1卷
相近 , 差异不显著 ( P < 0 . 1 ) 。 但同时给予 L一脯氨酸和亚硝酸钠后 夕 2 4小时尿液中 N P R O
含量 ( 69 . 62 件二 o1 ) 却比本底值高 4 0 . 7 1倍 。 而在给予上述两种前体物的同时夕 分别加入抗
坏血酸和余甘子汁时 , 尿液中排出的N P R O则急剧下降 , 尤其是加入余甘子汁的 第 6 期 ,
N P R O的量仅为 4 。 2 4 砰二 ol , 与只给两种前体物的 N P R O排出量 ( 6 9 . 能 衅m ol ) 相比 , 差异
极显著 ( P < 。 . 0 1 ) , 亦即余甘子汁在动物体内对 N P R O的阻断率高达 9 7 . 27 % 。
五 、 讨 论
实验结果证明 , 用 L一脯氨酸和亚硝酸钠作前体物质 , 在大鼠体内能合成亚硝基脯氨酸
( N P R O )
。
抗坏血酸是一种已知的亚硝化阻断荆 。 A : c h e r等的研究表明 , 在空气存在下 完全 `阻断
胺的亚硝化反应的抗坏血酸摩尔数应比亚硝酸盐多一倍〔幻 。 本 实验所用抗坏血酸 与亚 硝酸
钠 的摩尔比为 0 . 9 , l , 其中亚硝酸钠为 40 卜m ol , 摄入 35 . 5卜m ol 的抗坏 血 酸 后 , N P R O的
排出量为 1 3 . 8 7 卜m ol , 显著低于只给两种前体物的排出量 ( P < o , 。 1 ) , 阻断率为 82 . 09 % ,
与O h s ih m a报告的当抗坏血酸与亚硝酸钠摩尔比为 1 时 , 阻断率为 81 % 〔 I〕 的 值较接近 。 这
说明用与亚硝酸钠相同摩尔数的抗坏 .血酸不能完全阻断大鼠体内的亚硝化 。
余甘子果汁富含抗坏血酸 , 还含有多酚类物炭及其他未知成份 。 为了解除抗坏血酸以外
的 其他成份的作用 , 将含36 卜。 o1 抗坏血酸的 1 . 2二 1余 一甘子果汁同两种前体物一起灌 胃给大
鼠 , 结果动物 24 小时尿排出的 N P R O仅为 4 。 2 。 林m ol , 与只给两种前休物的 N P R O 排出量相
比 , 差异极显著 ( P < 0 . 0 1 ) , 阻断率高达 97 . 27 % 。 此结果说明 , 作为一种天 然食品 , 余甘
子果汁能有效地阻断动物体内的 N P R O的合成 , 其阻断效果优于同量的抗坏血酸 , 两者有极
显著性差异 ( P < 0 . 0 1 ) 。 从而提示 , 余甘子果汁除抗坏血酸外 , 还有其他成份能阻断前体
物的体内亚硝化反应 。
. 匆 文 欲
〔 1 ) 宋 圈菊等 . 中华琳换 挑汁 的防庙作用 , 《 曾养学报 》 , 均 8` , 日 ( 3 )
〔 2 〕 M i r y主s h 5 5 . : T h e e t io l o g了 o f g a s t ir e e a n e e r , J N IC , 10 3 3 ,了 l ( 3 ) , 。 , 1
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J N
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a n e e r I n s t
, 1。了5 , 5 4 : 1 2 0 3
〔 7 〕 o h s h i见 a H , e L a l : M o n i t o r i n g o f e x e r e t e d N一 n it r o s a m i妞 0 a e id s a o a n e w m e th o d t o q 肪 n t呈t a t e
e n d o g o n o u s n it r o , a t i o n i 几 h u m a n s , I n : N i t r o s a m i n e s a n d H 让m a a C a n e e r ( B 住 n b u r了 R e p o r t l 盆 ) .
C o ld S p r i n ` H a亡b o r L a b o r a t o r了 , U S A , 2 0 5 2 , 2 0 7一 s 丈7
1 期 候开卫等 :余甘子对强致窟物质 一亚硝基偌合物合成的阻断作用 (二 ) 67
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T h i s s 住 g g e s t s t h a t t h e f r u i t j u i e e o f P h y l l a n t h 住 5 e m b l i e a L
. e o n t a i n s
n o t o n l了 a s e o r b i e a e i d , b u t a l s o o t h e r e o rn p o s i t i o n s t h a t e a n b l o e k t h e n i t r o s a t i o n
o f t h e p r e e u r s o r s i n t h e b o d了 o f a n i m a l s a s w e l l .
K e y w o rd s
: p五y l l a n t h往 s e扭 b l i e a L . , b l o e k i n g r a t e , n i t r O S O p r o l i n e , s t r o o g e a r e i n o g e 。