全 文 ：17 6药物分析杂志 C hi n J Pha rm Ana l 2 8 00, 2 8 ( 2 )
吉九里香碱体外诱导 H C T 一 15 细胞凋亡的研究 ’
王三 龙 ` , 蔡兵 2 , 崔承彬 ’ , 阎少羽 4 , 吴春福 4
( 1
. 中国药品生物制品检定所 国家药物安全评价监测中心 , 北京 l o j 76 ; 2 . 北京生物医药研究所 , 北京 100 9卜
3
. 北京药理毒理研究所 ,北京 10 0 8 5 0 ; 4 . 沈阳药科大学中药学院药理系 , 沈阳 11001 6)
摘要 目的 :探讨中药单体吉九里香碱是否通过诱导 H C T 一 15 细胞凋亡而发挥其抑制肿瘤细胞增殖的作用 。 方法 : 采用 M rT
法检测细胞增殖抑制作用 ;采用透射电子显微镜观察细胞凋亡的形态学变化 ;库尔特全 自动颗粒粒度分析药物引起 H C T 一 巧
细胞体积大小分布的变化 ;琼脂糖凝胶电泳测定 D N A l ad del 的发生 ;通过流式细胞仪应用 A朋xe in v 一 FI T C 和 R h od a m in e 12 3
检测磷脂酞丝氨酸 ( P )S 及线粒体跨膜电位 ( △小m ) 。 结果 : M竹 结果显示吉九里香碱以浓度和时间依赖方式抑制 H C T 一 巧
细胞的增殖 , 抑制率依赖于吉九里香碱的浓度和作用时间 ;5 0 林m ol · L 一 ’吉九里香碱处理 H C T 一 巧 细胞 24 h 时 , 细胞出现凋
亡典型的形态学特征 ;50 林m ol · L 一 ’吉九里香碱分别处理 H C T 一 1 5 细胞 6 , 12 , 24 h 及不同浓度吉九里香碱处理 H CT 一 巧 细
胞 2 4 h 时 , 能够使细胞产生明显的 D N A lad de r 和体积大小变化 , 呈一定的量效和时效关系 ;细胞 SP 外翻随作用时间的延长而
增加 , 分别为 15 . 34 % ( 6 h ) , 2 0 2 0 % ( 1 2 h ) , 3 9 . 3 7 % ( 2 4 h ) ; 50 卜m o l · L 一 `吉九里香碱处理 H e T 一 15 细胞导致线粒体△小m 以
时间依赖方式下降 。 结论 :吉九里香碱通过诱导 H C T 一 巧 细胞凋亡而发挥其抗 H C T 一 巧 细胞增殖的作用 , 致凋亡机理可能
与线粒体△小m 快速下降有关
关键词 : 细胞凋亡 ; H C T 一 巧 细胞 ;黑果黄皮 ;吉九里香碱
中图分类号 : Rg 1 7 文献标识码 : A 文章编号 : 0 2 54 一 17 93 ( 2 0 08 )0 2 一 0 17 6 一 06
o n i n du
c it o n o f a P o P t o s i s b y g i r i in m b in e i n H C T 一 15 c e l l in v it ro `
W A N G s
a n 一 lo n g l , C A I B i n g Z , C U I Ch e n g 一 b i n 3 , Y AN Sh a o 一 y u 4 , WU C h u n 一 fu 4
( 1
.
N
a t i
o n a l C e n 一e r fo r S al 诀t y E v al u a t i o n o f D -ur g s , N a 一i o n a l In s t i t u t e fo r t h e C o n t ro l o f Ph ar m a 〔 e u r i e a l & B i o l o g i e al P ro d u e t s , B e ij i n g 10 0 17 6 , Ch i n a ;
2
.
B
e i j i n g In
o t i r u 一e . , f B io f ll e d i e i n e , B e i j i n g 10 0 0 9 1 , C h i n a : 3
.
B
e
ij i n g In
s t i t u t e o f P ha -rtn
a e o l o邵 a n d T ox i e o l o爵 , B e ij i n g 1 00 85 0 , Ch i n a :
4
.
