全 文 ：茶枝柑皮中多糖组成成分的分析
陈 思1，3，黄庆华1* ，游明霞2，吴韶辉1，李娆玲1，甘伟发1
(1．广东药学院，广东广州 510006;2． 广东汤臣倍健生物科技股份有限公司，广东珠海 519040;3． 健康元药业集团股份有限公司;广东深圳
518057)
摘要 ［目的］研究测定茶枝柑皮中多糖的组成成分。［方法］以 1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)进行柱前衍生化，采用反相高效液相
色谱法，测定茶枝柑皮多糖中单糖衍生物。色谱条件为:色谱柱为 Phenomenex Luna C18(4． 6 mm × 250 mm，5 μm);流动相为浓度 0． 05
mol /L混合磷酸盐溶液 －乙腈(80∶20，V/V，pH =7． 1);检测波长为 245 nm。［结果］茶枝柑皮多糖由甘露糖、核糖、鼠李糖、半乳糖醛酸、
葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖组成，其摩尔比为 0． 08∶0． 002∶0． 05∶4． 80∶1∶1． 52∶0． 11∶3． 82。［结论］该方法具有操作简单、快速、重复性
好、回收率高等特点，可用于柑橘果胶多糖中单糖组成及含量的测定。
关键词 茶枝柑皮多糖;单糖;PR-HPLC;柱前衍生化
中图分类号 R284． 2 文献标识码 A 文章编号 0517 －6611(2011)32 －19731 －03
Analysis of Polysaccharides Composition of Citrus reticulata‘Chachi’Peel
CHEN Si et al (Guangdong?Pharmaceutical University，Guangzhou，Guangdong 51006)
Abstract ［Objective］Polysaccharides composition of Citrus reticulata‘Chachi’peel was studied．［Method］Taking PMP for pre-column de-
rivatization，monosaccharide derivatives in polysaccharides of Citrus reticulata‘Chachi’peel were detected by Reversed-Phase High Perform-
ance Liqnid Chromatography (RP-HPLC)． Chromatographic conditions were Phenomenex Luna C18(4． 6 mm × 250 mm，5 um)，0． 05 mol /L
phosphate solution – acetonitrile (80∶ 20，V /V，pH = 7． 1)as mobile phase，and detection wavelength at 245 nm．［Result］Polysaccharides of
Citrus reticulata‘Chachi’peel were composed of mannose，ribose，rhamnose，galacturonic acid，glucose，galactose，xylose，and arabinose． Their
molar ratio was 0． 08:0． 002:0． 05:4． 80:1:1． 52:0． 11:3． 82．［Conclusion］This method was simple，rapid，repeatable and has high recovery
rate． Thus，it could be used for the determination of monosaccharide composition and content in citrus pectin polysaccharides．
Key words Citrus reticulata‘Chachi’peel polysaccharides;Monosaccharide;RP-HPLC;pre-column derivatization
基金项目 珠海市科技工贸和信息化局企业技术创新项目(珠经贸字
(2009)414 号) ;广东省教育厅大学生创新实验项目资金资
助(1057310008)。
作者简介 陈思(1984 － ) ，女，广东梅州人，实验员，硕士，从事药品质
量研究，E-mail:py_simone@ 163． com。* 通讯作者，教授，
硕士生导师，从事中药保健食品的提取开发与质量控制研
究，E-mail:hqh1003@ 163． net。
