全 文 ：新疆白鲜愈伤组织生长动态研究
樊宪伟1 , 张虎平2 , 敖清艳3 , 张霞4　(1.广西大学生命科学与技术学院 , 广西亚热带生物资源保护利用重点实验室 , 广西南宁
530005;2.石河子大学农学院园艺系 ,新疆石河子 832003;3.成都市农林科学院 ,四川成都 610072;4.石河子大学生命科学院 ,新疆石河子 832003)
摘要　[目的]研究了新疆白鲜愈伤组织诱导及其生长动态 ,为从中提取药物活性成分奠定基础 ,同时是解决资源贫乏的一条新途径。
[方法]以幼叶、真叶 、下胚轴为外植体 ,研究不同培养基、激素配比、碳源对新疆白鲜出愈率的影响以及愈伤组织生长动态变化。[结果]
幼叶在激素浓度为 6-BA 2.0 mg/L+2 , 4-D 0.5 mg/L的MS和B5培养基出愈率分别为 83.0%和 93.3%,且在低盐B5培养基上诱导率较
高;不同外植体幼导率为子叶>下胚轴>真叶 ,子叶的诱导较快 ,诱导率较高;蔗糖作为碳源时效果较好 ,诱导率为 100%;愈伤组织生长
的倍增曲线揭示继代培养时 ,第 5～ 17天为快速增长期 ,且在暗处生长较好 ,继代周期 20 d较为合适;不同激素浓度对愈伤组织的质量
亦有较大的影响。[结论] y1、y2激素组合诱导出的愈伤组织虽较致密 ,但在体胚发生中均未达到理想效果 ,也未能进一步分化。将其转
入含有激动素KT 3.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L的MS培养基中 ,发现愈伤组织在光下变黄绿色 ,生长也较紧凑 ,可诱导出胚状体。
关键词　新疆白鲜;愈伤组织;生长动态
中图分类号　S722.3+7　　文献标识码　A　　文章编号　0517-6611(2008)36-15863-04
Callus Induction and Growth Dynamic of Dictamnus angustifoliu
FAN Xian-wei et al　(Guangxi Key Laboratory of Subtropical Bioresources Conservation and Utilization , College of Life Science and Technology , Guangxi
University ,Nanning ,Guangxi 530005)
Abstract　[ Objective] Callus induction and the growth dynamic of Dictamnus angustifoliu had been studied ,which provided a basis to extract active con-
stituents , and a new way to deal with natural resources shortage.[Methods] Taking euphylla, cotyledon and hypocotyledonary axis as explants , the influences
on the callus induction rate and the growth dynamic of Dictamnus angustifoliu in different medium , hormonematching and carbon sources were investigat-
ed.[ Results] The induction ratewere 83.0% and 93.3% in MS and B5 mediums with 6-BA 2.0 mg/L +2 , 4-D 0.5 mg/L.And the induction ratewas
higher in B5mediumwith low salt.The induction rates of different explants were as follows:cotyledon>hypocotyledonary axis>euphylls.Cotyledon induct-
ed faster and got higher induction rate.Sugar was the best carbon source , with the induction rate of 100%.The study of the multiplication curve of the
growth of callus revealed that from the fifth to the seventeenth day was the fast epacme in secondary culture.It grew better in darkness , and the subculture
cycle was 20 days.Different hormone concentrations had great influences on the quality of callus.[ Conclusion] The grouping of hormones y1 and y2 induct-
ed more compact calluses , but hadn t got desired results and couldn t differentiate further.Transferred to MS medium with KT 3.0 mg/L +NAA 0.1
mg/L, callus turned flavovirens in light , grew compactly and embryoids could be inducted.