D
e p art m
e n t o f p h
a朋 a e o l o舒 , S e h o o l o f C h i n e s e M a t e r i a l M e ( 11( 巴a , S h e n y a n g p h a rm a e e u t i e a l U n i v e rs i一y , Sh e n y an g 1 10 0 16 , C h i n a
A b s t r a c t O bj e e t i v e : T o i n v e s t i g a t e i f g i r i n im b i n e i n h i b i t s t h e p or l ife r a t io n o f H C T 一 1 5 b y i n d u e i n g i t s a p o p t o s i s
·
M e ht o d s : C e l l p r o l i fe r a t i o n i n h ib i ti o n w a s a s s e s s e d b y M件 a s s a y : M o印h o l o g i e a l e h a n g e s o f a p o p to s i s w e r e o b s e vr e d
w i ht i n v e rt fl u o r e s e e n e e m i e r o s e o p e : Th e d i s tr ib u t i o n o f th e e e l l v o lu m e s i z e s w a s a s s e s s e d b y C o u lt e r M u l t i s i z e r l
a n a l y ti e a l i n s t ru m e n t : DN A l a d d e r w a s e
x a m in e d b y D N A a g aor
s e g e l e l e e tor p h o r e s i s ; Ph o s p h o l i p id p h o s p h a t id y l
-
s e r i n e ( P S )
a n d m i t o e h o n d r i a l t r a n sm e m b r a n e p o t e n t i a l ( △中m ) w e r e m e a s u r e d w i t h A n n e x i n V 一 F IT C a n d fl u o -
re s e e n t P r o b e R h l 2 3
, r e s p e e ti v e l y
.
R e s u l t s : M件 a s s a y s h o w e d th a t g ir i n im b i n e i n h i b i t e d th e p or l ife r a t io n o f H C T -
15 e e l l s ir l a t im e 一 a n d e o n e e n t r a t i o n 一 d e p e n d e n t m a n n e r
.
H C T 一 15 e e l l s t r e a t e d w i th 5 0 林m o l · L 一 ’ g i r i n i m b i n e
fo r 2 4 h o u r s s h o w e d ty p i e a l m o甲h o l o g i e a l e h a n g e s o f a p o p t o ti e p h a s e . A ft e r ter a t e d w i t h 5 0 林m o l · L 一 ’ g i ir n im b i n e
fo r 6
,
12 a n d 2 4 h o u r s o r w i th g i
r i n im b i n e i n d i fe
r e n t e o n e e n t r a ti o n s fo r 2 4 h o u r s
, r e s p e e ti v e l y
,
th e r e w e r e o b
v i o u s
e h a n g e s o f l ) N A l a d d e r a n d th e d i s t ir b u ti o n o f t h e e e l l v o l u m e s i
z e
.
T h e r e s u lt s o b t a i n e d w i t h A n n e x i n V 一 F ITC k i t
s h o w e d th a t t h e p e
r e e n t a g e o f t h e a p o p t o t i e e e l l s w a s 1 5
.
3 4% ( 6 h )
,
2 0
.
2 0% ( I Z h )
, a n d 3 9
.
3 7% ( 2 4 h )
.
T h e
t r e a tm e n t w i t h 5 0 林m o l · L 一 ’ g i ir n i m b in e r e s u l t e d i n a r a p id d e e r e a s e o f △中m i n a t im e 一 d e p e n d e n t m a n n e r . C o n ·
c l u s i o n : T h e s e r e s u l t s s u路 e s t t h a t g i ir n im b in e s h o w s i t s a n t ie a n e e r a e ti v i ty b y i n d u e i n g ap o P to s i s o f H C T 一 15 e e l l s ,
a n d i t s a p o p t o s i s i n d u e i n g m e e h a n i s m m a y i n
v o lv e t h e r a p id d e e r e a s e o f △中m .
K e y w o r d s : a p o p t o s i s ; H C T 一 15 e e l l ; lC a us e n a d u n n i a n a eL v l
.
: g i r in im b i n e
国家重点基础研究发展规划项目 ( 97 3 项目 )基金 ( N o一 9 9 8 0 5 1 1 13 ) ;国家杰出青年基金 ( N o . 39 8 2 5 12 6 )
第一作者 T e l : ( o xo ) 6 7 s 7 6 2 5 x : F ax : ( 0 10 ) 67 87 6 2 5 5 ; E 一 m a i l : w a n g s a n l o n g@ n i c P b P · o r g · c n
DOI : 10. 16155 /j . 0254 -1793. 2008. 02. 001
药物分析杂志 h C i nJP h r a m A nl a2 00 8, 2 8 ( 2 )
细胞凋亡是细胞在基因调控下的一种主动的生
理性死亡 ,与细胞坏死有着完全不同的死亡机制 ,它
在肿瘤的发生和治疗中具有重要意义 。 因此对其深
人研究将有助于阐明肿瘤细胞发生发展和衰亡的全
过程 。
吉九里香碱 ( g ir in m hi en ,又名吉尼宾 ) ,属 咔哩
类生物碱化合物 , 系从隶属 于芸香科 ( R ut ac ea 。 )黄
皮属 ( C la u s e n a ) 的 黑 果黄 皮 ( C l a u s e n a d u n n i a n a
Lve l
.
