全 文 ：热带亚热带植物学报 2004，1 2(6)：495—500
Journa／of Tropical and Subtropical Botany
超氧阴离子自由基对绿豆黄化幼苗ACC合酶的影响
柯德森 ，孙谷畴
(中国科学院华南植物园，广东广州510650)
摘要：以0．5、5和 50 mmol／L的连二亚硫酸钠(Na2s：()4)为外源超氧阴离子自由基(02i)源，处理20 min能明显提高绿
豆黄化幼苗ACC合酶 (ACC synthase，ACS，EC 4．4．1．14)的活性。超氧阴离子自由基的特异性清除剂超氧化物歧化酶
(superoxide dismutase，SOD)和 1,4一二氮杂二环(2，2，2)辛烷[1，4一diazabicyclo(2，2，2)Octane，DABCO]能抑制Na2S2()4的这
种作用，显示Na2S20 产生的 O：引起了 ACC合酶活性的升高。但 Na：S2() 处理较长时间，ACC合酶活性开始下降，处
理60 rain的ACC合酶活性明显低于对照，SOD和DABCO的加入有助于抑制ACC合酶活性的降低，表明超氧阴离
子 自由基对 ACC合酶活性具有促进和抑制作用并存的“双重性”影响。研究表明，外源 Na2S20 处理20 min能明显降
低以S一腺苷蛋氨酸(S—adenosylmethionine，SAM)为底物的 ACC合酶的Km值，处理 60 min反而提高了 ACC合酶的
Km值，表明O：；是通过改变 ACC合酶对底物 SAM 的亲和力，从而影响其活性的。
关键词：超氧阴离子 自由基；ACC合酶；连二亚硫酸钠
中图分类号：Q945 文献标识码：A 文章编号：1005-3395(2004)06-0495-06
The Efect of Superoxide Radical on the ACC Synthase from
Etiolated Mungbean Seedlings
KE De．s en‘． SUN Gu．chou
(South China Botanical Garden,the Chinese Academy of Sciences，Guangzhou 510650，China)
Abstract：The activity of ACC synthase(ACS，EC 4．4．1．14) from etiolated mungbean seedlings was elevated
obviously in treatment for 20 min with O．5，5 or 50 mmol／L of sodium dithionite(Na2S2O4)which is generaly used
as an exogenous generator of superoxide radical(02-)．Superoxide dismutase(SOD)or l，4-diazabicycol(2,2，2)
octane(DABCO)，a special scavenger of O2 ，could reduce the increase of ACC synthase activity induced by
Na2S204，showing the promotion role of superoxide radical on the activity of ACC synthase．However，the activity
of ACC synthase decreased as the treatm ent time extended．The activity of ACC synthase was even lower than the
control when treated for 60 min with 5 or 50 mmol／L of Na2S2O4．The decline of activity of ACC synthase could be
inhibited by adding SOD or DABCO．These results showed the dual—efect of superoxide radical on the activity of
ACC synthase．The further studies indicated that Krn of ACC synthase，which substrate is S-adenosylmethionine