收稿日期 2011-07-28
茶枝柑皮是茶枝柑(Citrus reticulata‘Chachi’)的成熟果
皮，晒干陈化后的果皮即为广东道地药材———广陈皮。陈皮
是药食两用的药材，除了含有挥发油、黄酮外，还含有丰富的
果胶多糖。莫云燕等研究发现茶枝柑皮果胶多糖具有抗氧
化活性［1］，药理研究表明柑橘果胶多糖能够调节血脂(影响
机体对胆固醇的吸收、胆汁酸的分泌)、预防肿瘤的生长及转
移和抑制癌细胞的生长［2 －4］。试验首次运用 PMP柱前衍生
化高效液相色谱法测定茶枝柑皮果胶多糖的单糖组成，方法
简便、快速且重现性好。
1 材料与方法
1． 1 材料
1． 1． 1 研究对象。茶枝柑皮(广东翁源，采收期为 2009
年) ，经广东药学院药用植物与中药鉴定学系李书渊教授鉴
定为茶枝柑(Citri Reticulata Chachi)的干燥成熟果皮。
1． 1． 2 主要仪器。Agilent 1200 Series 高效液相色谱仪，购
自 Agilent公司;PHS-25 型酸度计，购自上海伟业仪器厂;
Phenomenex Luna C18(250 mm ×4． 60 mm，5 μm)色谱柱，购自
美国 Phenomenex公司。
1． 1． 3 主要试剂。1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)、三氟
乙酸(TFA) (分析纯) ，购自阿拉丁试剂公司;甘露糖(Man)、
核糖(Rib)、鼠李糖(Rha)、木糖(Xyl)、半乳糖(Gal) ，购自上
海源聚生物科技有限公司;半乳糖醛酸(GalA)、阿拉伯糖
(Ara) ，购自广州市齐云生物技术有限公司;葡萄糖(Glc) ，购
自广州光华化学厂有限公司;乙腈(色谱纯) ，购自 Dikma 公
司;氢氧化钠、盐酸、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾(分析纯) ，购自
广州化学试剂厂。
1． 2 方法
1． 2． 1 茶枝柑皮多糖的提取。采用酸水提醇沉法提取茶枝
柑皮多糖。称取干燥过 60目筛的茶枝柑皮粉 100 g，加 3 000
ml的盐酸水溶液(pH = 4)后于 90 ℃水浴中提取 90 min，过
滤，滤渣同法提取 1 次后再过滤，合并 2 次滤液。将滤液旋
蒸浓缩至 1 /3左右，向其中加入约 5 000 ml浓度 95%乙醇，4
℃静置过夜后离心分离得多糖沉淀。将沉淀分别用乙醇、丙
酮、乙醚洗涤，然后真空干燥得茶枝柑皮粗多糖。
1． 2． 2 衍生化产物的制备。
1． 2． 2． 1 多糖水解。精密称定 25． 0 mg茶枝柑皮多糖，置于
安瓿瓶中，加入 4． 0 ml 浓度为 2 mol /L的 TFA溶液，然后将
安瓿瓶中充氮气，封管后于 120 ℃水解 2 h，得水解样品。加
甲醇旋干，重复 3 ～4次，加水溶解并稀释定容到 10． 0 ml。
1． 2． 2． 2 对照单糖的衍生化。配制含甘露糖 48． 100
μg /ml、核糖 3． 040 0 μg /ml、鼠李糖 43． 160 μg /ml、半乳糖醛
酸 575． 84 μg /ml、葡萄糖 120． 04 μg /ml，半乳糖 320． 40
μg /ml、木糖32． 720 μg /ml、阿拉伯糖307． 84 μg /ml的对照品
混合标准溶液。取该溶液各 500 μl，分别置于具塞试管中;
依次加入 500 μl PMP-甲醇溶液 (0． 5 mol /L)和 NaOH溶液
(0． 3 mol /L) ，70 ℃水浴反应 40 min，取出放置 10 min，冷却
至室温，各加入 500 μl浓度为 0． 3 mol /L 的 HCl溶液中和，
再加入 500 μl氯仿涡旋萃取，弃下层有机相，重复 3次，上层
水相经 0． 45 μm滤膜过滤［5］。
1． 2． 2． 3 样品的衍生化。精密取茶枝柑皮多糖水解溶液
500 μl，按“1． 2． 2． 2”项下衍生化，进行 HPLC分析。
1． 2． 3 色谱条件。色谱柱为 Phenomenex Luna C18(250 mm
安徽农业科学，Journal of Anhui Agri． Sci． 2011，39(32):19731 － 19733，19754 责任编辑 石金友 责任校对 傅真治
DOI:10.13989/j.cnki.0517-6611.2011.32.105
×4． 60 mm，5 μm) ;流动相为 0． 05 mol /L混合磷酸盐溶液 －
乙腈(80∶20，V/V，pH = 7． 1) ;流速为 1． 0 ml /min;检测波长
为 245 nm;柱温为 30 ℃;进样体积为 20 μl。
1． 2． 4 色谱条件的选择。
