全 文 ：的 ＲOS参与糖尿病肾病的氧化损伤过程［3］。线粒体不仅是体内
ＲOS的主要来源之一，还是 ＲOS 效应的主要靶点。ＲOS 可损伤
线粒体的酶类、脂类和核酸，形成氧化应激，引发更多的 ＲOS 生
成，形成氧化损伤的恶性循环［8］。同时 ＲOS 还可降低线粒体
DNA(mtDNA)的拷贝数，引起线粒体 ATP 合成减少、线粒体膜电
位下降等变化［7］。本实验结果显示，高糖环境下肾小管细胞的
ＲOS形成显著增加，同时出现线粒体膜电位和 mtDNA 含量降低，
而六味地黄丸含药血清干预后可时间依赖性的降低 ＲOS的产生
并显著改善线粒体功能。
细胞凋亡在肾小管间质纤维化的发生发展中起着关键作用，
其中死亡受体介导的外源性途径和线粒体介导的内源性途径是
触发凋亡的主要途径。在线粒体途径中，高糖可通过氧化应激损
伤线粒体功能，形成线粒体跨膜电位下降，细胞色素 C释放增加，
Caspase酶活化，并启动 Caspase 级联反应，引起细胞凋亡［2，3］。
本实验结果表明，肾小管上皮细胞在高糖环境下 24h，即可观察
到明显的细胞凋亡和线粒体膜电位的降低，进一步证实线粒体功
能损伤在高糖诱导 HK2 细胞凋亡中发挥重要作用。而六味地黄
丸含药血清干预，可抑制高糖诱导的线粒体膜电位和 mtDNA 含
量降低，恢复线粒体功能，从而减少细胞凋亡。Caspase家族属于
半胱 －天冬氨酸蛋白酶家族，可通过链式激活、循环放大、异源寡
聚化三种方式参与凋亡的形成。其中，活化的 Caspase － 3 和
Caspase － 9 是关键的调控分子，可通过促进凋亡信号传导，以及
特异地切割死亡底物多聚 ADP 核糖多聚酶，引发细胞凋亡的特
征性改变［7］。本实验中，高糖环境中的 HK2 细胞在 24h 后可观
察到明显的 Caspase － 3 和 Caspase － 9 活化，提示 Caspase － 3 和
Caspase － 9 参与了高糖诱导的 HK2 细胞凋亡过程，而六味地黄
丸含药血清可通过抑制 Caspase活化降低凋亡。
综上所述，六味地黄丸可能通过调控肾小管上皮细胞线粒体
ＲOS生成、改善线粒体膜电位和 mtDNA 拷贝数、抑制 Caspase 蛋
白的级联激活反应，降低高糖环境下的氧化损伤和细胞凋亡。从
蛋白和基因水平证实了六味地黄丸具有抑制高糖引起的肾小管
上皮细胞线粒体氧化损伤和凋亡的作用，为进一步了解六味地黄
丸在糖尿病肾病防治中的靶向作用提供了实验证据。
参考文献:
［1］ Ｒeidy K，Kang HM，Hostetter T，et al． Molecular mechanisms of diabetic
kidney disease［J］． J Clin Invest，2014，124(6):2333．
［2］ Habib SL． Alterations in tubular epithelial cells in diabetic nephropathy
［J］． J Nephrol，2013，26(5) :865．
［3］ Habib SL． Diabetes and renal tubular cell apoptosis［J］． World J Dia-
betes，2013，4(2) :27．
［4］ 谢 奇．六味地黄丸在 2 型糖尿病治疗中的作用与研究［J］．中医
临床研究，2013，5(l):116．
［5］ 陈 丽，周忠志，何泽云，等．六味地黄丸对慢性肾脏病研究的新进
展［J］．湖南中医药大学学报，2013，33(8):104．
［6］ 刘 卿，周于禄，裴 奇，等．六味地黄丸对糖尿病肾病大鼠肾脏保
护作用的研究［J］．湖南中医药大学学报，2007，27(6):40．
［7］ Higgins GC，Coughlan MT． Mitochondrial dysfunction and mitophagy:
the beginning and end to diabetic nephropathy? ［J］． Br J Pharmacol，
2014，171(8) :1917．
［8］ Munusamy S，MacMillan － Crow LA． Mitochondrial superoxide plays a
crucial role in the development of mitochondrial dysfunction during high