(SAM)，decreased in treatment for 20 min with exogenous generator of superoxide radica1．However，in the treat—
ment for 60 min with exogenous O2 ，the value of Km of ACC synthase increased obviously．The results showed
that superoxide radical could change the properties of the ACC synthase，i．e．，decreased its Km value，increased
the affinity to SAM，and thus，to alter the activity of ACC synthase．This might be the mechanism of the dual efect
of superoxide radical on the activity of ACC synthase．
Key words：Superoxide radical；ACC synthase；Sodium dithionite
收稿 日期 ：2003—12-02 接 受 日期 ：2004—04—05
通讯作者Coresponding author
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496 热 带 亚 热 带 植 物 学 报 第 l2卷
乙烯是一种重要的植物生长调节物质，植物体
内乙烯水平与种子萌发、植株生长发育、开花结果
及成熟衰老等过程密切相关 】。ACC合酶(ACC
synthase，ACS，EC 4．4．1．14)是植物体内乙烯生物
合成过程的关键调控酶，催化从 s一腺苷蛋氨酸
(S-adenosylmethionine，SAM)生成 1一氨基环丙烷一1一
羧酸(1一aminocyclopropane一1一carboxylate，ACC)的反
应过程，是乙烯生物合成过程的主要限速步骤。因
此，调节 ACC合酶的活性是乙烯生物合成过程调
控的主要方式【3～。目前最常用的乙烯生物合成调节
剂，如氨基羟乙酸 (aminooxyacetic acid，AOA)和氨
氧乙烯基苷氨酸 (aminoethoxyvinylglycine，AV6)，
主要是ACC合酶的竞争性抑制剂，不能满足生产
实践上灵活调控乙烯产生的要求罔。Baker等旧
于l978年发现，l mmol／L的超氧阴离子 自由基
(superoxide radical，O2 )特异性抑制剂n一没食子酸
丙酯(n-propyl galate)和苯甲酸钠(sodium benzoate)
能明显抑制植物组织中乙烯的产生，从而提出02-
可能参与植物乙烯生物合成过程的推论。其后的研
究表明，一定浓度的6；-处理能显著提高植物乙烯
的产生水平，显示 O：=作为乙烯生物合成促进剂的
可能性p～。我们最近的研究表明 “ ，超氧阴离子自
由基处理一定时间对绿豆黄化幼苗的乙烯产生有
明显的促进作用，但高浓度的Oz处理较长时间则
表现出抑制作用，显示Oz 对绿豆黄化幼苗的乙烯
产生具有明显的“双重性”影响。这个结果表明，超
氧阴离子自由基作为一种新的乙烯调控因素具有
更加灵活高效的优点，但其机制却不是很清楚。目
前对 O 的研究主要集中在其破坏性上[1 ，对 02-
在生物体正常生理代谢过程中的调控作用研究甚
少。本文通过研究超氧阴离子自由基对绿豆黄化幼
苗ACC合酶的活性及酶学特性的影响，试图阐明
超氧阴离子自由基在植物乙烯生物合成过程具有
双重性作用的机制。
I材料和方法
1．1植物材料
市售绿豆(Phaseolus radiatus L．)新鲜种子，用蒸
馏水洗涤干净后浸泡 24 h，其间用气泵不断充气。
然后将吸涨的种子用无菌水泡洗 3遍，再置于湿润
的滤纸上，于25~(2下在黑暗中萌发。每天用蒸馏水
洗涤幼苗一次。萌发 7 d后选取生长基本一致的幼
苗为实验材料。
1．2 ACC合酶提取
参照 Tsai等 的方法提取绿豆 ACC合酶 。
1 000 g绿豆黄化幼苗，加入 1 000 ml提取液，于
0 oC迅速研磨，提取液含 1．2 mol／L磷酸钾(pH 8．0)