)中分离得到 。 我们实验室在研究前期利用小
鼠乳腺癌 st F代 10 细胞测试吉九里香碱的生物活性
结果表明 , 吉九 里香碱对 st F犯 or 细胞示有很强 的
细胞凋亡诱导活性和杀伤作用 , 但研究仅限于小 鼠
细胞方面 ,进一步的药理活性研究特别是有关该化
合物抗人癌细胞方面的活性研究 目前未见更多文献
报道 。 在我们的系列研究中 , 发现吉九里香碱能够
显著抑制人大肠癌 H C T 一 巧 细胞的增殖 。 本研究
的目的在于探讨中药单体吉九里香碱是否通过诱导
H C T 一 巧 细胞凋亡 而发挥其抑制肿瘤细胞增殖的
作用 。〕
1 材料与方法
1
.
1 试剂及仪器
R P M I 一 16 4 0 培养基 ( G i b e o ) ;无支原体胎牛血
清 ( Hcy lon e ) ; 琼脂糖 ( 日本和 光制药工业株式会
社 ) ; 四甲基偶氮哇盐 ( 3 一 [ 4 , 5 一 d im e t h y l 一 2 一 th ia -
z o ly l ]
一 2 , 5 一 d i P h e n y l 一 t e t r a z o l i u m b or m id e , M竹 ) 、
H o e e h s * 3 3 2 5 8
、 蛋白酶 K 、 R N A 酶 、碘化丙陡 ( P or p id -
i u m i o d id e
,
P l )
、 嗅化 乙陡 ( e t h i d i u m b r o m id e , E B ) 、 十
二烷基磺酸钠 ( S D S ) 、 乙二胺四乙酸 ( E DT A ) 、 罗丹
明 12 3 ( R h o d a m i n e l 2 3 , Rh l 2 3 ) (美国 S i g m a ) ; A n -
ne ix n v 一 FI T c (膜联蛋白 v 一 异硫氰酸荧光素 )检
测试齐lj盒 (美国 B D B i o s e i e n e e s ) ; T r i s 一 盐酸 ( rT i s -
H e l
, 美国 B l o 一 R A D L a b o r a to r i e s ) :青霉素 、 链霉素
(华北制药有限责任公司 ) ;氯化钠 ( N aC I ) (北京化
工厂 ) 。
s邵 C T R A M A x 型 p l u s 酶标仪 (美国 M o le e u la r
D e v i e e s C。
.
)
、 日立 H 一 6 0 0 一 4 型透射电镜 、 E P IC S
X I
J 型 四色 流式细胞仪 ( 美国 C O U LT E R ) 、 C o u l te r
M u l t i s i
z e r l 型颗粒记数仪 (美国 C O U LT E R ) 、 E P H -
6 型电泳凝胶 自动成像系统 (美国 C d e 一 hP a mr er
nI S
.
c 。
.
)
、 宝丽莱自动成像系统 。
吉九里香碱 :本实验室 自制 , 质量分数 ) 9 % ,
现用现配 。
1
.
2 细胞培养 人大肠癌 H C T 一 巧 细胞 ( 日本引
进 )在 5% C O 。 、 37 ℃ 的条件下生长于含有 10 % 的
胎牛血清的 R P M I 一 1 6 4 0 培养基中 , 取对数生长期
细胞用于实验 。
1
.
3 M竹 法检测对 H C T 一 巧 细胞增殖抑制的作
用川 取对数生长期 H c T 一 巧 细胞按 2 x 10 , 个 ·
m L
一 ` 的密度接种到 9 6 孔板中 , 37 ℃ 培养 24 h 后加
人吉九 里香碱 , 使其终浓度分别 为 3 . 12 5 , 6 . 25 ,
12
.
5
,
25
,
50 林m ol
·
L
一 ’ ,每个浓度组各设 3 个平行
孔 。 与吉九里香碱作用 6 , 1 2 , 2 4 , 3 6 h 时分别加人 5
m g
·
m L
一 `
M竹 液 , 3 7 ℃培养 4 h 后 Z 0 0 0 r · m i n 一 ’ 、
4 ℃ 下离心 5 m i n ,弃上清后每孔加入 10 0 林L D M S O
溶解 ,混匀后置于酶标仪于 570 n m 波长处测定各孔
的吸收度 ( A )值 。 按如下公式计算细胞增殖抑制率
( I R ) [ IR ( % )
=
( l
一 A处理组A/ 对照组 ) x l o o% 」, 实验
重复 3 次 。
1
.