glucose exposure in rat renal proximal tubular cells［J］． Free Ｒadic Bi-
ol Med，2009，46(8) :1149．
收稿日期:2014-10-27; 修订日期:2015-04-08
基金项目:国家自然科学基金(No． 81260512);云南省大理学院应用开发研究基(No． Kyyy201102)
作者简介:汪春平(1988-)，女(汉族)，湖北红安人，大理学院药学与化学学院在读硕士研究生，主要从事紫地榆防龋机制研究工作．
* 通讯作者简介:蓝 海(1964-)，女(白族)，云南大理人，大理学院药学与化学学院教授，硕士研究生导师，学士学位，主要从事天然药物防龋研究工
作．
紫地榆正丁醇萃取部位对两种致龋菌生长、产酸的影响
汪春平1，吴利先2，王 涛2，忽胜和2，蓝 海1*
(1．大理学院药学与化学学院，云南 大理 671000; 2．大理学院基础医学院，云南 大理 671000)
摘要:目的 通过研究紫地榆正丁醇萃取部位对致龋菌生长、产酸的影响，探讨紫地榆能否有效调节口腔菌群生态平衡。
方法 采用试管二倍稀释法研究紫地榆正丁醇萃取部位对两种主要致龋菌生长和代谢的影响，先测定紫地榆正丁醇萃取
部位对变形链球菌、粘性放线菌最低抑菌浓度(MIC)及最低杀菌浓度(MBC);再测定低于 MIC 的 4 个浓度的紫地榆正丁
醇萃取部位对两种致龋菌产酸的影响。结果 紫地榆正丁醇萃取部位对两种致龋菌的生长、产酸均有一定的抑制作用。
结论 紫地榆正丁醇萃取部位可影响致龋菌生长代谢，可能是一种天然防龋药物，值得进一步深入研究。
关键词:紫地榆; 致龋菌; 生长; 产酸
DOI标识:doi:10． 3969 / j． issn． 1008-0805． 2015． 07． 012
中图分类号:Ｒ285． 5 文献标识码:A 文章编号:1008-0805(2015)07-1569-03
Effect of n － butanol extraction part of Geranium strictipes on growth and acid production
of two kinds of caries oral bacteria
WANG Chun-ping1，WU Li-xian2，WANG Tao2，HU Sheng-he2，LAN Hai1*
(1． College of Pharmaceutical and Chemical，Dali University，Dali，Yunnan 671000，China;2． Dali University
of Basic Medical，Dali，Yunnan 671000，China)
Abstract:Objective To investigate the effect of n － butanol extraction part of Geranium strictipes on growth ，acid generation of
·9651·
LISHIZHEN MEDICINE AND MATEＲIA MEDICA ＲESEAＲCH 2015 VOL． 26 NO． 7 时珍国医国药 2015 年第 26 卷第 7 期
Streptococcus mutans，Actinomyces viscosus and to find out whether a preparation of Geranium strictipes can be of use for screening
and as an effective agent to mediate the balance of oral microflora． Methods Streptococcus mutans，Actinomyces viscosus were cho-
sen as the experimental bacteria． The effects of n － butanol extraction part of Geranium strictipes on the growth and acid generation
of the bacteria were assessed． The minimal inhibitory concentration(MIC)and acid generation of the test strains were determined