缓冲液，4 mmol／L的二硫苏糖醇(dithioerythritol，
DTE)，0．5 la mol／L 的磷 酸 吡 哆 醛 (pyridoxal一5’一
phosphate，PLP)。匀浆液迅速用三层纱布过滤，滤液
于 15 000xg离心20 min，弃沉淀，收集上清液，将
收集到的清液用Sephadex G 25脱盐，得到ACC合
酶的粗提液。慢慢加入硫酸铵使达到 40％的饱和
度，充分搅拌均匀，0 oC静置过夜，4℃ 5 000xg离心
30 min，得清液。继续加入(NIL)zSO 使其达到 75％
的饱和度，静置过夜，离心得沉淀。沉淀溶于 20 ml
缓冲液中(含 20 mmol／L pH 8．0磷酸钾缓冲液，
0．4 mmol／L DTE，0．5 la mol／L的PLP)，用同样的缓
冲液透析 3 d，过滤得清液。将清液用 20％(w／w)的
聚 乙二醇 (PEG6000)透析浓缩，然 后用 DEAE
Sephadex A 25层析，层析柱 (5 cm x30 cm)用缓冲
液(20 mmol／LpH 8．0的磷酸钾缓冲液，含0．4 mmol／L
DTF_,0．5 la mol／L的 PLP)平衡 ，先用上述缓冲液
200 ml以4 ml min 的流速洗脱，然后用含有0—
200 mmol／L浓度梯度的KC1的上述缓冲液洗脱，流
速2 ml min～，收集洗脱液 150份，每份3 ml，测量活
性并合并有活性的洗脱液，用 20％的聚乙二醇
(w／w)透析浓缩至30 ml，然后用缓冲液透析2 d，离
心去沉淀得部份纯化的 ACC合酶(比活性为
400．7 U mg- Protein)用于以下实验。
1．3外源超氧阴离子自由基处理
每份取 0．1 ml(约相当于 25 g蛋白)ACC合
酶 ，分别加入终浓度为 0．5 mmol／L，5 mmol／L和
50 mmol／L的连二亚硫酸钠(NazSz04)作为外源超氧
阴离子自由基源，30~C培养20、40和 60 min，然后
测量 ACC合酶活性及酶促反应动力学特性的变化。
1．4 ACC合酶活性测定
参照Tsai等[14】的方法。8 ml的带胶塞的标定
了体积的试管 ，加入 1 rnl反应缓冲液 ，其中含
100 mmol／L pH 8．0磷 酸 缓 冲 液 ，终 浓 度 为
400 la mol／L的 SAM，0．5 la mol／L的 PLP，再加入
0．1 ml的酶提取液，然后于 30~C培养 10 min，加入
500 la l预冷的20 mmol／L的HgCI2以终止反应。测
定反应前后 ACC含量的变化，以 1 h催化形成
1 nmol／L ACC的酶量定义为1个酶活性单位。
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第 6期 柯德森等：超氧阴离子自由基对绿豆黄化幼苗ACC合酶的影响 497
1-5 ACC含量测定
参照董建国和李振国n习的方法。将上述加入了
HgCIz终止反应的试管放入冰浴中预冷 3 min，用胶
塞密封管 口，注入 100 la l的预冷的 NaOCl—NaOH
混合液 (5％NaOCI：饱和 NaOH，2：l，ⅥV)，立即在
旋涡混合器上振动 5 S，反应 3 rain，抽取反应后的
气样 l ml测量乙烯的产生，以乙烯的生成量计算
ACC的含量。 ．
1．6 ACC合酶 相对底 物 SAM 的米 氏 常数 Km
(SAM)的计算u唰
按照以上测量 ACC合酶活性的方法，加入 0，
l0，20，30，50，100，200，400 mol／L不同浓度的
SAM，测定不同底物浓度下的反应速度 值，以 l
对 1／[s]S作 图，根据双倒数法 ，通过公式 1／v=
(Km／Vmax)l(1l[S])+l／Vmax，求得 30~(3下 ACC合酶
对 SAM底物的 Km值。
1．7数据处理和统计
每个实验重复5次，取其平均值。利用Microsoft
Excel 2002的 Stdevp函数计算基于所得到 5个数
据的标准误差 (SE)。
2结果和讨论
2．1超氧阴离子自由基对 ACC合酶活性的影响
从图 lA可见，0．5、5和 50 mmol／L的 Na：S2O4
处理20 min能明显提高绿豆黄化幼苗ACC合酶的
活性 。0．5和 5 mmol／L的 Na2S204处理 40 min的
ACC合酶活性继续保持较高水平，而此时50 mmol／L