4 细胞超微结构观察 透射电镜标本制备 : 取对
数生长期的细胞 ,按 2 x lo ,个 · m L 一 ’ 的密度将细胞
接种于 6 孔板 。 收集 50 林m ol · L 一 ’吉九里香碱作用
2 4 h 的 HC T 一 巧 细胞 , 用 6 % 戊二醛溶液 (用 0 . 1
m ol
·
L
一 ’ p H 7
.
4 磷酸盐缓冲液配制 ) 固定细胞 2
h
, 用 l % 饿酸固定 3 0 m i n 后 ,脱水 , E p o n s l Z 环氧树
脂包埋 ,超薄切片 ,醋酸铀 、 柠檬酸铅双重染色 , 日立
H 一 6 0 0 一 4 型透射电镜下观察并拍照 , 照 相 ( x
3 0 0 0 )
。
1
.
5 库尔特颗粒粒度分析细胞体积大小变化 L’ 了
取对数生长期的 H c T 一 巧 细胞 , 按 2 x l护 个 ·
m L
一 `的密度将细胞接种于 12 孔板 。 50 协m ol · L 一 ’
吉九里香碱作用 6 , 一2 , 2 4 h 后 , 7 0 0 r · m i n 一 ’ , 4 ℃
离心收集细胞 ,用 PB S 清洗 1 次 。 各组细胞分别用
生理盐水稀释相同的倍数 ,用 e o u l t e r M u l ti s i z e r l 检
测细胞体积在 10 ~ 20 林m 和 2 一 8 林m 范围内的大
小分布 ,采用虹吸体积控制模式 ,保证每次检测体积
为 50 0 林L 。 以生理盐水为背景 , 同时设阴性对照 ,
重复 3 次实验 。
1
.
6 DN A 琼脂糖凝胶电泳检测 [ ’ j
取对数生长期的 H c T 一 巧 细胞按 2 x or ” 个 ·
m L
一 ’密度接种于 6 孔板 。 取 6 , 2 5 , 12 . 5 , 2 5 , 5 0 , 10 0
林m ol · L 一 ’ 的吉九里香碱分别作用细胞 24 h 或 50
林m ol · L 一 `吉九里香碱作用 6 , 12 , 24 h 后 , 离心收集
细胞 , PB S 清洗 l 次 。 加人细胞裂解液 ( 10 0 m m o l ·
L
一 ’
T r i s 一 H C I ( p H 5
.
5 )
,
5 m m o l
·
L
一 ` E D以 , 0 . 2
m o l
·
L
一 ’
N a C I
,
0
.
2 % s D s 含终浓度为 0 . 2 m g ·
m L
一 ’ 的蛋白酶 K ) , 37 ℃静置过夜 。
次日 4 ℃ 、 12 0 0 0 : · m i n 一 ’ 离心 15 m in 取沉淀
即 DN A ,加人适量 T E 缓冲液 ( 10 m m o l · L 一 ’ T r i S -
药物分析杂志 h C in J Phr a m An al 0 0 8 2, 2 8 ( 2 )
H e l 缓冲液 ( p H 5 . 0 ) , 10 m m o l · L 一 ’ E D T A )溶解
后 , 加人 1 m g · m L 一 ’ 的 R N as e A 使终浓度达 20 0 林g
·
m L
一 ` ,
37 ℃ 静置 Z h ,加人适量 D NA 加样缓冲液 ,
琼脂糖凝胶 电泳 ,嗅化乙 咙染色 ,紫外透射反射仪下
检测 ,宝丽莱自动成像系统拍照 。
1
.
7 A n n ex in V 一 FI T C 检测磷脂酞丝氨酸 ( P S ) 外
翻 取对数生长期的 H C T 一 巧 细胞 , 按 2 x 10 , 个
·
m L
一 ’ 密度接种 于 12 孔 板 , 37 ℃ 培养过夜 。 50
卜m d · L 一 ’ 的吉九里香碱作用细胞 6 , 12 , 24 h 后 ,胰
酶消化 ,再用 PB S 洗涤 ,离心收集细胞 , 调整待测细
胞浓度 1 x l0 6 重悬于 10 协 L l x 结合缓冲液中 , 加
人 5 卜L A im ex in V 一 F IT C 和 5 时 PI , 轻轻混匀 ,避
光室温反应 巧 m in 后 , 加人 4 0 林 L l x 结合缓冲
液 ,立即上流式细胞仪检测荧光强度 。
1
.