by tube double dilution method． Ｒesults It found that n － butanol extraction part of Geranium strictipes can inhibit the growth and
acid generation of these bacteria effectively． Conclusion N － butanol extraction part of Geranium strictipes may be an effective an-
ti － caries agent，and further researches will be necessary to define its usefulness in this aspect．
Key words:Geranium strictipes; Caries bacteria; Growth ; Production of acid
龋病严重危害人类的口腔和全身健康，变异链球菌、粘性放
线菌是口腔内两种主要的致龋菌。它们能发酵多种碳水化合物
产酸，使菌斑 pH下降，当局部 pH值降至临界 pH范围 5． 5 以下，
牙齿硬组织发生脱矿，龋损形成。变异链球菌的致龋性主要取决
于其产酸性和耐酸性［1］。紫地榆(赤地榆)Geranium strictipes 是
牻牛儿苗科老鹳草属植物 Geranium strictipes Ｒ． Knuth 的根，在云
南的少数民族地区，长期用作治疗厌食症，同时具有显著的止血
止痢作用［2］。紫地榆水提物对牙周致病厌氧菌具有较好的抑制
作用［3］，这提示着民族药紫地榆可能是一种防龋的天然植物药。
紫地榆中含有大量鞣质和酚酸类，但具体是哪种成分有防龋作用
未见报道。本实验选择紫地榆的正丁醇萃取部位，研究其对变形
链球菌和粘性放线菌生长、产酸的影响。
1 仪器与材料
1． 1 仪器 隔水式恒温培养箱(上海一恒科技有限公司)，SSY －
4 电热恒温水浴锅(北京泰克仪器有限公司) ，LC － 4012 低速离
心机(科大创新股份有限公司中佳分公司)，立式压力蒸气灭菌
锅(上海博讯实业有限公司医疗设备厂)，COOL SAFE95 － 15 冷
冻干燥机(Gene Company Limited)，中药粉碎机(天津市泰斯特仪
器有限公司)，药筛(80 目)，旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器
厂)，精密酸度计 PHS － 3C(上海精密仪器仪表有限公司)，超净
台(苏州市金净净化设备科技有限公司)，2． 5L 圆底立式厌氧培
养袋(青岛海博生物技术有限公司)，冰箱(科龙电器)，移液器
(Eppendorf)。
1． 2 主要试剂 TPY 液体培养基(广东环凯微生物有限公司)，
琼脂(广东环凯微生物有限公司)，葡萄糖，蔗糖，95%乙醇，氯
仿，乙酸乙酯，正丁醇，以上试剂均为分析纯。
1． 3 紫地榆正丁醇萃取部位的制备 紫地榆于 2014 年 5 月购买
于大理药材市场，经大理学院药学与化学学院杨月娥老师鉴定为
牻牛儿苗科老鹳草属植物的根。取紫地榆药材粉碎，过筛，以药
液比 1∶ 4 加入 95%乙醇，回流 2h，滤过，滤液蒸干，加水溶解，依
次用氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取，各部位萃取物蒸干，加水溶解
冷冻干燥得冻干粉。
取正丁醇萃取部位冻干粉，精密称定，加蒸馏水制成 32mg /
ml母液，0． 45mm滤器滤过消毒，4℃冰箱放置。
1． 4 实验菌株及菌液的制备 变形链球菌 Streptococcus
mutansATCC25175;粘性放线菌 Actinomyces viscosus ATCC27044，
购买于广东省微生物菌种保藏中心。
将复苏 48h的菌种接种于 TPY液体培养基中，80% N2、20%
CO2 和 37℃下厌氧培养 24h，涂片检查为纯培养后，分别挑取单
个菌落于 TPY液体培养基在相同条件下培养 18h 增菌，使用麦
氏比浊管调整菌悬液浓度至 0． 5 McFarland(108 cfu /ml)备用。
2 方法
2． 1 最低抑菌浓度(MIC)和最低杀菌浓度(MBC)的测定 将
