全 文 :J.SHANXI AGRIC.UNIV.(Natural Science Edition)
学报(自然科学版)2012,32(4) 002922
收稿日期:2012-05-11 修回日期:2012-05-27
作者简介:张文玲(1984-),女(汉),山西大同人,硕士,研究方向:花卉遗传育种。
CTV侵染对锦橙叶片营养元素含量的影响研究
张文玲,刘丹
(重庆三峡职业学院 农林科技系,重庆 万州404155)
摘 要:锦橙是我国南方重要的柑桔栽培品种,栽培面积广,但易被柑橘衰退病病毒(Citrus tristeza virus,CTV)侵
染。选用两年生实生锦橙为材料,一组嫁接感染CTV强毒株TRL514的枝条的皮和芽,另一组嫁接正常枝条作为对
照,接种后用DTBIA法和RT-PCR法检测CTV侵染情况。接种了CTV的锦橙呈现顶梢枯死、叶片变黄、茎陷点等
症状,通过测定春梢叶片氮、磷、钾、硫、钙、镁、铁、锰、铜、硼和锌等11种元素的含量发现:接种了CTV的锦橙氮、钾和
铜的含量高于对照;而磷、钙、硫、硼、铁、锰和锌的含量较低;镁的含量差异不大。两组材料间营养元素含量的差异在一
定程度上可以解释CTV侵染产生的木质部凹陷对植株的影响,并为今后柑橘衰退病的预防和诊断提供一定的依据。
关键词:柑橘衰退病病毒;营养分析;锦橙
中图分类号:S666.4 文献标识码:A 文章编号:1671-8151(2012)04-0333-04
Effects of CTV Inoculation on the Nutrient Contents of Jincheng Orange Leaves
Zhang Wenling,Liu Dan
(Chongqing Three Gorges Vacational College,Wanzhou Chongqing 404155,China)
Abstract:Jinchen orange is one of the most important citrus variety in China,whose cultivation area is large but easily
infected by one of the most economicaly important viral pathogen CTV.In our study,14two-year-old Jinchen
plants were divided into two groups,one grafted with normal bark and bud,and the other was CTV infected.The
presence of Citrus tristeza virus in leaves was then confirmed by DTBIA and polymerase chain reaction(PCR)using
specific PCR primers.The CTV grafted Jinchen orange showed symptoms of dieback,leaf yelowing and xylem stem
subsidence points/channel.Chemometric analysis showed that compared with normal grafted Jinchen,in the CTV in-
fected Jinchen the concentration of P、Ca、S、B、Fe、Mn and Zn was lower,however,the contents of N、K and Cu were
higher.Mg contents were similar between the two groups.The mineral content may give some suggestions for the
CTV induced xylem stem subsidence points and provide some clues for the CTV prevention and diagnosis.
Key words:Citrus tristeza virus(CTV);Nutrition Analysis;Jinchen orangee
柑橘衰退病毒(Citrus tristeza virus,CTV)
是长线性病毒科,长线性病毒属的一种正义单链
RNA病毒,能够侵染大多数的柑桔种、杂种及其近
缘种,由它引起的柑桔衰退病是对全球柑橘生产破
坏性最强的病害之一,是威胁我国柑橘生产的三大
主要病害之一,该病广泛分布于世界各柑橘产地,
对全世界的柑橘产业造成了严重威胁。CTV侵染
之后的植株有的不会产生症状[1],根据植株表现出
的症状类型目前主要分为速衰、茎陷点、苗黄和脉
明四种。病株可表现单一症状或复合症状。其中