8 R h 12 3 检测线粒体跨膜电位 ( △小m ) 取对数
生长期的 H c T 一 15 细胞按 2 x 10 , 个 · , n L 一 ’密度接
种于 12 孔板 , 37 ℃ 培养过夜 。 50 协m ol · L 一 ’ 的吉
九里香碱作用细胞 6 , 12 , 2 4 h 后 ,加人 R h 12 3 (终浓
度为 0 . 5 林m ol · L 一 ’ ) , 37 ℃ 温育 30 o in ,胰酶完全
消化 ,使细胞充分分散成单个细胞 , 同时设空 白对照
组 ;离心收集药物处理过 的细胞 , P B S 洗 3 次 , 重悬
细胞并调整成 1 x 10 “ 个细胞 ;经尼龙网过滤后 ,用
流式细胞仪测定细胞内 R h 123 荧光 强度 ( 入。 x = 505
n m ; A
e m = 5 3 4 n m )
。
1
.
9 统计学方法 数据 以均数 士 标准差 (x 士 、 ) 表
示 ,并应用 SA S 统计软件进行统计学处理 ,其中对
两组实验均数比较用 ` 检验 , 多个实验组与对照组
均数比较用 A N OV A 一 D u n n e t’ 5 t e s t 检验 。
2 结果
2
.
1 MT 测定结果 由图 1 可知 , 指数生长期的
H C T 一 巧 细胞经不同浓度的吉九里香碱处理后 , 细
胞增殖抑制率 ( IR )随着药物浓度的增加而增加 , 呈
剂量依赖关系 ;随着作用时间的延 长 , IR 也呈 现时
间依赖关系 。 但从 6 . 25 协m ol · L 一 ’ 浓度开始 , 作用
H C T 一 巧 细胞 2 4 h 所产生 的增殖抑制程度明显比
3 6 h 的增殖抑制程度要高 。 与空 白对照组相 比 ,
6
.
2 5
,
12
,
5
,
2 5
,
5 0 林m o l · L 一 ’ 4 个浓度作用细胞 2 4 h
与 3 6 h 均具有统计学意义 ( ` ’ 尸 < 0 . 01 , “ ` 尸 <
0
.
0 0 1 )
。
2
.
2 透射电子显微镜观察凋亡细胞超微结构特
征 4[, , · 由电镜照片可以看出 , 对照组 H c T 一 巧 , 细
胞核形态正常 ,核 内异染色质未发生 固缩现象 ,核仁
清楚 ,细胞外布满丝状微绒毛 ;细胞浆中原生质着色
均匀 ,表明细胞未发生凋亡 。 50 卜m ol · L 一 ’ 吉九里
图 l 不同浓度吉九里香碱对 HC T 一 巧 细胞作用不同时间的增殖抑
制影响
F ig 1 In h i l
,
i一。 ,卿 e fe o t s o f v a r i o u s 。 。 ) n e e n t r a t i (, n s o f g i ir n i n l b i n e 0 11 t h。
I一or l i介 la ` 10 11 o f H C ’ r 一 15 e e l s a [ v a r i o u s t im e s
与对照相 比 ( 〔 o , , I P a er d w i一h e o n t r`、l ) * ` p < 0 . 0 1 , ` “ ’ p < 0 . 00 1
( D u n n
e t
’ s 一。 、 一) ( n = 3 )
香碱处理上述细胞 24 h 后 , 可见核仁及微绒毛 消
失 ;细胞核内的异染色质发生固缩 、边集 ;核仁消失 ;
细胞浆中有空泡 ;原生质着色不均匀 ;可见凋亡细胞
表面出泡 ,最终脱落形成膜包被 的凋亡小体 。 结果
与倒置显微镜和荧光显微镜下观察相似 (此处未列
数据 ) ,从细胞核形态学角度证明了吉九里香碱具
有诱导肿瘤细胞凋亡的活性 。 见图 2 。
图 2 5 0 卜m ol · L 一 ’吉九里香碱处理 HCI ’ 一 巧 细胞 24 h 透射电镜
下超微结构观察 (放大倍数 : x 3 0 0 0)
F jg 2 o b
s e ,丫 a 之ion of H CT 一 15 e e ]1 u l atr
s加 e t u想 u n d已 *m月 s m i s s i o n 。 -
l e o t or n m i e or , e一) p e aft
e r [er a te d w i t h 5 0 卜m o l · L 一 1 g i r i n im bin e fo r 2 4 h
( x 3 00 0 )
A
. 对照 ( 。 o n * or l ) B . 5 0 协n l o l · L 一 `吉九里香碱处理 HCT 一 15 细胞
2 4 h (救 e r t r e a tm e n t o f 5 0 协 n l o l · L 一 ’ g i r i n i汕 i n e f( , r 2 4 生1 )
2
·
3 C o u l te r M u l t i s i z e r l 细胞体积大小分布的测定
结果 50 协m ol · L 一 ’ 吉九里香碱分别处理 Hc T 一 巧
药物分析杂志 C h i , 1 J p h a r m A n d 200 8 , 2 5 ( 2 )
细胞 6 , 12 , 2 4 h 时 , 直径 10 一 2 0 卜m 之间的细胞 (与
未加药处理 H C T 一 巧 细胞大小相当的细胞 )逐渐减
少 , 2 4 h 时正常大小的细胞占总细胞数的百分比为
7
.
