全 文 ：　中国南方果树　2011;40(3):20 ～ 24
金 柑 流 胶 病 致 病 菌 的 分 离 与 鉴 定
刘 　娟1 , 2 ,胡军华1 ,姚廷山1 ,李鸿筠1 ,冉　春1 ,刘浩强1 ,徐丽兰1 , 2
(1 中国农业科学院柑桔研究所 ,重庆 , 400712;2西南大学园艺园林学院)
摘　要:从金柑流胶病株上分离纯化得到 5株真菌 ,编号为 JG1 、JG2、JG3、JG4 、JG5 , 观察其形态特
征 ,测定其致病性并进行形态学 、分子生物学鉴定。结果发现 , 5株真菌致病程度不同 , JG4 孢子悬
浮液处理发病最重 , JG1 处理发病最轻。 JG2、JG3 、JG4 属于链格孢 Alternaria sp., JG1 属于叶点
霉 Phy llosticta sp., JG5属于镰孢霉 Fusarium sp.。
关键词:金柑流胶病;致病菌;鉴定
中图分类号:S 436.661.1+3 　　文献标志码:A　　文章编号:1007-1431(2011)03-0020-05
Isolation and Identif ication of the Pathogen Causing Gummosis in
Kumquat
Liu J uan1 , HU Jun-hua1 , Y AO Ting-shan 1 , L I Hong-jun1 , RAN Chun1 , L IU
Hao-qiang 1 , Xu Li-lan 1
(1 Cit rus Research Inst itute , Chinese Academy of Agricu lt rual S ciences , National Engineering Research Center
for Cit rus , Chongqing , 400712 , China;2 College of Hort icu lture and Landscape Archi tecture , S outhw es t Uni-
versity , C hongqing)
Abstract:Five fungi , JG1 、JG2 、JG3、JG4 and JG5 we re isolated fr om Kumquat plants with gummo-
sis disease.Their mo rphological cha racters w ere observed and their pathogenicity w as detected.Re-
sults show ed these strains v aried in their pathogenicity , and the least pathogenic iso late wa s JG1
while the most pathogenic iso late was JG4.JG2 、JG3 and JG4 belong to A lte rna ria sp.;JG1 and
JG5 belong to Phy llo sticta sp.and Fusarium sp., r espectively acco rding to mo rpho lo gical and mo-
lecular analy sis.
Key words:Kumqua gummosis , pathogen , identifica tion
　收稿日期:2011-03-15;修回日期:2011-04-11
基金项目:教育部基本科研业务费(XDJK2010C084);公益性行业(农业)科研专项(200903004)资助。
作者简介:刘娟(1984-),女 ,硕士研究生。研究方向为微生物次生代谢。
通信作者:胡军华。电话:(023)68349005 , E-m ail:dhujh@yahoo.com.cn
　　金柑具有鲜食 、医疗保健和观赏等用途 , 其商品
经济价值高 ,有广阔发展前景[ 1] 。 金柑种植主要分
布在我国长江流域以南各省(区)。流胶病是柑桔的
一种重要真菌病害[2] , 影响植株生长发育 , 减少产
量 ,降低果实品质 , 严重影响柑桔生产和果农生产积
极性。流胶病在柠檬枝干上较常见 , 近年来在金柑
上也有发生。该病主要为害金柑主干 ,也为害侧枝 ,