“1． 3”中紫地榆正丁醇萃取母液用含 1%葡萄糖的 TPY 液体培
养基进行二倍稀释，使稀释后的浓度分别为 16． 00，8． 00，4． 00，
2． 00，1． 00，0． 50，0． 25 mg /ml。取不同浓度的紫地榆正丁醇萃
取液各 2 ml于试管中，每管分别加入 1． 3 所预备好的菌液 20μl，
此时菌液浓度为 1 × 106 cfu /ml。并设阴性对照(液体 TPY 加菌
液)及空白对照(与各浓度组处理相同，但不加菌液而加入 20μl
的生理盐水)，37℃厌氧培养 48 h后，观察结果，以肉眼观察无细
菌生长为其 MIC值［4］。
观察培养 48h后各管的液体是否澄清(与空白组相比较)，
用接种环取肉眼观察可能无细菌生长的各试管液体一环，分区划
线接种于含 1%葡萄糖的 TPY 固体培养基上，37℃厌氧培养 48
h，观察菌落数少于 5 ～ 6 个的最低浓度为最低杀菌浓度［5］
(MBC)。以上实验重复 3 次 。
2． 2 紫地榆正丁醇萃取部位对口腔致龋菌的产酸能力的影响
根据紫地榆正丁醇萃取部位对上述两种致龋菌的 MIC 测定结
果，选取 MIC值以下 4 个浓度梯度配制成含 1%葡萄糖的 TPY液
体培养基，调定初始 pH值为 7． 4，并按菌液与 TPY液体培养基比
例为 1∶ 10(V/V)比例分别接种“1． 4”所预备好的两种致龋菌，
在 37℃和 80%N2、20%CO2 条件下厌氧培养 48h，离心，用 pH 计
测定培养物上清液的 pH 值并计算 pH 的变化值△pH(初始 pH
值 －终末 pH值)。以不含药物的培养基中各菌的产酸量作为对
照。实验共分 6 组，即 4 个不同浓度的实验组、空白对照组与阳
性对照组(含 0． 05%洗必泰的 TPY 菌悬液培养基)，每组设 5 个
平行管［6，7］。
2． 3 统计学处理 紫地榆正丁醇萃取部位对变异链球菌、粘性放
线菌产酸影响的实验数据采用 SPSS 13． 0 统计软件进行统计分
析，选用单因素方差分析的 Dunnett 检验，在 α = 0． 05 的情况下
比较各实验组与对照组之间有无统计学差异。
3 结果
3． 1 最低抑菌浓度(MIC)和最低杀菌浓度(MBC)的测定 紫地
榆正丁醇萃取部位对变形链球菌的最低抑菌浓度(MIC)为4． 00
mg /ml，最低杀菌浓度(MBC)为 16． 00mg /ml;对粘性放线菌的最
低抑菌浓度(MIC)为 1． 00mg /ml，最低杀菌浓度(MBC)为8． 00
mg /ml。
3． 2 紫地榆正丁醇萃取部位对口腔致龋菌的产酸能力的影响
△pH值随紫地榆正丁醇萃取部位的浓度的增加而减小。结果见
表 1，图 1，图 2。
表 1 紫地榆对变链菌、粘性放线菌产酸的影响(珋x ± s)
组别
△pH
变形链球菌 粘性放线菌
空白对照 2． 554 ± 0． 0106 2． 536 ± 0． 030
洗必泰 0． 806 ± 0． 029 0． 820 ± 0． 016★
1 /2MIC 1． 212 ± 0． 015＊★ 2． 458 ± 0． 114★
1 /4MIC 1． 712 ± 0． 058＊★ 2． 316 ± 0． 137＊★
1 /81MIC 1． 796 ± 0． 01＊★ 2． 358 ± 0． 126＊★
1 /16MIC 2． 318 ± 0． 115＊★ 2． 520 ± 0． 095★
实验组与对照比较，* P ＜ 0． 05;实验组与阳性对照洗必泰相比，★P
＜ 0． 05
·0751·
时珍国医国药 2015 年第 26 卷第 7 期 LISHIZHEN MEDICINE AND MATEＲIA MEDICA ＲESEAＲCH 2015 VOL． 26 NO． 7
图 1 紫地榆正丁醇萃取部位对变链菌产酸的影响
图 2 紫地榆正丁醇萃取部位对粘性放线菌产酸的影响
由表 1 和图 1、图 2 可以看出，变形链球菌产酸随紫地榆正
丁醇萃取部位浓度的增加而减少，运用统计学软件 SPSS17． 0 进
行分析，发现各浓度实验组与空白对照组相比，均具有抑制产酸
的作用且有显著性差异(P ＜ 0． 05)，浓度越高，抑制产酸作用越
强;与阳性对照洗必泰组相比，抑制产酸作用弱于洗必泰组 (P ＜
0． 05)。而该萃取部位对粘性放线菌的产酸能力没有随浓度递增
而呈规律性变化，仅 1 /4MIC 和 1 /8MIC 组与空白对照相比有一