07 %
, 与空白对照组 84 . 48 % 相 比 ,差异有统计学
意义 ( “ ` 尸 < 0 . 001 ) ,见图 3 ; 另一方面随作用时间
的延长 ,小于 8 林m 的细胞碎片 (凋亡小体 ) 逐渐增
多 , 2 4 h 时凋亡小体形成数占总细胞数的百分比为
91
.
8 7 %
, 与空 白对照组 15 . 48 % 相比 , 差异有统计
学意义 ( “ ` 尸 < 0 . 0 01 ) (见图 4 ) , 结果与 M竹 筛选
及显微镜下观察相符合 。
图 4 吉九里香碱作用 HC T 一 巧 细胞不同时间对凋亡细胞体积大小
分布的影响
F 19 4 E fe
( t s o f ig r in im b i n e o n a P o P* o t i e e e l l v o l u m
e s i z e d i s itr l
) u l i
o n i n
H CT 一 15 e e ll s a l[ e r t er a t e d fo r d ife er
n r li m e p e ir o d s
与刘照相比 ( e o m p aer d w i th c o 。 [or l ) 中 中 尸 < 0 . o x , 中 , . 尸 < 0 . 0 0 1 ( ,
t e s l ) ( n = 3 ) ;时 I旬 ( t im e s ) : 6 , 12 , 2 4 h
图 3 吉九里香碱处理 H C T 一 15 细胞 不同时间对一 正常细胞体积大小
分布的影响
F ig 3 E价 e 、s ` ) f g i r i n im l )i n e `、 n `川 r m以 吸, e l l v o l u 百1飞e s i z e d i s仕 ib u t又。一、 i n
HC T 一 15 (二e l l 5 叭 e l 11七 a 一e 一J l( ” t! i价 r e n l l i ll ze Pe r i o d s
与对照相比 ( 、 . ) t , l p a r e d w i [ h e o n rl o l ) ’ 率 p < 0 . 0 1 , ’ ` ’ p < 0 . 0 0 1
t 检验 ( 2 t e s t ) ( n = 3 )
2
.
4 DN A 琼脂糖凝胶电泳结果 50 林m al · L 一 ’ 吉
九里香碱处理 H CT 一巧 细胞 6 h 后 , 即可检测到细
胞发生凋亡时由于 D N A 有规律降解而形成的梯形
条带 ,且随着药物作用时间的延长所形成的 D NA 梯
形条带越亮 ,表明细胞凋亡的程度越大 。 另外 ,细胞
经 6 . 2 5 , 12 . 5 , 2 5 , 5 0 , 1 0 0 林m o l · L 一 ` 的吉九里香碱
处理 24 h 后 , 50 , 10 卜m ol · L 一 , 的吉九里香碱显著
将 D NA 降解成 180 一 20 0 b p 的片段 。 而阴性对照
组 DN A 未发生降解 ,在凝胶上表现为一条均匀弥散
的总 DN A 条带 。 见图 5 。
图 5 D N A 琼脂糖凝胶电泳分析吉九里香碱对 HC r 一 巧 细胞凋亡的影响
F ig 5 A p
o p 一0 5 15 一 i n d u e i n g e价 e r s o f g i ir n i t飞ab i l l e o n HC 『r 一 15 e e l l s b y D叫A a g a l o s e 罗1 el e e otr p h o r e s i s a n al y s i s
2
.
S A n n e x i n V 一 F IT C 检测磷脂酞丝氨酸 ( PS )外
翻结果
50 林m ol
·
L
一 ’ 的吉九里香碱处理 H C T 一 15 细
胞 6 h 时 ,细胞 即发生部分凋亡 ( 15 . 34 % ) , 主要 以
早期凋亡为主 ;随着作用时间的延长 , 吉九里香碱所
致凋亡百分率呈上升趋势 , 到 24 h 时 , 细胞主要 以
凋亡早期和晚期 2 种形式存在 ( 39 . 37 % ) 。 见图 6 。
本实验用此方法进一步从生化学角度证实了吉
九里香碱诱发 H C T 一 巧 细胞凋亡的效应 ,且形成的
凋亡数与凋亡小体的生成率相符合 。 以上所有结果
均证明吉九里香碱通过诱发细胞凋亡而发挥抑制肿
瘤细胞增殖的作用 。
2
.
