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紫地榆不同溶剂提取物对防龋活性部位的研究



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紫地榆不同溶剂提取物对防龋活性部位的研究
杨晓莉, 王芳芹, 张 俊, 蓝 海*
(大理学院药学与化学学院,云南 大理 671000)
收稿日期:2013-10-14
基金项目:国家自然科学基金 (81260512);云南省大理学院应用开发研究基金 (Kyyy201102)
作者简介:杨晓莉 (1977—) ,女,副教授,研究方向:药事管理。
* 通信作者:蓝 海,教授,硕士生导师,主要从事生物矿化研究。Tel:13769225179,E-mail:lanhai8696@ 126. com
摘要:目的 探讨紫地榆不同活性部位对牛切牙抗酸与再矿化的影响。方法 采用牛切牙浸泡于脱矿液的方法建立牙
齿脱矿釉质模型,分别用紫地榆乙醇浸膏不同溶剂提取物、去离子水和再矿化液处理人工脱矿釉质,然后用显微硬度
仪测试各组牙齿的釉质表面硬度。最后,选取能够使脱矿后的牙釉质表面硬度明显增大的活性部位,运用恒 pH 研究
法,通过脱矿与再矿化动力学实验比较各个活性部位抗酸、再矿化作用的强弱。结果 经再矿化液、紫地榆乙醇浸膏
不溶物和紫地榆乙醇浸膏水溶物处理后的牙釉质表面硬度明显增大,与脱矿后相比,差异具有统计学意义 (P <
0. 05),而其他溶剂提取物和去离子水处理后的牙釉质表面硬度均未增大,没有再矿化作用。用去离子水、紫地榆乙
醇浸膏水溶物和紫地榆乙醇浸膏不溶物分别做动力学实验,动力学曲线表明抗酸、再矿化作用最强的是紫地榆乙醇浸
膏不溶物。结论 紫地榆乙醇浸膏不溶物部位与水溶物部位对人工脱矿釉质均有再矿化作用,且不溶物部位作用强于
水溶物部位。
关键词:紫地榆;显微硬度;动力学;再矿化
中图分类号:R284. 2 文献标志码:A 文章编号:1001-1528(2014)10-2074-05
doi:10. 3969 / j. issn. 1001-1528. 2014. 10. 014
Anticaries activity of different Geranium strictipes R. Kunth extracts’
YANG Xiao-li, WANG Fang-qin, ZHANG Jun, LAN Hai*
(College of Pharmaceuticals and Chemicals,Dali University,Dali 671000,China)
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KEY WORDS:Geranium strictipes R. Kunth;microhardness;kinetics;remineralization
龋病是一种由口腔中多种因素复合作用所导致
的牙齿硬组织进行性病损,表现为无机质的脱矿和
有机质的分解,病变过程是一个脱矿与再矿化交替
进行的过程[1],是口腔主要的常见病,不仅影响
美观,还给人们的日常生活造成极大的困扰,
WHO将其列为重点防治的非传染性的三大疾病之
一。目前,龋病的治疗主要以药物治疗和充填术为
主,只能抑制龋病发展,而不能恢复牙齿原有形
态,所以寻找一种能够有效预防龋病且能促进再矿
化、安全、无毒、副作用少的药是亟待解决的问
题。有文献报道紫地榆的乙醇粗提物具有较好的抗
龋效果[2-3],本实验将紫地榆乙醇提取物的浸膏经
不同溶剂分步提取后的各个部位进行抗酸、再矿化
作用的筛选,为紫地榆防龋作用机制提供理论
依据。
1 材料
1. 1 药品 紫地榆,购于大理云济堂大药房,由
大理学院药学院马晓匡教授鉴定为紫地榆 Geranium
strictipes R. Kunth的根。
1. 2 主要试剂 乙醇、乙酸、氯化钾、乙醚、石
油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇、氯化钠、氯
化钙、磷酸二氢钠、磷酸二氢钾、氢氧化钾 (以
上均为分析纯)。人工唾液:KCl 0. 400 5 g,NaCl
0. 401 7 g,Na2S 0. 005 1 g,CO(NH2)2 1. 012 g,