病斑形状不规则 ,病部皮层变褐色 , 水浸状 , 常裂口
和流胶 ,叶片黄化脱落 , 树势逐渐衰退。严重时病部
扩展形成树干“环割” , 导致植株死亡[ 3] 。施用防治
柑桔流胶病的药剂 ,效果不是很好。 目前金柑流胶
病出现上升趋势 , 且其病原菌的报道很少。
本试验对金柑流胶病的致病菌进行了分离鉴
定 , 为研究其发生发展规律 ,提出有效防治和快速鉴
定方法提供参考。
1　材料与方法
1.1　试验材料
金柑流胶病样品采自中国农业科学院柑桔研究
所(重庆北碚)盆栽场。供试培养基为马铃薯葡萄糖
DOI :10.13938/j.issn.1007-1431.2011.03.003
　第 3 期 刘　娟 ,等 ,金柑流胶病致病菌的分离与鉴定
培养基(PDA),马铃薯(去皮)200 g , 琼脂 20 g , 葡萄
糖 20 g , 加水定容至 1 000 mL 。
1.2　症状观察 、致病菌分离和致病性测定
观察采集的金柑流胶病株 ,记录病害症状 。
致病菌的分离与纯化采用组织分离法[4] 。选取
带有典型流胶症状的的茎干 ,用清水冲洗干净 , 在病
健交界处剪取 2 mm×2 mm 大小的组织块 ,依次在
75%酒精消毒 10 秒 , 无菌水中连续漂洗 3 次;取出
用灭菌滤纸吸去多余水分后 ,放在 PDA 平板上 , 于
25 ℃恒温培养 5 天;挑取典型菌落边缘菌丝 , 移植
到新的 PDA 平板上培养以获得分离物的纯培养 ,纯
化菌种低温(4 ℃冷藏箱)保存备用。观察菌落形
态 ,显微镜下观察菌丝形态和孢子形状 , 记录观察结
果并拍照 ,按照《真菌分类学》鉴定种类[ 5] 。
致病性测定:选取健康金柑幼苗茎干 , 直径
0.5 cm左右 ,剪成 10 cm 长茎段 , 用肥皂水清洗 , 自
来水清洗干净 , 酒精棉擦拭茎段 , 在火焰上烧去酒
精 ,用无菌刀刻伤 , 待用[ 6] 。在长有待测真菌菌落的
平板上滴入无菌水 5m L , 用涂布棒轻轻涂抹 , 将菌
落上的分生孢子洗下 ,用毛笔蘸取孢子悬浮液 , 涂抹
到刀刻处 ,放入垫有湿润滤纸的培养皿内 , 放置在
25 ℃、12 小时光照/ 12 小时黑暗的恒温培养箱内。
以涂抹无菌水为对照 ,每处理重复 3次 , 观察记录发
病情况。若侵染发病且症状与自然条件的症状相
同 ,则在显症后适当时间取典型病斑再用组织分离
法分离;若获得病菌与待测菌相同 , 则获证其为金柑
流胶病的病原菌。
1.3　致病菌的分子生物学鉴定
将致病菌接种于 200 m L PDA 培养液中 , 28 ℃
下振荡培养 3 天 , 1 000 r/分钟离心 8 分钟 ,弃上清
液;CTAB 法提取总 DNA , 采用 rDNA ITS 通用引
物 ITS1(5′-′TCCGTAGGTGAACC TG CGG-3′)与
ITS4 (5′-TCCTCCGCTTAT TGATATGC-3′)进行
扩增[ 7] 。 PCR反应体系:共 25.0 μL , 其中 DNA 模
板 3.0 μL(<1 μg)、ITS1(5 pmo l/μL)1 μL、ITS4
(5 pmol/μL)1μL、10×Taq 缓冲液(无Mg2+)2.5μL、
Mg 2+(25 mmo l/ L)2 μL、dNTP (2.5 mmol/ L)2 μL、
Taq 聚合酶(2.5 U/μL)0.3 μL , ddH2 O 13.2 μL。
PCR扩增条件为:94 ℃ 5 分钟 、94 ℃ 40 秒 、56 ℃40
秒、72 ℃ 30 秒 , 30 个循环 , 72 ℃ 10分钟。
PCR产物用 1.0%琼脂糖电泳检测。由上海生
物工程技术有限公司测序 , 测得序列在 GenBank 中
比对分析。
2　结果与分析
2.1　症状
受害金柑一般在主干和侧枝处出现病斑 , 病斑
形状不规则 , 发病初期病斑处水浸状 ,中后期有大量
流胶发生。随时间变化 , 流胶颜色由透明变为褐色 ,
流胶点下的病组织呈黄褐色 , 湿润腐烂 , 散发酒糟
味。大量叶片黄化 、脱落 ,树势逐渐衰退。严重时病
部扩展形成树干“环割” , 导致植株死亡(见图 1)。
图 1　金柑流胶病症状
2.2　形态特征
从病株分离纯化获得 5 株真菌 , 菌株编号为
JG1 、JG2 、JG3 、JG4 和 JG5。在 PDA 上培养 5 天后 ,
JG1 菌落桔红色 , 边缘整齐 , 呈轮状生长;气生菌丝