6 R h 123 检测线粒体跨膜电位 ( △中m )结果 结
果如图 7 所示 ,横坐标代表荧光强度 ,纵坐标代表细
胞数 。 从图上可以看出 , 当 50 卜m ol · L 一 ’ 吉九里香
碱分别处理 H C T 一 巧 细胞 6 , 12 , 24 h 时 ,弱荧光部
分细胞含量逐渐增高 , 表现为 △中m 表征峰形明显
向前发生 了位移 ,且在 24 h 时位移达到最大 。 这个
一 1 80一 药物分析杂志 C hi n J P ha rm A na l 2 0 0 8, 28 ( 2 )
图 6 流式细胞仪分析 A朋ex in 一 V 与 HC T 一 15 细胞膜 P S 的结合
Fi g 6 A n n
e 石 n 一 V b i n d i n g t o [ h e m e m l〕ra n e p h o s ph o l i f ) id p } lo s p h a r id y l -
s e ir n e i
n l h
e
H C T 一 15 e e l s b y fl o w e yt o m e t ry
A
. 对照 ( 〔、 ,n [or l ) B , 6 h C . 12 卜、 D . 2 4 h
结果说明 ,吉九里香碱作用肿瘤细胞后 ,导致肿瘤细
胞的线粒体膜电位下降 , 提示我们吉九里香碱可能
通过作用于肿瘤细胞的线粒体而促发细胞凋亡 。
图 7 流式细胞仪分析吉九里香碱对 HC T 一 巧 细胞线粒体膜 电
位丧失的影响
F ig 7 E fle
e t s of 巨r i n im b i n e o n t h e 10 5 5 o f m i Lo e h o n d ir al m e lnb r a n e
p o te n it al ( △中m ) i n HCT 一 15 e e l l s b y fl o w e y t o m e t叮
A
. 对照 ( e o n t o l ) B . 6 h C . 12 h D . 2 4 h
3 讨论
黑果黄皮 ( C l a u s e n a d u n n i a n a L e v l . ) 系芸香科
(尺 u ta e e a 。 )黄皮属 ( C la u s e n a )植物 。 黄皮属传统中
草药 , 性味苦 、 辛 ,有解表散热 、顺气化痰之功效 , 对
流感 、 流脑 、痢疾等有一定的防治作用 。 另据我们初
步了解 ,黑果黄皮在我国的局部地区也作为民间药
物用于治疗癌症 。 有关黄皮属植物化学成分的研究
报道很多 L’ · 6〕 ,其主要化学成分为挥发油 、 生物碱和
香豆素类化合物 ,其中生物碱类成分是其药理活性
的主要物质基础之一 。 e . e h a i e h a n t i p四 t h [ 7 1和 T . 5 .
w u L
6」等人研究发现咔哩类化合物对 9 K B 、 K B MRI 、
A5 4 9
、
H T 一 2 9 、 H C T 一 8 、 R PM I 一 7 9 5 1 、 咫 8 8 及
T E 67 1 等人和动物细胞均表现出较强 的细胞毒活
性 。
分离自黑果黄皮的吉九里香碱 , 经文献检索也
不是新化合物 , 在 19 7 0 年就由 J o s h i B s 乙8了等人分离
得到 ,但无相关活性研究的报道 。 直到 19 9 9 年 , 马
来西 亚大学 的 K a r t i n i A h m a d 从 M u r八妙。 凡o e n ig i i
(尺 u ta c e a 。 , c u卿 一e a f )的茎叶和根中也分离出这个化
合物 ,并对它做了初步的活性研究 。 发现吉九里香
碱不能抑制 C E M 一 S 细胞的生长 ,却可以完全抑制
E p s t e i n B a r v iur
s
( E B V )的肿瘤促进活性 ,但对吉九
里香碱进一步的药理活性研究特别是有关该化合物
抗癌活性的研究目前未见更多文献报道 。 在我们的
系列研究中 ,吉九里香碱能够抑制多种人肿瘤细胞
的增殖 (数据未列 ) ,其中吉九里香碱可显著抑制人
大肠癌 H C T 一 巧 细胞增殖 , 因此在本研究中主要通
过 Hc T 一 巧 细胞来探讨吉九里香碱抗肿瘤细胞增
殖的作用机理 。
在本研究中 ,我们首先应用 M竹 法检测到吉九
里香碱明显以浓度和时间依赖方式抑制 H C T 一 巧
细胞的增殖 , 同时通过透射电子显微镜观察 ,从形态
学上确证了吉九里香碱能够诱发 H C T 一 巧 细胞凋
亡 ;进一步利用 C o u l t e : M u l ti s i z e r l 颗粒粒度分析
仪 [ ’ 〕 ,检测了吉九里香碱处理细胞不同时间后细胞
体积粒度大小分布的变化 。 本实验中 ,经吉九里香
碱处理不同时间后的细胞 ,随作用时间的增加 ,形成
的凋亡小体在 8 林m 范围内的分布明显增多 , 我们
用此区间小颗粒占总体颗粒数的比值来考察凋亡小