Key words　Dictamnus angustifoliu;Callus;Growth dynamic
　　愈伤组织是植物细胞在离体条件下增殖分化的产物。
细胞的全能性决定愈伤组织中含有相当于植物体本身所含
有的一些成分。早期的许多研究表明 ,从愈伤组织里提取所
需的药用成分是可行的[ 1-4] 。最近一些研究还报道了从愈
伤组织中提取的活性成分的含量高于天然药用植物中活性
成分的含量[ 5-6] 。新疆白鲜作为一种传统的民族中药材 ,含
有一些生物碱类 、黄酮类 ,尤其白鲜碱和 酮在临床上都表
现出较强的抗肿瘤作用 ,有较高的医疗价值。随着对新疆白
鲜化学成分及药理作用认识的深入 ,资源需求必将不断增
加。按照传统资源的利用模式 ,势必像人类采挖甘草 、麻黄
那样给本就十分脆弱的生态环境造成严重的破坏 。因此 ,研
究新疆白鲜愈伤组织生长的动态 ,可为将来提取药物活性成
分奠定基础 ,也是解决资源贫乏的一条新途径。
1　材料与方法
1.1　不同基本培养基对愈伤组织的诱导　取新疆白鲜的无
菌苗幼叶 ,接入附加有不同的激素浓度基本培养基中 ,研究
诱导愈伤组织的难易情况及愈伤组织的质量。
1.2　不同外植体对愈伤组织的诱导　取无菌株的子叶 、真
叶等组织器官切成约 0.5 cm2 小块 ,下胚轴长约 0.5 cm ,将其
作为外植体 ,接入不同激素组合的MS培养基中 ,记录愈伤组
织生长分化情况 ,获得一系列不同分化程度的愈伤组织及培
养基配方。
作者简介　樊宪伟(1978-),男 ,山西晋城人 ,博士,从事植物组织培养 、
作物耐旱的生理-分子机制方面的研究。
收稿日期　2008-10-23
1.3　不同碳源对愈伤组织的诱导　在 B5 培养基的基础上
添加 6-BA 2.0mg/L 、2 ,4-D 0.5mg/L ,然后分别添加 0、10、20 、
30、40、50 g/L蔗糖 、葡萄糖 ,研究不同碳源对愈伤组织出愈率
的影响。
1.4　愈伤组织的继代培养与生长速度的测定　愈伤组织继
代培养采用 y1(MS +KT 3.0 mg/L+NAA 0.3mg/L)和y2(MS
+2 ,4-D 1.0 mg/L+6-BA 0.5 mg/L)2种激素组合 ,分别于光
下和暗处培养。自接入始 ,记录其生长动态 。主要指标为接
入时愈伤组织块的平均直径大小[ 6] ,记录所接入组织块在瓶
中的位置。
　　首先 ,称量接入的愈伤组织质量 ,然后将其放到光 、暗 2
种条件下培养 ,培养 7 、14、21、28 d后分别取出 4瓶逐个称重 。
在把它们置入称量皿之前 ,应先将愈伤组织样本从培养基转
到铺有滤纸的培养皿内 ,去掉可能粘着在愈伤组织底部的少
量琼脂培养基。在每次称重之后 ,要擦净称量皿的表面以去
掉残留水分。用镊子取放称量皿 ,因为手指上的汗液会使质
量发生变化。比较培养 7 、14、21、28 d之后的鲜重增加值 ,并
作图研究鲜重增加值与时间的函数关系。
然后 ,把每块愈伤组织置于一个培养皿中 ,在 60 ℃下烘
干 12 h。在一个装有硅胶的干燥器中 ,将样本冷却到室温 ,
称量样本的质量 。把样本放回到烘箱中再烘干 4 h ,并重复
上述过程 ,至样本恒重为止。由以上称量值减去称量皿的质
量 ,即可得到样本干重 。据此可算出每次取材样本的平均干
重 ,并作图研究干重增加值与时间的函数关系。
安徽农业科学, Journal of Anhui Agri.Sci.2008, 36(36):15863-15866　　　　　　　　　　　　　　　　　责任编辑　刘月娟　责任校对　傅真治
图1　真叶诱导(MS)
Fig.1　The euphylla induction(MS)
图2　真叶诱导(B5)
Fig.2　The euphylla induction(B5)
2　结果与分析
2.1　基本培养基MS和B5诱导新疆白鲜幼叶出愈率的变化
　将无菌苗的幼叶在无菌条件下用剪刀剪成约 0.5 cm2 大小
的块状叶 ,接入不同激素配比的培养基中。试验采用的MS
是一种高盐成分培养基 ,含有较高浓度的钾盐 、铵盐 、硝酸
盐 ,且微量元素齐全 ,养分比例较合适。而B5 培养基除含有
较高浓度的钾盐外 ,还含有较低浓度的铵态氮和较高浓度的
盐酸硫胺素[ 7] 。从表 1可以看出 ,利用真叶诱导愈伤组织 ,
不同配比浓度 6-BA和 2 ,4-D均能诱导出愈伤组织 ,并且同种
激素组合B5 的诱导率总高于MS的诱导率(图 1、2),而两者
表现出的变化趋势一致。但在缺少 6-BA的情况下 ,在生长
素的作用下 ,叶片膨大 、皱缩 ,无法启动愈伤组织的生长。同
时 , 6-BA与 2 ,4-D的比例为 2∶1或 4∶1时 ,在 B5 培养基上诱
导率最高 ,分别达到 88.2%和 93.3%,说明 2种激素较适合
启动叶片愈伤组织的诱导 。而在MS培养基上的结果也表明
两者比例在 4∶1时诱导率最高。另外 ,不同激素浓度对愈伤
组织的质量有较大的影响 。这 2种激素组合在诱导体细胞
胚时效果不理想。
2.2　KT和NAA对不同外植体出愈率的影响　以MS为基
本培养基 ,采用作用较缓的激素KT 、NAA ,研究激素对真叶 、
子叶 、下胚轴诱导愈伤组织的影响 。由表 2 可知 ,在只有
NAA没有KT时 ,真叶 、子叶 、下胚轴均不能诱导出愈伤组织 。
对于真叶 ,随着细胞分裂素浓度的提高 ,愈伤组织的诱导率
也不断提高 ,且愈伤组织的量也不断增加;而其他2种外植
表1　不同基本培养基对愈伤组织诱导率的影响
Table 1　Effects of different basic media on the induction rate of calli
编号
No.