桔红色 , 疏松状 , 菌丝无隔。 JG2 菌落灰白色 , 边缘
不整齐 , 呈无规则生长;气生菌丝白色 , 浓密状;分生
孢子梗单生或簇生 , 分生孢子倒棒状 , 淡褐色至褐
色 , 表面光滑微刺 ,具横隔膜 3～ 8 个 ,纵 、斜隔膜1 ～
4 个 ,分隔处略缢缩。 JG3 菌落灰黑色 , 边缘不整
齐 , 轮状生长;气生菌丝灰色 , 浓密状;分生孢子梗多
单生或少数根簇生 ,直或略弯 , 淡褐色;分生孢子倒
棍棒形 , 卵形或近椭圆形 ,成熟孢子具横隔膜或半横
隔膜 2 ～ 8 个 ,纵 、斜隔膜 1～ 6 个 ,分隔处略隘缩 , 特
别是孢身中部的隔膜明显较粗(厚), 黑褐色 ,缢缩更
为明显。 JG4 菌落灰白色 , 中间凹 , 边缘不整齐 , 呈
无规则生长;气生菌丝白色 , 浓密状;分生孢子梗多
单生或少数根簇生 ,直或略弯 , 淡褐色;分生孢子倒
棍棒形 , 卵形或近椭圆形 ,成熟孢子具横隔膜或半横
隔膜 2 ～ 6 个 , 纵 、斜隔膜 1 ～ 6 个。 JG5 菌落白色 ,
21
中 国 南 方 果 树　　　　　　　　　　　　　　　第 40 卷
边缘整齐;气生菌丝白色 , 浓密状;小型分生孢子卵
圆形或近椭圆形 , 单细胞(个别双胞), 无色 , 成熟孢
子具有横隔 1 ～ 2 个(见图 2 、图 3)。
2.3　致病性测定
在金柑茎干上接种 JG1 菌丝悬浮液和 JG2 、
JG3、JG4、JG5 孢子悬浮液 , 3 天后茎干出现水浸状 ,
5 天后茎干发生褐变 , 并散发酒糟气味。同时发现 5
种菌的致病程度不同 , JG4 孢子悬浮液处理的茎段
发病最严重 , 其他发病程度从重到轻依次为 JG2、
JG3 、JG5 、JG1(见图 4)。对茎干发病部位进行病原
物的第二次分离 , 5 天后发现病原菌形态特征与第
一次分离的病原菌一致。
22
　第 3 期 刘　娟 ,等 ,金柑流胶病致病菌的分离与鉴定
　　注:a.c.e.g.i 无菌水处理 , b.JG1孢子悬浮液处理 , d.JG2 孢子悬浮液处理 , f.JG3孢子悬浮液处理 , h.JG4孢子悬浮
液处理 , j.JG5孢子悬浮液处理。
图 4　分离金柑流胶病病株获得的 5 株真菌致病性测定情况
2.4　致病菌的分子生物学鉴定
采用 CTAB法提取第一次和第二次分离到的
致病菌的 DNA ,对 JG1、JGP2 、JG3、JG4 、JG5 的 rD-
NA ITS 基因进行扩增 , 均获得一条约 650 bp 片段。
对扩增产物进行测序 ,比对序列 , 发现前后两次分离
出致病菌 JG2、JG3、JG4 的 rDNA ITS 序列与 Al-
ternaria sp.有 100%的同源性 ,从而推断 JG2、JG3 、
JG4属于半知菌亚门 Deuteromycotina、丝孢纲 Hy-
phomycetales、丝孢目 Moniliale s、暗色菌科 Demati-
aceae、链格孢属 Alternaria sp.;而 JG1 的 rDNA
ITS 序列与叶点霉属 P hy llosticta 有 100%的同源
性 ,推断 JG1 属于半知菌亚门 , 腔孢纲 Coelomyce-
tes , 球壳孢目 Sphaeropsidales , 球壳孢科 Sphaer op-
sidaceae, 叶点霉属。 JG5 的 rDNA ITS 序列与镰孢
霉 Fusari um sp.的同源性 99%,推断 JG5属于半知
菌纲 , 腔孢纲 , 壳霉目 Sphaeropsidale s , 杯霉科 Dis-
cellaceae ,镰孢霉。
3　结论与讨论
流胶病是柑桔园一种普遍的真菌病害 , 主要发
生在柠檬树上 ,对柠檬流胶病的致病菌鉴定 , 国内外
已有部分报道。 1917 年 , Averna-Saccá R 等首先报
道了引起巴西柑桔流胶病的病原菌为寄生疫霉
P hy top hthora parasitica [ 8] 。 Timmer 等研究表明美
国佛罗里达州和田纳西州的柑桔流胶病菌只有烟草
疫霉 P.nicotianae[ 9-10] , 而 Matheron 和 Klo tz 等研
究表明在亚利桑那州和加利福尼亚州的柑桔流胶病
菌为 P.citrophthora 和 P .nicotianae 两种[ 11-12] 。