体的生成率 ,结果表明这种方法有效地检测 出了细
胞凋亡时体积大小分布的情况 ; 同时结合不同时间
段产生的 D N A 梯带 ,我们发现二者在各自的时间点
上能够较好地符合 , 即随着时间的延长 ,所产生的凋
亡小体越来越多 , 而所产生的 DN A 梯带也随着时间
药物分析杂志 C h in J p h a r m A n a l 2 00 8 , 2 8 ( 2 )
的延长 ,条带越来越亮 , 显示出凋亡程度越来越大 。
另外 , 当细胞凋亡时 , 由于细胞膜两侧不对称性
的丧失 ,在正常情况下存在于质膜内侧的磷脂酞丝
氨酸外翻至膜外侧 ,随作用时间的延长 ,存在不同阶
段的凋亡形式 。 本实验用此方法进一步从生化学角
度证实 了吉九里香碱诱发 H C T 一 巧 细胞凋亡的效
应 。 结果完全与显微镜下观察 、 凋亡小体及 D N A
l a d d e : 的形成相一致 。
以上所有实验从不同角度均证明吉九里香碱确
实通过诱导 Hc T 一 巧 细胞发 生凋亡而 发挥抑制肿
瘤细胞增殖 的作用 。
鉴于近年来在细胞凋亡机制研究中对线粒体重
要性的认识 ,我们又进一步在本文 中对线粒体△中m
的变化进行了初步研究 。 大量实验证实许多因素诱
导的细胞凋亡都存在线粒体功能紊乱 , 并认为它的
出现是导致 细胞不可逆死亡的关键环 节 〔9 { 。 作为
哺乳动物细胞合成 A T P 的主要场所 , 其三竣酸循环
生成 的 H + 通 过跨膜 扩散形成线粒体跨膜 电位
( △中m ) ,线粒体内膜上的 A T P 合成酶利用此跨膜
电势差合成 A T P ,再通过线粒体内膜上的 A D P/ A T P
载体将 A T P 转人胞质中 , 参与细胞的各种 需 能活
动 。 线粒体对微环境的变化十分敏感 ,在细胞凋亡
发生早期 ,线粒体膜通透性改变 , 盯 孔开放 , 使得
△中m 下降 , A T P 合成减少 , 影响细胞正常的需能活
动 。 而电位敏感性荧光染料罗丹明 12 3 ,可 对活细
胞线粒体选择性着色 ,其激发光波长为 5 05 n m , 发
射光波长为 5 3 4 n m 。 带阳离子的 R 123 染料通过借
助△中m 进人到线粒体内而将细胞着色 。 当细胞发
生凋亡时 , △中m 下降 , 进人到线粒体内的 1R 23 荧
光染料相应减少 , 故而检测到的荧光强度比未发生
凋亡的正常细胞要弱 。 从检测图上可 以观察到 , 发
生凋亡的细胞的△中m 表征峰形相对于正常表征峰
形向前发生 了位移。 从流式细胞仪观察到 , 经 50
林m ol · L 一 ’吉九里香碱处理 H C T 一 15 细胞不同时间
后 , △中m 表征峰形 明显向前发生了位移 ,且在 24 h
时位移达到最大 , 说明 H C T 一 巧 细胞线粒体△中m
确实发生了下降 ,提示吉九里香碱可能通过作用线
粒体来发挥诱发细胞凋亡作用 。
综上所述 , 本实验在肯定吉九里香碱能抑制
H C T 一 15 细胞生长的同时 , 用多种方法证实吉九里
香碱作用后的 H C T 一 巧 细胞有典型的凋亡发生 , 说
明吉九里香碱通过诱导 H C T 一 巧 细胞凋亡来抑制
H C T 一 15 细胞增殖 ,并可能通过作用线粒体来发挥
其诱发细胞凋亡的作用 。
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z o l e al k al o id s ofr m ht
e or o t b a
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d i a n a
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J
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8 J
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ko e n im bid i n e a n d m u ar
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9 S
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Ch an g e s i n m i t
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r a n e P o t e n t ial du ir n g s t au or sp o o ir n e 一 i n du e e d a p o p t o s i s i n J u r
-
k a t
e e l l
s
.
F百召S 及 t t , 2 00 0 , 4 7 5 : 2 6 7
(本文于 2 0 07 年 3 月 7 日收到 )