含量∥mg/ L Content
6-BA 2, 4-D
B5培养基 B5 medium
诱导率∥%
Induction rate
颜色
Color
愈伤组织质量
Callus quality
MS培养基 MS medium
诱导率∥%
Induction rate
颜色
Color
愈伤组织质量
Callus quality
1 0.5 　　0 0 0
2 1.0 0 0 0
3 2.0 0 0 0
4 0 0.5 0 0
5 0 1.0 0 0
6 0 1.5 0 0
7 0.5 0.5 47.1 白色 致密 34.2 白色 致密
8 0.5 1.0 47.1 乳白色 疏松 43.0 乳白色 致密
9 0.5 1.5 58.8 乳白色 疏松 55.0 乳白色 疏松
10 1.0 0.5 68.8 绿色 致密 63.3 绿色 致密
11 1.0 1.0 62.5 白色 疏松 40.2 淡黄色 致密
12 1.0 1.5 64.7 白色 较疏松 62.3 白色 较疏松
13 2.0 0.5 93.3 绿色 致密 83.0 绿色 较致密
14 2.0 1.0 88.2 绿色 致密 60.0 绿色 较致密
15 2.0 1.5 64.7 绿色 致密 53.3 绿色 较致密
体也表现出相似的规律。对于 3种外植体 ,KT 浓度 1 ～ 3
mg/L 、NAA浓度 0.1～ 0.3 mg/L时均可诱导出愈伤组织。当
KT和NAA组合时 ,子叶诱导率比真叶和下胚轴高 ,说明这 2
种激素组合较适合子叶的诱导。诱导子叶的最佳组合为 4
号和 10号培养基 ,诱导率分别达 81.3%和 87.5%;诱导真叶
的最佳组合为 7号培养基;诱导下胚轴的最佳培养基为 4号
培养基 ,诱导率达 75.0%。相比而言 ,在诱导愈伤组织的过
程中 ,子叶诱导较快。
2.3　不同碳源对愈伤组织的诱导作用　以幼叶作为外植
体 ,接种到附加 6-BA 2.0 mg/L+2 ,4-D 0.5 mg/L的B5培养基
上 ,碳源选用不同浓度的蔗糖 、葡萄糖 ,以研究不同碳源对愈
伤组织的诱导效应。从表 3可以看出 ,不同碳源对愈伤组织
的诱导效果存在着差异 ,蔗糖的诱导率比葡萄糖高。葡萄糖
的最适浓度是 30 g/L ,但愈伤组织诱导率仅为 85%;蔗糖的
最适合浓度范围为 30～ 40 g/L ,浓度在 30 g/L时愈伤组织的
诱导率最高可达 100%,但是在浓度 40 g/L的培养基上愈伤
15864 　　　　　　　　　　　　　安徽农业科学　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　2008年
组织生长旺盛。同时可以看出 ,葡萄糖浓度在 20～ 50 g/L的
范围内 ,随着浓度的提高 ,诱导率增高的幅度不大。这一点
与蔗糖不同 。
表 2　不同外植体对愈伤组织诱导率的影响
Table 2　Effects of different explants on the induction rate of calli
编号
No.