茎陷点会引起来檬、葡萄柚、柚和甜橙茎干木质部
凹陷(茎陷点或沟)、树势衰退、矮化、发育迟缓、果
实畸变、品质下降[2]。我国从20世纪90年代开始
大力发展甜橙和柚类品种,茎陷点型病毒株系对感
病甜橙品种为害日益成为比较突出的问题。
目前,营养元素分析已经广泛应用于梨[3]、苹
果[4]、扁桃[5]、李[6]、枇杷[7]以及柑桔[8]等果树研究
中,但关于病毒侵染引起对果树的营养生理影响的
报道较少[9]。锦橙作为我国南方的一种重要果树,
易被CTV侵染,目前关于CTV侵染柑桔对其叶
片营养造成的影响的研究还没有,因此本实验希望
通过研究实验条件下锦橙被CTV侵染后的植株
DOI:10.13842/j.cnki.issn1671-8151.2012.04.013
变化及CTV对营养元素含量变化的影响,以期为
生产上矫治锦橙的衰退病提供科学依据。
1 材料与方法
1.1 实验材料
选择两年生温室盆栽实生锦橙,长势良好且基
本一致。采用嫁接法进行接毒。在嫁接前浇水至
盆土水分饱和。然后将植株分为两组:一组5株,
每株嫁接无毒枝条的皮2个,芽1个作为对照组,
分别标记为1到5号;其余9株嫁接感染CTV强
毒株Trl514的枝条的皮2个,芽1个,标记为6到
14号。嫁接后去除顶端枝条,接穗抽生后剪去多
余枝条。
1.2 实验方法
1.2.1 CTV侵染鉴定
根据Garnsey等的方法[10]对采集的样品进行
检测接毒株用直接组织印迹免疫法(Direct Tissue
Blot Immuno-Assay,DTBIA)DTBIA 初筛,之后
利用采用 RT-PCR法对接种CTV的锦橙叶片
RNA进行 CTV 毒性检测(引物序列为:上游引
物:5'-CTTCCAACAATACGCAGTCTCAG-3'
下游 引 物:5'- GAAGATCTCCGCCGGAAA-
CACTCAGAC-3',目标片段614bp),另外还分别
抽提了接毒后1、2、3、4、5和6个月时叶片的RNA
做反转录后检测CTV(引物序列为:上游引物:5'-
TTAACGGGGTGACCAAGACG-3';下游引物:
5'-TTCCAAACCAAACCGACACAG-3',目标
片段182bp)。
1.2.2 样品的采集和前处理
取当年生春梢营养枝顶部第3叶,对照和处理
锦橙叶片各120片,装入有孔的干净塑料袋,置冰
盒中,带回实验室;先用自来水加入0.1%中性洗
涤剂清洗叶片正反两面,再用自来水清洗3次,然
后置于0.2%盐酸溶液浸泡30s后用自来水冲洗
2次,最后再用去离子水清洗3次,置于烘箱中
105℃杀酶30min,然后75~80℃烘干,粉碎、密
封,置干燥器中保存待测。
1.3 营养元素含量测定
样品经前处理后,氮元素含量按LY/T 1269
-1999方法,浓硫酸消解,在 KDY-9820凯氏定
氮仪上测定;磷、钾、钙、镁、铁、锰、铜和锌等8种元
素按LY/T 1270-1999方法,硝酸-高氯酸消解,
磷用 TU-9101双光速紫外可见分光光度计在
700nm波长下测定;钾、钙、镁、铁、锰、铜和锌元素
用AA-800原子吸收分光光度计测定;B含量按
LY/T 1273-1999方法,干灰化法,用TU-9101
紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任
公司)在430nm波长下测定。重复测定3次。
2 结果与分析
2.1 接毒锦橙症状表现
观察接种了CTV的锦橙(图1)发现:9株接
毒锦橙中有两株呈现顶梢枯死,叶片出现黄化现
象,茎剥去枝条皮层后可以看到茎陷点。另外由于
温室通风不良、湿度较大及温度偏高等原因,接种
CTV的锦橙叶片大片呈现煤烟病症状,而在无毒
嫁接的锦橙上则没有出现煤烟病症状。
图1 CTV侵染后植株症状
Fig.1 Symptoms of Jinchen orange after CTV infection
注:A为顶梢枯死;B为叶片黄化;C为茎陷点(沟)症状
Note:A:dieback symptom B:Leaf yelowing C:Xylem
stem subsidence points/channel
2.2 CTV检测结果
2.2.1 DTBIA检测结果
在每个植株上各取3个叶片做直接组织印迹
免疫法(Direct Tissue Blot Immuno-Assay,DT-
BIA)DTBIA分析,DTBIA分析,所有接毒的9株
锦橙均呈现CTV阳性。6~9号植株染色较深,而
10~14号显色较浅。
433 山 西 农 业 大 学 学 报(自然科学版) 2012
图2 DTBIA检测结果
Fig.2 Electrophoresis result of CTV detection
注:“+”为阳性对照,“-”为阴性对照
Note:'+'is positive control;'-'is negative control
2.2.2 RT-PCR检测结果
为了更精确的确定CTV侵染情况,我们又用