CaCl2 0. 601 3 g,NaH2PO4 0. 600 5 g,用 1 000 mL
去离子水溶解,再用 1. 0 mol /L 的 KOH 调节
pH为6. 00。
1. 3 仪器 AE200 型电子天平 (波特乐-托利多仪
器有限公司);303-A-I 型电热恒温培养箱 (萧山
永发电器有限公司沪南实验仪器厂) ;PHS-25c 数
字酸度计 (上海鹏顺科学仪器有限公司) ;E-201-
C 型复合电极 (上海精密科学仪器有限公司) ;
RE-3000 旋转蒸发仪 (上海亚荣生化仪器厂) ;
SHZ-D (III)循环水式真空泵 (巩义市予华仪器
有限责任公司) ;80-2 台式低速离心机 (上海医疗
器械集团有限公司手术器械厂) ;ZQX-1 全自动金
相试样镶嵌机 (苏州欧卡精密光学仪器有限公
司);402MVD自动转塔数显显微维氏硬度计 (依
工测试测量仪器上海有限公司) ;YMP-2B 金相试
样磨抛机 (苏州欧卡精密光学仪器有限公司) ;雷
磁 ZDJ-4A自动电位滴定仪 (上海精科仪器有限公
司) ;501 型超级恒温水浴锅 (上海实验仪器厂有
限公司) ;BCD-193 容声牌电冰箱 (中国广东科龙
电器股份有限公司) ;GZX-9070 MBE 电热鼓风干
燥箱 (上海博讯实业有限公司医疗设备厂)。
2 方法
2. 1 标本的制备
2. 1. 1 显微硬度测试标本的制备 市场购买新鲜
拔出的牛切牙 200 颗,去除牙根、软组织,用去离
子水加压将冠髓冲洗干净,用 0. 9%的生理盐水超
声清洗 40 min,置于生理盐水 - 4 ℃冰箱中保存备
用。选 150 颗体视显微镜下无龋损、氟斑、裂痕牙
齿用蒸馏水洗净,晾干,浸泡于 100 mL 脱矿液
(2. 2 mmol /L CaCl2,2. 2 mmol /L NaH2PO4,0. 05
mmol /L CH3CH2COOH调 pH = 4. 00)中,在37 ℃
条件下放置 10 d,每 5 日更换一次脱矿液。脱矿后
的牙齿用 YMP-2B金相试样磨抛机将牙釉质打磨出
一光滑平面,然后用 ZXQ-1 全自动金相镶嵌机将
脱矿后的各标本包埋于镶嵌粉 (复合树脂)中,
暴露 2 cm × 4 cm 测试面,分别在 402MVD 型自动
转塔数显显微硬度仪上测各样本的基线硬度值。测
试条件为:测试面近牙髓处垂直负荷 200 g,施力
15 s,每个标本测 5 个点,每个点测 3 次,选取平
均值在 319 kg /mm2 左右的 40 颗牛切牙作为显微硬
度测试实验样本[4-5]。
2. 1. 2 动力学实验标本的制备 另选取大小一致
且完整的 30 颗牙齿,自然晾干。用 95%乙醇浸泡
15 min,无水乙醇浸泡 15 min (2 次) ,无水乙醚
浸泡 15 min,进行梯度脱水,在空气中过夜干燥。
随机将 30 颗牙齿分为 3 组,每组 10 颗,分别用质
量浓度为 0. 024 g /mL 紫地榆乙醇浸膏水溶物、
0. 024 g /mL紫地榆乙醇浸膏不溶物和去离子水各
100 mL 浸泡 48 h,在空气中过夜,自然晾干,最
后把牙齿粉碎过 20 目筛,作为动力学实验标本置
于冰箱中 - 20 ℃密封保存备用。
2. 2 供试液的制备 紫地榆 2 000 g,用 4 L 乙醇
浸泡 24 h,用旋转蒸发仪蒸发浓缩得乙醇浸膏
303. 2 g,称取浸膏 300 g,加去离子水 600 mL,超
声溶解 20 min,充分溶解后,置于低速离心机离心
5 min,转速 4 000 r /min,离心收集上清液,将紫
地榆的乙醇浸膏分为水溶液和水不溶物。水不溶物
用石油醚提取得到石油醚浸膏 6. 0 g,不溶物
134. 4 g,水溶液依次用三氯甲烷、乙酸乙酯、正
丁醇提取得到三氯甲烷浸膏 3. 2 g、乙酸乙酯浸膏
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27. 4 g、正丁醇浸膏 31. 1 g。水溶物称重 341. 2 g,
根据文献资料,药物最适质量浓度为 80 mg /mL[6],
因此将药材与所得乙醇浸膏进行换算得出再矿化药
液质量浓度为 0. 024 g /mL,分别将石油醚浸膏、
不溶物、三氯甲烷浸膏、乙酸乙酯浸膏、正丁醇浸
膏、水溶物按生药粉的最佳药液浓度配成质量浓度
为 0. 024 g /mL的溶液各 100 mL。