培养基
Medium
诱导率∥% Induction rate
子叶
Cotyledon
真叶
Euphylla
下胚轴
Hypocotyls
1 KT 0 mg/ L+NAA 0.1mg/ L 0 0 0
2 KT 1 mg/ L+NAA 0.1mg/ L 30.3 21.2 25.0
3 KT 2 mg/ L+NAA 0.1mg/ L 54.3 31.4 37.1
4 KT 3 mg/ L+NAA 0.1mg/ L 81.3 44.0 75.0
5 KT 1 mg/ L+NAA 0.2mg/ L 34.4 25.0 30.3
6 KT 2 mg/ L+NAA 0.2mg/ L 52.9 35.5 38.2
7 KT 3 mg/ L+NAA 0.2mg/ L 76.5 44.1 61.3
8 KT 1 mg/ L+NAA 0.3mg/ L 41.7 33.3 36.1
9 KT 2 mg/ L+NAA 0.3mg/ L 67.7 38.9 40.0
10 KT 3 mg/ L+NAA 0.3mg/ L 87.5 43.8 45.2
2.4　新疆白鲜愈伤组织倍增曲线　利用筛选出的培养基 ,
对新疆白鲜的愈伤组织进行繁殖 ,通过 3周时间的培养 ,使
愈伤组织的鲜重 、干重增加。从图 3可以看出 ,细胞干重的
倍增值在第 14天时与鲜重的倍增值基本一致 ,在第 21天时
超出鲜重倍增值 ,而在第 28天时下降。这说明细胞在第 7天
时已经启动 ,进入快速增长区 ,而在第 14天进入旺盛生长阶
段 ,在第 21天达到顶峰 ,随后生长缓和 ,逐渐下降。
表 3　不同碳源对愈伤组织生长的影响
Table 3　Effects of different carbon sources on the callus growth
碳源
Carbon
sources
浓度∥g/L
Concent-
ration
诱导率∥%
Induction rate
生长势
Growth vigor
颜色
Color
质量
Quality
蔗糖 　 0 　　0
Sucrose 10 75 ++ 黄绿色 致密干燥
20 80 +++ 黄绿色 致密干燥
30 100 +++ 黄绿色 疏松干燥
40 90 +++ 黄绿色 疏松湿润
50 75 ++ 白色 致密干燥
葡萄糖 0 0
Glucose 10 60 + 白绿 致密湿润
20 75 + 粉白 疏松湿润
30 85 +++ 粉白 疏松湿润
40 80 +++ 粉白 疏松湿润
50 80 +++ 粉白 疏松湿润
2.5　愈伤组织的继代培养　选用 2种组合培养基 ,分别在
光暗条件下继代培养 ,并观察愈伤组织的生长动态。研究表
明 ,在 y1 、y2培养基上生长的愈伤组织 ,虽然激素浓度 、光照
条件不一样 ,但表现出的趋势一致 ,都是在接入后的第 5天
进入快速生长阶段 ,而在第 5～ 17天属于迅速增长阶段。随
后愈伤组织逐渐呈现黄褐色 ,开始老化 ,在第 30天时愈伤组
织即失去分裂能力 ,褐化死亡。因此 ,建议新疆白鲜愈伤组
织继代以 20 d为一周期较为合适 ,即在接入后的第 20天 ,愈
伤组织处于迅速增长末期 ,及时进行继代 ,能够保持愈伤组
织的快速增殖。
2.6　光照 、黑暗条件对愈伤组织生长的影响　从生长趋势
来看 ,暗处生长的愈伤组织要比光下生长的快(图 4)。在 y2
培养基上生长的愈伤组织 ,从接入后的启动到进入迅速生长
阶段和最后的愈伤组织总量来看 ,在暗处生长的愈伤组织都
是较好的(图 5)。从愈伤组织的质量上看 ,愈伤组织生长较
疏松 、淡白色 ,无颗粒状成块的愈伤组织 。而在光下 ,生长速
度慢一些 ,愈伤组织为黄色 ,生长也较疏松(图 6)。在 y1培
养基上生长的愈伤组织在暗处也为白色 ,生长较疏松 ,但要
比在 y2培养基上的好一些。在光下生长 y1培养基上生长的
愈伤组织为黄色 ,较紧凑 ,成块状。另外 ,在暗处生长的愈伤
组织可以保持旺盛生长的时间更长一些 ,而在光下生长的愈
伤组织易老化 。
图3　新疆白鲜愈伤组织倍增曲线
Fig.3　Themultiplying curves of Dictamnus angustifotius call i
图 4　不同培养条件对愈伤组织生长量的影响
Fig.4　Effects of different culture conditions on the growth increment
of calli
图 5　愈伤组织继代(暗)
Fig.5　The callus subculture(in dark)
3　讨论
通过采用B5 培养基附加不同浓度激素对无菌苗幼叶的
诱导 ,单独使用 6-BA和 2 , 4-D均不能诱导出愈伤组织 ,而必