Trizol法分别提取了每个植株的总 RNA,应用
TransGen Biotech公司生产的反转录第一链cD-
NA合成录试剂盒(T301-02)进行反转录后PCR
检测。结果见图3,可看出所有接毒植株均呈现
CTV阳性。接毒后的1个月、2个月、3个月、4个
月、5个月和6个月的CTV检测情况如图4所示。
2.3 营养元素的含量状况
通过t测验比较两组锦橙之间的元素含量发
现,接种了CTV的锦橙中氮、钾、铜含量与对照相
比差异极显著;而钙、硫、硼、铁、锰和锌的含量低于
正常嫁接的锦橙,差异极显著;磷、镁的含量相差不
大。且相对于叶片营养诊断标准[11]氮、磷、钾的量
都过高。其中硼、锰、铁、钙和锌元素含量差异较为
明显。
图3 CTV检测结果
Fig.3 Electrophoresis result of CTV detection
注:M:DL2000marker;1~5为无毒嫁接;6~14接种了
CTV
Note:M:DL2000marker;1~5are grafted with no CTV;6
~14are grafted with CTV
图4 CTV检测结果
Fig.4 Electrophoresis result of CTV detection
注:M:DL2000marker;1~6分别接毒后的6个时期
Note:M:DL2000marker;1~6are six phases after grafting
表1 锦橙叶片营养元素含量状况
Table 1 Status of nutrient contents in Jincheng orange leaves
叶片
类型
Leaf
type
叶片营养元素的含量
The contents of nutrient element in leaves
氮
N/%
磷
P/%
钾
K/%
钙
Ca/%
镁
Mg/%
硫
S/%
硼
B
/mg·kg-1
铁
Fe
/mg·kg-1
锰
Mn
/mg·kg-1
铜
Cu
/mg·kg-1
锌
Zn
/mg·kg-1
无毒嫁
接锦橙
3.661 0.454 1.992 3.064** 0.267 0.666**172.954** 216.987** 65.673** 11.441 30.011**
接种CTV
锦橙
3.968** 0.446 2.089** 2.302 0.257 0.468 140.816 136.249 51.260 13.283** 26.023
3 结论与讨论
本实验成功对锦橙进行了接毒,鉴于CTV颗
粒很长[11],发生断裂后易失去侵染能力且通过汁
液摩擦接种的成功率很低,故采用嫁接法进行接
毒。接毒成功率为100%。观察接毒后锦橙症状,
叶片出现黄化现象,茎陷点较为明显。另外,还有
2株接种了CTV的锦橙出现了顶梢枯死现象。接
53332(4) 张文玲等:CTV侵染对锦橙叶片营养元素含量的影响研究
种了CTV强毒株TRL 514的锦橙植株还感染了
煤烟病,而接种无毒枝条皮和芽的锦橙则没有感染
煤烟病,这种情况的产生可能类似于感染了艾滋病
后免疫力低下相似。植物体由于CTV的侵染,免
疫能力下降,因而感染其他一些真菌性、细菌性和
病毒性病害的几率也变大。
通过营养元素分析还发现:接毒锦橙中硼、锰、
铁、钙和锌元素含量低于无毒嫁接的锦橙且差异比
较明显,在一定程度上可以反映出CTV侵染对植
株营养状况的影响。硼含量的降低说明接毒锦橙
由于CTV的侵染,细胞衰亡速率加快,同时硼含
量的降低也使得植株更易产生光抑制现象。锰、
铁、钙、锌含量的降低可以说明CTV的侵染影响
了植株氧化还原、呼吸、光合作用等过程,对植株的
生长发育产生影响。CTV侵染的锦橙中铜含量相
对于无毒嫁接锦橙要高,可以反映出CTV侵染影
响到植株呼吸作用。另外铜对氮素代谢亦有影响,
通过比较可以看出,氮和铜在接毒植株中的量均高
于无毒嫁接锦橙。
综上,可以看出CTV的侵染严重影响了锦橙表
型、营养运输并最终影响一系列的生理生化过程。
通过本实验研究可以发现,CTV的侵染严重
影响了锦橙的正常生长,其营养元素含量也因
CTV的侵染发生改变,然而,由于本实验只是研究
了实验室条件下CTV侵染对植株的影响,因此还
不能代表田间情况。实验条件下营养元素的差异
表现出植株对于CTV侵染所作出的应答。本实
验在一定程度上可以反映出CTV导致锦橙植株
形成茎陷点(沟)对营养元素吸收的影响。可以为
今后CTV的预防和诊断提供一定的理论依据,尤
其是营养元素的变化也可以做为日后研究 CTV
影响的重要指标。在今后的研究中,还可以通过结
合抑制性差减杂交(SSH)技术以及基因芯片等技
术研究CTV应答基因,进而从分子水平揭示CTV
侵染对植株的影响。
参 考 文 献
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(编辑:马荣博)
633 山 西 农 业 大 学 学 报(自然科学版) 2012