2. 3 再矿化后显微硬度测试 将 “2. 1. 1”项所
选 40 颗脱矿牙釉质标本随机分为 8 组,每组 5 颗。
经配对“t”检验分析,各牙齿间牙釉质表面硬度
差异无统计学意义 (P > 0. 05)。其中,A 组为石
油醚提取物组、B组为不溶物组、C 组为三氯甲烷
提取物组、D组为乙酸乙酯提取物组、E 组为正丁
醇提取物组、F组为水溶物组、G 组为去离子水阴
性对照组、H 组为再矿化液 (1. 5 mmol /L CaCl2,
0. 9 mmol /L NaH2PO4,0. 15 mol /L KCl,调 pH 至
7. 00)阳性对照组。首先,用棉签蘸取人工唾液
分别均匀涂抹于各组牙齿釉质表面 1 min,然后再
涂抹相应的药液 1 min,进行再矿化处理,最后置
于 (37 ± 0. 5)℃恒温箱中,每天 4 次,每隔 3 h 处
理一次。再矿化处理 10 d 后,用 402 MVD 型自动
转塔数显显微硬度仪按 “2. 1. 1”项的方法测定各
标本的硬度值,每个标本测定 5 个点,每个点测 3
次,取平均值。
2. 4 统计学分析 采用 PEMS 3. 1 软件,对各组
数据进行两两独立样本配对 t检验分析。
2. 5 动力学实验
2. 5. 1 抗酸脱矿 准确称取 “2. 1. 2”项紫地榆
乙醇浸膏不溶物组牙粉 10 mg 于 75 mL 的脱矿液
(0. 15 mol /L KCl,用 HAc 调 pH 至 4. 00)中,置
于 (37 ± 0. 1)℃ 恒温,用自动电位滴定仪向脱矿
液中滴加 99. 09 mmol /L 的 HAc,并用恒 pH 法控
制 pH 为 4. 00,每隔 10 min 定时记录 HAc 的加入
量,HAc的加入量与时间的关系曲线即为紫地榆乙
醇浸膏不溶物组牙粉的脱矿动力学曲线。同法绘制
紫地榆乙醇浸膏水溶物组和去离子水对照组牙粉的
脱矿动力学曲线,每组分别重复 3 次。试验结果经
过 t检验统计学处理,所测数据用 (珋v ± s)表示。
2. 5. 2 再矿化 准确称取 “2. 1. 2”项紫地榆乙
醇浸膏不溶物组 10 mg牙粉于 75 mL的再矿化溶液
(1. 60 mmol /L CaCl2、 0. 958 mmol /L KH2PO4、
0. 15 mol /L KCl,用 KOH 调 pH为 7. 40)中,置于
(37 ± 0. 1)℃ 恒温,并用恒 pH 法控制 pH 为
7. 40,用自动电位滴定仪向再矿液中滴加浓度
7. 673 8 mmol /L的 KOH,每 10 min定时记录 KOH
溶液的加入量,KOH 溶液的加入量和时间的关系
曲线即为紫地榆乙醇浸膏不溶物组牙粉的再矿化动
力学曲线。同法绘制紫地榆乙醇浸膏水溶物组和去
离子水对照组牙粉的再矿化动力学曲线,每组分别
重复 3 次。试验结果经过 t检验统计学处理,所测
数据用 (珋v ± s)表示。
3 结果与分析
3. 1 显微硬度测试结果分析 经紫地榆石油醚提
取物 (A组)、三氯甲烷提取物 (C 组)、乙酸乙
酯提取物 (D 组)、正丁醇提取物 (E 组)、去离
子水 (G组)处理后,5 组再矿化后牛切牙标本牙
釉质表层显微硬度平均值均无增大,而经紫地榆乙
醇浸膏不溶物组 (B 组)、紫地榆乙醇浸膏水溶物
组 (F组)、再矿化液对照组 (H 组)处理后,牛
切牙标本牙釉质表层显微硬度平均值均明显增大,
且与再矿化前相比差异具有统计学意义 (P <
0. 05)。再矿化后不溶物组、水溶物组两组间牙齿
硬度平均值比较 P < 0. 01,不溶物组、再矿化液对
照组和水溶物组、再矿化液对照组两组间牙齿硬度
平均值比较 P < 0. 05,均有显著差异,具有统计学
意义。这一结果表明紫地榆乙醇浸膏不溶物部位、
水溶物部位都有促进牙釉质再矿化的作用,且不溶
物部位 >水溶物部位,见表 1。
表 1 各组再矿化前后釉质表面显微硬度平均值 (x ± s,
kg /mm2)(n =3)
Tab. 1 Average value of microhardness of each group be-
fore and after remineralization of enamel surface
(x ± s,kg /mm2) (n =3)
组别 脱矿后 再矿化
石油醚提取物组 321. 6 ± 2. 8 311. 1 ± 5. 0