Adaskaveg 提到 , 在加利福尼亚州的图莱里县等的
柠檬园中发生的流胶病是由 H yphoderma sambuci
导致的[ 13] 。魏盛林 、秦煊南对我国四川安岳柠檬流
胶病致病菌进行了研究 , 发现主要有 3 种病原菌 , 分
别为疫霉 Phy tophthora sp., 黑蒂腐霉 D iplodia
sp., 镰刀菌 Fusarium sp.[14-15] 。陈时周认为柠檬流
胶病主要是由多种真菌混合侵染导致 , 其中真菌主
要包括疫霉 Phytophthora sp.,链格孢霉 Alternaria
sp., 腐霉 P y thium pringsheim , 拟茎点霉 Phomop-
sis sp.,镰刀菌 Fusarium sp.等致病真菌[ 16] 。其他
报道的柑桔流胶病的致病菌主要是壳囊孢菌 Phys-
alospora sp.、柑桔褐腐疫霉 Phytophthora citroph-
thora 、柑桔拟茎点霉 Phomopsis sp.等 4 种病原真
菌[ 17] 。本研究从金柑流胶的病害组织上分离到链
孢霉 Alternaria sp.和镰刀菌 Fusarium sp., 这与陈
时周报道的部分病原菌一致 ,说明链格孢和镰孢霉
23
中 国 南 方 果 树　　　　　　　　　　　　　　　第 40 卷
可能是导致金柑流胶的主要致病菌[ 16] 。 经过多次
和多地点分离都未发现 Phy tophthora sp., 可能是
地区差异或是柑桔品种不同造成了金柑流胶病致病
菌不同。
另外一种致病菌为叶点霉(Phy llosticta sp.),
它是柑桔脂点黄斑病的主要病原菌[ 18] 。 柑桔脂点
黄斑病是柑桔的一种普遍的真菌病害 ,会导致柑桔
大量落叶 ,树势衰弱 , 嫩梢受害后 ,僵缩不长 , 影响树
冠扩大;果实被害后 , 产生大量油瘤污斑 , 影响商品
价值。可能是叶点霉先侵染植株 ,导致树势变弱 , 以
便于其他病原菌侵染。在形态鉴定中未观察到分生
孢子和有性阶段的特征 ,可能是因为叶点霉的最适
生长条件还不清楚 ,有待进一步研究。
在柑桔流胶病防治方面 , 国外采取的防治措施
有增施有机肥 ,在植株主干涂抹甲霜灵抑制柑桔疫
霉 ,目前认为最经济有效的方法是使用抗流胶病品
种[ 19] 。国内采取的措施是刮除流胶病株的粗皮 、胶
状物 ,并选用 50%退菌特 800 倍液 、50%多菌灵 800
倍液 、70%托布津可湿性粉剂 1 000 倍液 、82.9%瑞
毒霉可湿性粉剂 100 倍液涂抹[ 20] 。但使用这些药
剂时 ,发现防治效果不是很明显。 试验发现 , JG4 孢
子悬浮液处理的茎段发病最严重 ,然后是 JG2、JG3 、
JG5、JG1 , 而 JG4、JG2、JG3 等 3 株真菌都为链格孢
菌。可能是这些药剂主要对疫霉 、镰孢霉 、黑蒂腐
霉 、腐霉 、拟茎点霉抑制作用比较大 , 而对链格孢菌
抑制作用较小 , 起不到较好防治效果[ 14] 。 因此 , 可
选取防治链格孢菌的药剂如铜制剂与上述化学药剂
混合使用 ,防效较好[ 21] 。
参　考　文　献
[ 1] 　邓　烈 , 吴厚玖 , 周常勇.世界柑桔鲜果市场分析
[ J] .柑桔与亚热带果树信息 , 2005 , 21(3):2-4
[ 2] 　M atheron M E , Porchas M .Comparative abilit y of
six fu ngicides to inhibit developmen t of Phytop htho-
ra gummosis on cit rus [ J] .Plan t Dis , 2002 , 86:
687-690
[ 3] 　陈　华 ,何　畅.柑桔流胶病的发生与防治[ J] .四川
农业科技 , 2007(2):49-50
[ 4] 　方中达.植病研究方法(第三版)[ M] .北京:中国农
业出版社 , 1998:124
[ 5] 　邵力平 ,沈祥瑞 ,张素轩.真菌分类学[ M ] .北京:中
国农业出版社, 1984:79-80
[ 6] 　左华清 ,王子顺, 王龙华.柑桔脚腐病病原的初步研
究[ J] .浙江柑桔 , 1985(3):19-40
[ 7] 　赵　杰.I TS序列分析及其在植物真菌病害分子检