1． 2． 4． 1 pH值的选择。分别配制浓度均为 0． 05 mol /L 的
KH2PO4 溶液和 Na2HPO4 溶液，将 Na2HPO4 溶液慢慢滴入
KH2PO4 溶液，分别调至 pH为 6． 7、6． 9、7． 1、7． 3、7． 5 的混合
磷酸盐缓冲溶液，然后与乙腈按 80∶20(V /V)比例混合制成不
同的流动相溶液，取单糖衍生化混合对照品溶液进样，根据
色谱分离情况优选流动相 pH值。
1． 2． 4． 2 流动相中乙腈比例的选择。按“1． 2． 4． 1”项的方
法，配制浓度 0． 05 mol /L(pH 7． 1)的混合磷酸盐缓冲溶液，
然后分别与乙腈按 81∶19、80∶20、79∶21(V /V)的比例混合成流
动相，分别取单糖衍生化混合对照品溶液进样，根据色谱分
离情况优选流动相中乙腈比例。
1． 2． 5 方法学考察。
1． 2． 5． 1 线性关系的考察。精确量取对照品混合溶液0． 25、
0． 50、1． 00、2． 00、4． 00、6． 00、8． 00 ml 分别置 10． 00 ml 量瓶
中，用水稀释至刻度，摇匀，作为系列对照品混合溶液。按
“1． 2． 2． 2”项的方法进行衍生化处理，分别取 20 μl 按
“1． 2． 3”项下色谱条件进行测定，以峰面积对各单糖浓度计
算各单糖标准曲线、相关系数及线性范围。
1． 2． 5． 2 精密度试验。取对照品混合液，按“1． 2． 2． 2”的方
法进行衍生化处理，取 20 μl 按“1． 2． 3”下色谱条件进行测
定，重复进样 6 次，记录峰面积，计算甘露糖、核糖、鼠李糖、
半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖的 RSD。
1． 2． 5． 3 方法重复性试验。取 6 份茶枝柑皮多糖，每份约
25． 0 mg，精密称定，按“1． 2． 2． 1”项进行多糖水解，再按
“1． 2． 2． 3”项的方法做衍生化处理，取 20 μl 按“1． 2． 3”项下
色谱条件进行测定，计录峰面积，计算各单糖的 RSD。
1． 2． 5． 4 稳定性试验 取“1． 2． 2． 3”项下样品溶液，分别在
0、2、4，6、8、12 h，取 20 μl 进样，测定计算 12 h 内的各单糖
RSD。
1． 2． 5． 5 加样回收率试验。精密称定 6 份含量已知的茶枝
柑皮多糖，水解后分别定量(1∶1)加入各单糖对照品溶液，按
“1． 2． 2． 3”项下进行处理，取 20 μl按“1． 2． 3”项下方法测定，
计算平均加样回收率和 RSD。
1． 2． 6 茶枝柑皮多糖样品分析。茶枝柑皮多糖的色谱峰保
留时间进行对比，多糖样品的分析步骤同“1． 2． 2． 1”项，将茶
枝柑皮多糖的色谱峰保留时间与对照单糖进行对比，并计算
茶枝柑皮多糖的单糖组成摩尔比。
2 结果与分析
2． 1 色谱条件的选择
2． 1． 1 pH值的选择。由图 1所示不同 pH值流动相对色谱
峰分离结果可以发现，随着 pH的增高，色谱峰分离度有所增
加，单糖的分析时间却缩短，且在 pH为 7． 1时达到最佳分离
度;随着 pH进一步增高，尽管单糖分析时间也在缩短，色谱
峰分离度却明显降低。因此，选择流动相缓冲盐 pH为 7． 1。
注:A:pH =6． 7、B:pH =6． 9、C:pH =7． 1、D:pH =7． 3、E:pH =7． 5;1．甘露糖 Man;2．核糖 Rib;3．鼠李糖 Rha;4．半乳糖醛酸 GalA;5．葡萄糖
Glc;6．半乳糖 Gal;7．木糖 Xyl;8．阿拉伯糖 Ara。
图 1 pH对衍生物分离效果的影响
Fig． 1 Effects pH value on the separation of derivatives
2．1．2 流动相中乙腈比例的选择。在上述最佳条件下考察不同
配比乙腈色谱分离体系中，8种单糖 － PMP衍生物在 C18柱上的
保留值及分离效果。结果显示，随着乙腈体积分数的增加，单糖
保留时间减少，葡萄糖 Gal与木糖 Xyl的分离度逐渐提高，但是
木糖Xyl与阿拉伯糖 Ara的分离度反而减少，在乙腈浓度达到
20%时，3者的分离度与保留时间达到最佳(图 2)。
2． 2 方法学考察
2． 2． 1 线性关系的考察。通过结果计算得出各单糖标准曲
线、相关系数及线性范围(表1)。由表1可知，各单糖在各自
的浓度范围内有良好的线性关系。
23791 安徽农业科学 2011 年
注:(a)19% acetonitrile、(b)20% acetonitrile、(c)21% acetonitrile;1．甘露糖 Man;2．核糖 Rib;3．鼠李糖 Rha;4．半乳糖醛酸 GalA;5．葡萄糖 Glc;