不溶物组 321. 9 ± 2. 1 353. 8 ± 8. 0**#
三氯甲烷提取物组 319. 9 ± 2. 8 312. 2 ± 7. 0
乙酸乙酯提取物组 319. 4 ± 2. 0 286. 7 ± 10. 3
正丁醇提取物组 320. 2 ± 3. 0 308. 4 ± 7. 8
水溶物组 320. 2 ± 2. 2 334. 1 ± 2. 4* #
去离子组 318. 4 ± 2. 0 301. 3 ± 7. 4
再矿化液对照组 320. 5 ± 2. 0 344. 8 ± 6. 3* #
注:再矿化后与脱矿后比较,* P < 0. 05,**P < 0. 01;再矿化后
与去离子水组比较,#P < 0. 01
3. 2 动力学实验结果
3. 2. 1 HAc体积消耗比较 由表 2 可知紫地榆乙
醇浸膏不溶物组和紫地榆乙醇浸膏水溶物组消耗
HAc均比去离子水组少,且差异具有显著的统计
学意义 (P < 0. 05)。水溶物组和不溶物组消耗
HAc也具有统计学差异 (P < 0. 05)。
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表 2 各组脱矿消耗 HAc的体积 (x ± s)
Tab. 2 Consumed HAc volume for each group’s deminer-
alization (x ± s)
组别 测定次数 时间 /min 消耗 HAc的体积 /mL
去离子水组 3 150 0. 940 ± 0. 005
水溶物组 3 150 0. 795 ± 0. 005*
不溶物组 3 150 0. 675 ± 0. 005*
注:与去离子水组进行比较,* P < 0. 05
3. 2. 2 脱矿动力学曲线的考察 绘制 3 组牙粉消
耗 HAc体积与时间的关系曲线,见图 1。去离子水
组、紫地榆乙醇浸膏水溶物组和不溶物组的线性回
归方程分别为: y = 0. 006 3x - 0. 002 1、 y =
0. 005 3x + 0. 004 5、y = 0. 004 5x + 0. 005 7,相关
系数 r均为 0. 999 9,表明,在 0 ~ 150 min范围内,
HAc的消耗体积与时间的线性关系良好。
实验结果显示,消耗 HAc 越少,脱矿速率越
慢,抗酸能力越强。脱矿速率由高到底依次是去离
子水组、紫地榆乙醇浸膏水溶物组和紫地榆乙醇浸
膏不溶物组,其中抗酸作用最强的是紫地榆乙醇浸
膏不溶物组。
图 1 脱矿动力学曲线
Fig. 1 Kinetic curves for demineralization
3. 2. 3 KOH体积消耗比较 由表 3 可知,紫地榆
乙醇浸膏不溶物组和水溶组消耗 KOH 均比去离子
水组多,且差异显著,具有统计学意义 (P <
0. 05)。水溶物组和不溶物组消耗 KOH 也具有统
计学差异 (P < 0. 05)。
表 3 各组再矿化消耗 KOH体积比较 (x ± s)
Tab. 3 Consumed KOH volume for each group’s reminer-
alization (x ± s)
组别 测定次数 时间 /min 消耗 KOH的体积 / mL
去离子水组 3 150 0. 570 ± 0. 005
水溶物组 3 150 0. 735 ± 0. 01*
不溶物组 3 150 0. 975 ± 0. 005*
注:与去离子水组比较,* P < 0. 05
3. 2. 4 再矿化动力学曲线考察 绘制 3 组牙粉消
耗 KOH体积与时间的关系曲线,见图 2。去离子
水组、紫地榆乙醇浸膏水溶物组和不溶物组的线性
回归方程分别为:y = 0. 003 8x + 0. 002 5、y =
0. 004 9x - 0. 002 1 和 y = 0. 006 5x + 0. 009 5。相关
系数 r均为 0. 999 9,表明,在 0 ~ 150 min范围内,
KOH的消耗体积与时间的线性关系良好。
实验结果显示,消耗的 KOH 体积越多,再矿
化速率越快,能力越强。再矿化速率由低到高依次
是去离子水组、紫地榆乙醇浸膏水溶物组和紫地榆
乙醇浸膏不溶物组,其中,再矿化能力最强的是紫
地榆乙醇浸膏不溶物组。
图 2 再矿化动力学曲线
Fig. 2 Kinetic curves for remineralization
4 讨论