测中的应用[ J] .陕西农业科学 , 2004(4):35-37
[ 8] 　Averna-S accá R.Molé stias da laranjei ra[ J] .Bol
Ag r , 1917 , 18:334-346
[ 9] 　Timmer L W , Menge J A , Zi tko S E , etal.C om pari-
s on of E LISA techniques and standard isolation
m ethods for P hy toph thora detect ion in ci t ru s or-
chard s in Florida and California [ J ] .Plant Dis.
1993 , 77:791-796
[ 10] Timmer L W.C haracterist ics of Phyto phthora i so-
lates from Texas cit ru s orchards [ J] .Rio G rande
Valley Hort ic Soc , 1973 , 27:44-48
[ 11] M atheron M E , Porchas M , M atejka J C.Dist ribu-
t ion and seasonal populat ion dy namics of Phytop h-
thora ci t roph thora and P.para sit ica in Ari zona ci t-
ru s o rchards and ef fect of fungicides on t ree heal th
[ J] .Plant Dis , 1997 , 81:1384-1390
[ 12] Klotz L J ,DeWolfe T A ,Wong P P.Decay of f ibrou s
root s of ci t rus [ J ] .Phy topathology , 1958 , 48:
616-622
[ 13] J E.Adaskaveg.2005.E tiology , Epidemiology and
M anagem ent of H yphoderm a Gummosis , Cit rus Re-
search Board [ EB/OL ] . ht tp:// www .ci t ru sre-
search.org/ etiology -epidemiology -and-m anage-
ment-of-hy phoderm a-gumm osis
[ 14] 魏盛林.柠檬流胶病病原菌的初步研究[ J] .安徽农
业 , 1993 , 22(4):33-34
[ 15] 秦煊南 ,魏盛林.柠檬流胶病病原菌及发生部位研究
[ J] .西南农业大学学报 , 1996 , 18(1):10-12
[ 16] 陈时周.柠檬流胶病原菌类型研究[ J] .西南农业学
报 , 1999 , 21(2):162-165
[ 17] 陈道茂.柑桔病虫草害防治新技术[ J] .北京:农业科
技出版社 , 1992:105-106
[ 18] 张凤如 ,殷恭毅.柑桔脂点黄斑病病原菌的研究[ J] .
植物病理学报 , 1987 , 17(9):153-159
[ 19] Matheron M E , Matejk a J C.Persistence of sy stemic
act ivity for fungicides applied to ci t ru s t runk s to con-
t rol Phytop hthora gummosis [ J] .Plant Dis , 1988 ,
72:170-174
[ 20] 饶兴祥 ,翦忠华.柑桔流胶病在云南的发生与防治
[ J] .中国南方果树 , 1998 , 27(6):24
[ 21] M M Dew dney , L W Timmer.2010 Florida Cit ru s
Pest Management Guide:Alternaria b rown spot
[ M ] .Florida:IFAS Extension , Universi ty of Flori-
da , 2009:147
(责任编辑:肖　田;英文编辑:董朝菊)
24