6．半乳糖 Gal;7．木糖 Xyl;8．阿拉伯糖 Ara。
图 2 不同乙腈用量对 PMP衍生物分离效果的影响
Fig． 2 Effects of acetonitrile dosage on the separation of PMP derivatives
表 1 8种单糖的标准曲线和线性范围
Table 1 Standard curves and linear range of 8 kinds of monosaccha-
ride
单糖
Monosac-
charide
标准曲线
Standard
curve
相关系数
Correlation
coefficient
线性范围
Linear range
μmol /L
Man y =14． 24x +63． 32 0． 999 4 0． 834 ～26． 690
Rib y =14． 28x +35． 88 0． 998 7 0． 063 ～2． 024
Rha y =4． 953x +45． 29 0． 999 3 0． 740 ～23． 690
GalA y =9． 000x +14． 77 0． 999 5 8． 482 ～271． 400
Glc y =7． 087x +43． 40 0． 999 4 2． 082 ～66． 630
Gal y =6． 811x +34． 88 0． 999 0 5． 557 ～177． 800
Xyl y =4． 217x +13． 79 0． 998 9 0． 681 ～21． 790
Ara y =9． 264x +7． 58 0． 999 2 6． 407 ～205． 000
2． 2． 2 精密度试验。计算甘露糖(Man)、核糖(Rib)、鼠李
糖(Rha)、半乳糖醛酸(GalA)、葡萄糖(Glc)、半乳糖(Gal)、
木糖(Xyl)、阿拉伯糖(Ara)的峰面积的 RSD分别为:0． 94%、
0． 92%、0． 64%、0． 33%、0． 45%、0． 58%、0． 96%、0． 70%，结
果表明仪器精密度良好。
2． 2． 3 重复性试验。计算各单糖峰面积的 RSD 分别为:甘
露糖(Man)1． 24%、核糖(Rib)1． 42%、鼠李糖(Rha)1． 54%、
木糖(Xyl)1． 88%、半乳糖(Gal)1． 20%，半乳糖醛酸(GalA)
0． 98%、阿拉伯糖(Ara)1． 54%、葡萄糖(Glc)1． 10%，结果表
明该方法重复性良好。
2． 2． 4 稳定性试验。计算得 12 h内的各单糖峰面积的 RSD
分别为:甘露糖(Man)2． 17%、核糖(Rib)1． 84%、鼠李糖
(Rha)2． 07%、木糖(Xyl)2． 08%、半乳糖(Gal)1． 52%、半乳
糖醛酸(GalA)1． 26%、阿拉伯糖(Ara)1． 95%，说明室温下样
品溶液在 12 h内稳定。
2． 2． 5 加样回收率试验。计算平均加样回收率分别为:甘
露糖(Man)94． 8%、核糖(Rib)93． 3%、鼠李糖(Rha)95． 1%、
半乳糖醛酸(GalA)95． 8%、葡萄糖(Glc)94． 9%、半乳糖
(Gal)95． 3%、木糖(Xyl)93． 6%、阿拉伯糖(Ara)94． 5%。他
们的 RSD值分别为 1． 24%、2． 75%、0． 86%、2． 09%、2． 43%、
0． 71%、1． 63%、2． 16%，结果表明，回收率较好，方法可行。
2． 3 茶枝柑皮多糖样品分析 将各单糖对照品的色谱峰保
留时间与茶枝柑皮多糖的色谱峰保留时间进行对比，如图 3，
可以确定茶枝柑皮多糖含有(Man)甘露糖 、核糖(Pib)、鼠李
糖(Rha)、半乳糖醛酸(GlaA)、葡萄糖(Glc)、半乳糖(Gal)、
木糖(Xgl)、阿拉伯糖(Ara)等单糖。各种单糖的摩尔比为
0． 08∶0． 002∶0． 05∶4． 80∶1∶1． 52∶0． 11∶3． 82［6］。
注:1．甘露糖 Man;2．核糖 Rib;3．鼠李糖 Rha;4．半乳糖醛酸 GalA;5．葡萄糖 Glc;6．半乳糖 Gal;7．木糖 Xyl;8．阿拉伯糖 Ara。
图 3 茶枝柑皮水解多糖(A)和对照单糖(B)的衍生物图
Fig． 3 Derivatives of hydrolyzed polysaccharide (A)and control monosaccharide (B)
3 结论
试验对流动相缓冲溶液 pH 值和有机相体积比进行了
选择和优化，结果表明单糖衍生物保留时间及峰分离度与流
动相 pH 值及乙腈体积比有密切关系。
试验利用高效液相色谱 －紫外检测器(HPLC-UV)和普
通 C18色谱柱的建立色谱条件，使 8 种常见单糖得到了良好
的分离，并测定出了茶枝柑皮果胶多糖的单糖组成及含量。