定的抑制产酸作用 (P ＜ 0． 05);与阳性对照洗必泰组相比，抑制
产酸作用不及洗必泰 (P ＜ 0． 05)。紫地榆正丁醇萃取部位能抑
制两种致龋菌的产酸，但抑制作用低于洗必泰。
4 讨论
龋病是在以细菌为主的多种因素影响下，牙体硬组织发生慢
性进行性破坏的一种疾病，目前尚未研制出能有效治疗龋齿的药
物，因而控制龋病的关键在于预防。牙菌斑内的细菌可以分解食
物中的糖，在短时间内产生大量的有机酸，如乙酸、乳酸等，使牙
釉质中的无机盐发生溶解，导致龋病发生。变形链球菌是牙菌斑
中最主要的致龋菌，对龋病的发生、发展起着决定性的作用。
药物防龋的作用机制主要包括药物对口腔细菌和牙齿硬组
织的作用。对口腔细菌的作用是指药物抑制致龋菌生长，干扰其
代谢，抑制牙菌斑生物膜形成等作用;对牙齿硬组织的作用则体
现在药物抑制牙齿硬组织脱矿，并促进其再矿化［7，8］。对于紫地
榆在矿化方面的研究较多。戴啊师等［9］通过建立牙齿龋病模
型，利用扫描电镜观察紫地榆水提物对牙釉质龋再矿化的影响，
发现在龋病发生过程中紫地榆可能对龋病的进展具有抑制作用。
蓝海等［11］通过紫地榆水提物对再矿化及抗酸脱矿作用的体外研
究发现，紫地榆在抑制脱矿和促进再矿化方面效果明显。同时也
发现紫地榆中的鞣酸可抑制牙本质胶原的分解，阻碍牙本质龋的
进程［12］。关于紫地榆对口腔致龋菌的作用，仅有李龙星等［3］采
用体外抑菌实验，在厌氧条件下测定紫地榆水提物对两种主要致
龋菌的最低抑菌浓度(MIC)，发现紫地榆水提物对牙周致病厌氧
菌具有较好的抑制作用。
由实验结果可以看出，紫地榆正丁醇萃取部位对两种致龋菌
的生长和产酸都具有较强的抑制作用，且对变链菌产酸能力的影
响比对粘性放线菌强，但对两种致龋菌抑制产酸的作用均不如洗
必泰强。洗必泰又名双氯苯双胍己烷，长期使用洗必泰会有牙齿
变色、味觉障碍等副作用。由此，可以推测天然药物紫地榆的正
丁醇萃取部位能有效防止致龋菌在口腔中的生长及代谢，抑制致
龋菌的毒力因子，从而减少龋病的发生。然而，中药中含有错综
复杂的成分，对于其抗龋有效成分的确定长期以来一直是研究的
难点所在。不同的天然药物含有不同的抗龋活性成分，而其防龋
机制也各不相同。紫地榆正丁醇萃取部位中具有防龋作用的是
鞣质还是酚酸类物质还有待于进一步的分离和分析。
参考文献:
［1］ 樊明文，周学东． 牙体牙髓病学［M］． 北京:人民卫生出版社，
2012:19．
［2］ 姜 北，段宝忠． 白族惯用植物药［M］．北京:中国中医药出版社，
2014:392．
［3］ 李龙星，郭利军，蓝 海． 紫地榆对口腔致龋菌抑制作用的研究
［J］．安徽农业科学，2010，38(36):20600．
［4］ 黄晓晶，卢国英，刘建党，等．茶多酚与葡萄柚提取物联合应用对变
异链球菌生长、产酸的影响［J］． 第三军医大学学报，2011，33(1):
58．
［5］ 胡利杰，万呼春．甘草、匙羹藤提取物对变异链球菌作用的初步研
究［D］．四川大学华西口腔医学院硕士学位论文，2007．
［6］ 周学东，黄正蔚，李继遥，等．黄芩对三种主要致龋菌生长、产酸及
产胞外多糖的影响［J］．华西医大学报，2002，33(3):391．
［7］ 刘学军，姜新亚，张玲玲．葡萄籽原花青素对粘性放线菌影响的实
验研究［J］．实用口腔医学杂志，2011，27(6):761．
［8］ 张 勇，唐 方．厚朴酚药理作用的最新研究进展［J］．中国中药杂
志，2012，37(23):3526．
［9］ Duckworth ＲM． The science behind caries prevention［J］． Int Dent J，
1993，43(6) :529．
［10］ 戴啊师，蔡春木，蓝 海，等．天然药物隔山消促进釉质再矿化的研
究［J］．牙体牙髓牙周病学杂志，2007，17(11):635．
［11］ 蓝 海，罗常辉．紫地榆和五倍子水提物对牛切牙脱矿与再矿化的
动力学研究［J］．中成药，2011，33(4):692．
［12］ 蓝 海，杨 颖．紫地榆水提物对再矿化及抗酸脱矿作用的体外研
究［J］．中国现代医学杂志，2008，12(24):3639．
·1751·
LISHIZHEN MEDICINE AND MATEＲIA MEDICA ＲESEAＲCH 2015 VOL． 26 NO． 7 时珍国医国药 2015 年第 26 卷第 7 期