NazS：04 处理的已开始下降。至 60 min时，三种处理
的ACC合酶活性都不同程度地下降，其中 5mmol／L
和 50 mmol／L Na2S2O 处理的 ACC合酶活性甚至低
于对照。由于 Na2SzO 是超氧阴离子 自由基的外源
产生剂，所以它对 ACC合酶活性的影响可能是通
20 40
时间 Time(rain)
60
图 l超氧阴离子自由基对绿豆黄化幼苗 ACC合酶活性的影响
Fig．1 The efect ofsuperoxide radical on the activity ofACC synthase from etiolated mungbean seedlings
A：Na2S2O4；B：Na2S2O4+SOD or+DABCO
0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 ∞ ∞ ∞ 们 ∞ ∞ ∞ ∞ ∞ 们 ∞ ∞
≥I^号矗 善 ll^s uuq
p 2 曲尽 一掣姆髓 uuq
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498 热带 亚 热 带植 物 学 报 第 l2卷
过其产生的 02 而起作用 的。超氧化物歧化酶
(superoxide dismutase，SOD)和 1，4一二 氮 杂 二环
(2，2，2)辛烷[1，4一diazabicyclo(2，2，2)Octane，DABCO]
是O 的特异性清除剂 。在上述处理中分别加入
30 U ml 的 S0D或 10 mmol／L的 DABCO可以明
显抵消Na2S：04对 ACC合酶活性的影响，几乎完全
抑制了Na2S：04处理20 min对ACC合酶活性的促
进作用，对处理 40 min的 ACC合酶活性的上升也
有明显的抑制作用。另一方面，当外源 Na2S20 处理
60min时，加入 SOD和 DABCO处理的ACC合酶
活性与不加 SOD和 DABCO的处理相比，不仅没
有下降，反而有明显的升高 (图 1B)。这就进一步表
明Na2S204是通过其产生的02 来影响 ACC合酶活
性的。由此可见，一定浓度的超氧阴离子 自由基可
能有助于提高绿豆黄化幼苗 ACC合酶活性，但当
超氧阴离子 自由基浓度高于一定程度或处理时间
较长时，可能造成 ACC合酶蛋白结构的破坏，从而
引起 ACC合酶活性的下降，显示了02：对 ACC合
酶活性的“双重性”影响。
2．2超氧阴离子自由基对 ACC合酶酶促反应动力
学特性的影响
在30~(2pH 8．0下，测量提取的ACC合酶催化
反应的速率与底物 SAM 浓度的关系。结果显示，该
酶催化反应速率 )随底物浓度[sAM ]的变化规律符
合典型的米氏动力学方程 (图2A)。通过双倒数法[1司
作图(图2B)，利用 Microsoft Excel的自动统计功能
得到 l 对 I／[sAM ]的线性回归方程，通过计算可
得到正常生长条件下绿豆黄化幼苗ACC合酶的米
氏常数 Km值为 52．32 umol／L。从图 2还可以看
到，0．5、5和 50 mmol／L的Na2S204处理 20 min的绿
豆黄化幼苗ACC合酶催化的酶促反应仍符合典型
的米氏动力学方程，但其 Km值却有明显的下降。
根据米氏酶促反应动力学理论 [1叼，Km值的大小近
似地与酶促反应中酶对底物的亲和力成反比。由此
可见，一定浓度的超氧阴离子自由基处理较短时间
有助于提高 ACC合酶对底物 SAM 的亲和力，这可
能是超氧 阴离子 自由基能够诱 导 ACC合酶活
性上升的原因。分别加入 30 U ml。的 SOD或
10 mmol／L的 DABCO，处理 20 rain后绿豆 黄化
幼苗 ACC合 酶的 Km 值 明显高于不加 SOD或
DABCO处理的(表 1)，结果进一步支持上述结论。
图 3显 示 ，O．5、5和 50 mmol／L的 Na2S204处 理
60 min的ACC合酶催化的酶促反应仍符合典型的
米氏动力学方程，而其 Km值却比对照有明显的上
升。说明Na2S：04处理较长时间可能引起 ACC合酶
的损伤，使 ACC合酶对其底物 SAM 的亲和力下
降，从而引起 ACC合酶活性的下降。从表 l可见，
0．018
0．016
0．014
0．012
O．Ol
0．008
0．006
0．004
0．002
0
50 100 150 200 250 300 350 400 450 0．03 0．06 0．09 0．12