茶枝柑皮多糖色谱图中还有一个 9 号未知峰，需利用 HPLC-
MS等技术对其进行进一步的鉴定研究。
(下转第 19754页)
3379139卷 32期 陈 思等 茶枝柑皮中多糖组成成分的分析
表 1 连钱草挥发油提取因素水平
Table 1 Factors and levels of L9(3
4)orthogonal test
水平
Levels
因素 Factors
浸泡时间 A
Soaking
time∥h
料液比 B
Solid-liquid
ratio∥g /ml
提取时间 C
Extraction
time∥h
NaCl浓度 D
NaCl concen-
tration∥%
1 0 1∶12 3 0
2 1 1∶14 4 5
3 6 1∶16 5 10
2 结果与分析
2． 1 正交试验结果 由表 2可知，极差 RA ＞ RB ＞ RC ＞ RD，
即 4个因素中 A 因素(浸泡时间)对压力共沸精馏提取连
钱草精油的影响最大，为主要影响因素，因素 B(料液比)为
次要因素。对表 2 进行方差分析可知，方差分析与直观分
析结果一致，4 个因素对压力共沸精馏提取连钱草精油均
无明显影响。通过直观分析和方差分析结果得出在压力共
沸精馏提取连钱草精油的工艺中，最佳组合为 A3B3C2D1，即
药材粒度固定为 14目筛，回流比为 4∶1 的条件下，浸泡时间
6 h，料液比 1∶16(g /ml) ，提取时间 4 h，NaCl浓度为 0，提取效
果最佳。
表 2 压力共沸精馏提取连钱草精油的正交试验结果
Table 2 Result of L9(3
4)orthogonal test
试验号
No．
因素水平 Factors and levels
A B C D
精油的得率
Yield of essen-
tial oils∥%
1 1 1 1 1 0． 013 8
2 1 2 2 2 0． 018 5
3 1 3 3 3 0． 018 3
4 2 1 2 3 0． 018 5
5 2 2 3 1 0． 020 8
6 2 3 1 2 0． 023 0
7 3 1 3 2 0． 021 5
8 3 2 1 3 0． 021 8
9 3 3 2 1 0． 030 0
k1 0． 050 6 0． 053 8 0． 058 6 0． 064 6 T =0． 186 2
k2 0． 062 3 0． 061 1 0． 067 0 0． 063 0
k3 0． 073 3 0． 071 3 0． 060 6 0． 058 6
R 0． 007 5 0． 005 9 0． 002 8 0． 002 0
2． 2 最佳工艺条件验证 由表 3 可知，所得到的精油量高
于正交试验的 9组试验结果，故表明在最佳工艺条件下进行
连钱草的提取，不但精油得量高，而且重复性好。
表 3 连钱草精油提取最佳工艺条件验证结果
Table 3 Results of verifying test
试验号
No．
精油得率
Yield of essential oils∥%
平均值
Mean∥%
1 0． 029 1
2 0． 032 1 0． 030 8
3 0． 031 2
3 讨论
压力共沸精馏提取连钱草精油的试验结果显示，浸泡时
间对试验结果产生了最大的影响，原因是浸泡可使组织细胞
膨胀，细胞间隙变大，加速细胞内外液动态交换而有利于精
油的提取，所以适当延长浸泡时间有利于精油的提取，试验
得出压力共沸精馏提取连钱草精油的最佳浸泡时间为 6 h。
试验中，料液比也对精油的提取产生较大影响，溶剂用量是
根据原材料的干燥程度、质地、成分在动植物存在形式及体
积而定的，所加溶液过少，则挥发油提取不全面，所加溶液过
多则精油溶解于溶液而乳化，形成水油共沸物使精油提取率
降低，试验得出的最佳料液比为 1∶16(g /ml)。提取时间也对
试验产生影响，适当提高提取时间，可以让精油被充分提取
出来，但是提取时间过长，精油量不再增加，反而有所下降。
这是因为连钱草精油中含有 6，10-二甲基-2-异丙烯基螺［4，
5］-6-癸烯-8-酮、松莰酮、(+)-喇叭烯、β-葎草烯、石竹烯等
化合物，这些化合物中大部分的沸点都很低，时间久了就会
挥发掉，致使产量下降，试验得出压力共沸精馏提取连钱草
精油的最佳提取时间为 4 h。试验中 NaCl 浓度对连钱草精
油的提取率影响程度最低。
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41 －44．
(上接第 19733页)
多糖的基本单糖组成是构成多糖重要活性的基础，高效
分离鉴别多糖中的单糖，对茶枝柑皮果胶多糖的功能开发及
质量控制具有重要意义。
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