牙釉质、牙本质和牙骨质无机盐部分主要由碳
酸盐及磷酸盐组成,当牙粉直接与酸 (pH = 4. 00)
接触时,牙粉中的碳酸盐和磷酸盐会溶出,牙齿发
生脱矿,脱矿过程中消耗了溶液中的 H +,可简单
描述为:Ca10(PO4)6(OH)2 + 8H →
+ 10Ca2 + +
6HPO2 -4 + 2H2O。再矿化是钙、磷和其他矿物离子
沉积诱导而增长于正常或部分脱矿的牙釉质内或釉
质表面的复杂的化学反应过程[7-8]。
前期实验证实紫地榆乙醇浸膏含鞣酸、鞣花
酸、没食子酸、五倍子酸甲酯 (Ⅳ)等鞣质类物质
[9-11],根据鞣质性质,浸膏的不溶物部位和水溶物
部位含有这类物质较多,特别是鞣花酸。一方面鞣
酸能和再矿化液中的 Ca2 +可结合为一种坚硬的物
质-鞣酸钙沉积在釉质表面;另一方面鞣酸、鞣花
酸、没食子酸、五倍子酸甲酯 (Ⅳ)等鞣质类物质
含多个羟基,能与脱矿后釉质中的蛋白 (酸脱矿
发生的釉质龋,蛋白不会丢失)和钙结合形成难
溶、稳定的环状复合物,使得脱矿釉质孔隙缩小;
再者鞣质类物质还可凝固酶蛋白并对胶原起稳定作
用[12],使釉质的表面硬度增大,再矿化能力增强。
以上三方面的作用阻碍了 H +进入牙齿进行酸蚀从
而具有抑制脱矿的作用[13-14]。紫地榆的抗酸脱矿
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和再矿化作用是某种鞣质的作用还是多种鞣质的协
同作用有待于进一步的分析研究。
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4 种不同型号大孔吸附树脂对重楼总皂苷分离纯化的影响
罗 云, 梁新丽, 赵国巍, 张 婧, 赵海平, 杨 明, 廖正根*
(江西中医药大学 现代中药制剂教育部重点实验室,江西 南昌 330004)
收稿日期:2013-10-12
基金项目:江西省科技计划资助项目 (20123BBG70200)
作者简介:罗 云 (1981—) ,男,博士,讲师,从事中药新制剂、新剂型、新工艺研究。Tel: (0791)87118658,E-mail:luoyunn@
163. com
* 通信作者:廖正根 (1967—) ,男,博士,教授,从事中药新剂型、新技术研究。Tel: (0791)87118658,E-mail:lyzlyg@ 163. com
摘要:目的 从 AB-8、D101、HPD-100 和 S-8 四种不同型号大孔吸附树脂中优选出分离纯化重楼总皂苷效果最佳的树
脂。方法 采用紫外可见分光光度法测定重楼总皂苷含有量;比较树脂的静态饱和吸附量和静态解吸率,并结合动态
吸附和解吸试验,确定最佳的吸附洗脱工艺。结果 AB-8 树脂对重楼总皂苷有较好的吸附分离性能,上样液质量浓
度为生药 0. 1 g /mL,上样量 18 mL /g树脂,20%乙醇洗脱杂质,60%乙醇洗脱总皂苷,用量均为 12 mL /g树脂。总皂
苷质量分数达到 53. 1%,收率 85. 6%。结论 弱极性的 AB-8 树脂适用于重楼总皂苷的分离纯化。
关键词:大孔吸附树脂;重楼;总皂苷
中图分类号:R284. 2 文献标志码:A 文章编号:1001-1528(2014)10-2078-06
doi:10. 3969 / j. issn. 1001-1528. 2014. 10. 015
Separation and purification of total saponins from Paris Polyphylla by four types
of macroporous resins
LUO Yun, LIANG Xin-li, ZHAO Guo-wei, ZHANG Jing, ZHAO Hai-ping, YANG Ming,
LIAO Zheng-gen*
(Key Laboratory of Modern Preparation of TCM,Ministry of Education,Jiangxi University of Traditional Chinese Medicine,Nanchang 330004,China)
8702
2014 年 10 月
第 36 卷 第 10 期
中 成 药
Chinese Traditional Patent Medicine
October 2014
Vol. 36 No. 10