SAM(pmoI／L) l／[SAM】
图2外源Na2Sz04处理20 min的绿豆幼苗ACC合酶催化反应速度与底物浓度的关系
Fig．2 The relationship between reaction rate and substrate concentration for ACS from the etiolated mungbean seedlings
treated、vitll exogenous Na2S204 for 20 min
A：ACS催化反应速度与底物浓度的关系Reaction rate in relation to SAM concentration；
B：ACS对SAM的米氏常数计算 The estimateofKmforSAM
◇ Control：Km=52．32 u mol／L × 0．5 InnloI／L Na2S204：Km-40．24 p mol／L
■ 5 mmol／L Na2S204"Km=36．08 p mol／L ▲ 50 mmol／L Na2S204：Kin=27。78 u mol／L
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第6期 柯德森等：超氧阴离子自由基对绿豆黄化幼苗ACC合酶的影响 499
SAId(~mol／l_) 1／ISAM】
图 3外源处理 60 min的绿豆幼苗 ACC合酶催化反应速度与底物浓度的关系
Fig．3 The relationship between reaction rate and substrate concentration for ACS from the etiolated mungbean seedlings
treatedwith exogenousNa2S204for 60rain
A：ACS催化反应速度与底物浓度的关系 Reaction rate in relation to SAM concentration；
B：ACS对 SAM 的米氏常数计算 The estimate ofKinforSAM
◇ Control：Kin=54．82 BmoI／L ×0．5 nl~OI／L Na2S204：Km=60．41 u moI／L
■ 5 mmol／L Na2S2O4：Km=66．76 u mol／L ▲ 50 mmol／L Na2S2O4：Km=74．65 u mol／L
表 1 SoD和 DABCO对绿豆黄化幼苗ACC合酶Km值的影响
Table 1．nleefectofSODandDABCOonKm valueforACC synthase
from etiolated mungbean seedlings
处理
Treatments
Km(1amol／L)
20min 60min
30 U ml。的 SOD或 10 mmol／L的 DABCO的加入
使外源Na2S20 处理 60 rain的ACC合酶的Km值
上升幅度减小，表明外源O： 特异性清除剂有助于
保护 ACC合酶活性，保持其对底物的亲和力，结果
进一步证明了是外源 Na2S20 产生的 Oz 引起了处
理后期 ACC合酶Km值的上升。
柯德森等的研究表明[1”，外源 IAA处理绿豆黄
化幼苗可诱导幼苗植株内 ACC合酶活性的上升，
并且证明IAA是通过诱导产生超氧阴离子 自由基
而起作用的。但是，由于在植物活体内存在着各种
代谢过程，因此该研究结果可能有二种原因，UpOz
是直接作用于 ACC合酶，从而诱导酶活性的提高，
或 Oz：作为一种信号启动植物体内的其他代谢过
程，从而间接引起 ACC合酶活性的升高。本项研究
利用外源超氧阴离子产生及清除剂直接处理离体
的绿豆黄化幼苗 ACC合酶，由于在离体状态下不
存在感受0z 信号诱导其他代谢过程的可能，因此
本研究的结果证明了超氧阴离子 自由基可直接作
用于 ACC合酶，从而诱导其活性的变化，这是超氧
阴离子自由基参与乙烯生物合成机制研究的一项
非常有意义的发现。上述关于 Oz 对 ACC合酶酶
促反应动力学特性影响的研究结果表明，超氧阴离
子自由基处理可直接引起 ACC合酶酶学性质的变
化，改变其 Km值，诱导酶对其底物 SAM 亲和力的
变化，这可能是 0： 对 ACC合酶活性具有 “双重
性”影响的主要机制之一。
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