1586536卷36期　　　　　　　　　　　　　　　　樊宪伟等　新疆白鲜愈伤组织生长动态研究
图6　愈伤组织继代(光)
Fig.6　The callus subculture(under light)
图 7　胚状体Ⅰ
Fig.7　EmbryoidⅠ
图8　胚状体Ⅱ
Fig.8　EmbryoidⅡ
须二者结合使用才有效。据张自立报道 ,对于幼叶的诱导 ,
利用较低的还原态的氮离子 ,容易启动幼叶。MS培养基中
氧化态与还原态的比为 2∶1 ,而 B5培养基中比值为 12∶1。通
过2种培养基的对比试验 ,证明了这一结论 。在6-BA2.0
mg/L+2 ,4-D 0.5 mg/L时幼叶诱导率 93.3%,说明 2种激素
较适合启动叶片愈伤组织的诱导。在低盐 B5培养基上诱导
率最高。激素浓度的不同 ,对愈伤组织的质量也有较大的影
响。这 2种激素组合诱导出的愈伤组织虽然较致密但在体
胚发生中并没有达到理想效果。这是因为 2 , 4-D的存在抑
制了胚状体的形成和进一步的成熟。因此 ,将已诱导的愈伤
组织转接到含有KT 3.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L的MS培养基
中 ,发现愈伤组织在光下变黄绿色(图 7、8),生长较紧凑 ,再
培养 20 d左右 ,可诱导出胚状体 ,也能进一步分化出小芽 。
这将为进一步研究体细胞胚发生机理提供基础 ,也证明了芸
香科白鲜属植物通过体细胞胚建立再生植株的可行性。
不同的外植体对于激素的反应是不一样的。研究结果
表明 ,不同外植体幼导率大小顺序为子叶>下胚轴>真叶 。
这与其他植物的报道相一致。利用筛选出的培养基 ,对新疆
白鲜的愈伤组织进行快速繁殖。在 3周的培养过程中 ,能使
愈伤组织的鲜重 、干重增加。从接入始 3周的时间 ,愈伤组
织的鲜重倍增值达到 5.48 ,干重倍增 5.39 。这一结果将为大
量生产愈伤组织 ,并从中提取所需化学成分提供可靠的
依据 。
研究还发现 ,建立起的愈伤组织生长快 ,受光的影响较
小 ,且生长周期较短 ,20 d内能够增殖 5 ～ 7倍 ,达到旺盛生长
阶段 。结合药材本身的药用成分 ,对愈伤组织中所含的主要
药用成分进行有效的定性定量测定 ,为大规模商业化生产和
开发提供依据 ,最终起到保护资源 、保护生态的目的。
参考文献
[ 1] 陈露西 ,梁伟明,许欣.黄柏的组织培养[ J] .中草药, 1981, 12(6):36-
37.[ 2] 朱蔚华 ,朱兆仪.三种千金藤属药用植物愈伤组织的诱导与培养[ J] .
中草药 ,1983, 14(6):35-37.
[ 3] 丁葆祖 ,杨静仪,李晋川,等.黄连组织培养的研究[ J] .中草药, 1984, 15
(12):28-30.
[ 4] 惠月明 ,胡月红,吴跃平,等.穿心莲组织培养研究[ J] .中草药, 1987, 18
(8):31-33.
[ 5] 李玉峰 ,颜钫 ,唐琳,等.浓密贝母的培养条件及不同时期生物碱积累
的研究[ J] .中草药, 2002 ,33(5):458-459.
[ 6] 郭志刚 ,于金梅,刘瑞芝.培养条件对盐生肉苁蓉愈伤组织生长的影响
[ J] .清华大学学报:自然科学版 ,2002, 42(12):1598-1600.[ 7] 崔德才 ,徐培文.植物组织培养与工厂化育苗[M] .北京:化学工业出版
社 ,2003.
[ 8] JIANG Q , DONG L ,NING Z Y , et al.Establishment of somatic cell clones in
Thesium chinense Turcz and its in vitro rooting technique[ J] .Agricultural Sci-
ence &Technology , 2008 ,9(5):47-49 ,62.
[ 9] 张荣涛 ,曹宇 ,顾锋旗 ,等.不同培养方法对长春花愈伤组织生长及吲
哚生物碱积累的影响[ J] .北方园艺, 2005(1):65-66.
[ 10] LIU H M ,LINGHU K Y ,FANG X B.The study on induction and proliferation
of tube bulbs in Liliumbrownii[ J] .Agricultural Science &Technology ,2008, 9(1):18-20 ,53.
15866 　　　　　　　　　　　　　安徽农业科学　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　2008年